Chuẩn bị các dung dịch hiệu chuẩn trong ngày phân tích.

4.17 Cột ái lực miễn nhiễm

Cột ái lực miễn nhiễm phải chứa các kháng thể đối với ochratoxin A. Cột phải có khả năng chứa không nhỏ hơn 100 ng ochratoxin A và có độ thu hồi không nhỏ hơn 85 % khi sử dụng dung dịch rượu vang pha loãng có chứa 100 ng ochratoxin A.

5. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

5.1 Cân vi lượng, có thể cân chính xác đến 0,01 mg

5.2 Lọ thủy tinh, dung tích khoảng 4 ml, có nắp vặn được lót bằng polytetrafloetylen (PTFE), hoặc nắp vặn kín thích hợp khác.

Một số lọ nhất định có thể làm thất thoát ochratoxin A trong quá trình làm bay hơi. Để tránh điều này, có thể áp dụng silan hóa. Chuẩn bị các lọ bằng cách đổ đầy dung dịch silan và để yên trong 1 min. Sau đó tráng lọ hai lần bằng dung môi thích hợp (toluen, axeton hoặc hexan) rồi rửa bằng nước (hai lần) và để khô.

5.3 Bình định mức, dung tích 5 ml và 10 ml.

...

...

...

5.5 Bình chứa và các phụ kiện thích hợp với cột ái lực miễn nhiễm.

5.6 Bộ lọc sợi thủy tinh, cỡ lỗ 1,6 mm, (ví dụ: loại Whatman GF/A1) hoặc tương đương).

5.7 Bộ làm bay hơi dung môi.

5.8 Xyranh microlit đã hiệu chuẩn hoặc pipet microlit đã hiệu chuẩn.

5.9 Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao, gồm có:

5.9.1 Hệ thống bơm, van bơm dạng xyranh có vòng bơm 100 ml hoặc loại tương đương.

5.9.2 Bơm dùng cho HPLC, đẳng dòng, có thể duy trì được tốc độ dòng thể tích 1,0 ml/min.

5.9.3 Cột phân tích pha đảo, ví dụ như thép không gỉ (dài 150 mm, đường kính trong 4,6 mm) được nhồi bằng vật liệu pha đảo C18, cỡ hạt 5 mm, trước cột có cột bảo vệ pha đảo thích hợp hoặc bộ lọc bảo vệ (cỡ lỗ 0,5 mm). Có thể sử dụng cột có kích thước khác nếu cột đáp ứng được độ phân giải đường nền của pic ochratoxin A ra khỏi các pic khác.

5.9.4 Detector huỳnh quang, được trang bị cuvet dòng chảy và được cài đặt bước sóng kích thích ở 333 nm và bước sóng phát xạ ở 460 nm. Detector này phải phát hiện được ochratoxin A ở nồng độ nhỏ nhất là 0,02 ng.

...

...

...

5.10 Máy đo phổ UV, có các cuvet thạch anh thích hợp.

6. Cách tiến hành

6.1 Chuẩn bị mẫu

Khử khí rượu vang nổ và bia trước khi pha loãng. Rót 10 ml rượu vang (hoặc bia) vào bình nón dung tích 100 ml có thể đậy kín. Thêm 10 ml dung dịch pha loãng (4.9) và trộn kỹ. Lọc qua bộ lọc sợi thủy tinh (5.6) khi dung dịch vẩn đục hoặc có cặn rắn hình thành sau khi pha loãng.

Nếu gặp phải vấn đề này khi khử khí thì tiến hành siêu âm mẫu trong 1 h, mẫu đã được làm nguội trước 30 min ở + 4 ^oC để tránh tạo bọt nhanh.

6.2 Làm sạch cột ái lực miễn nhiễm

Chuẩn bị cột ái lực miễn nhiễm theo hướng dẫn của nhà cung cấp.

Nối cột ái lực miễn nhiễm (4.17) với ống chân không (5.4) và nối bình chứa (5.5) với cột ái lực miễn nhiễm. Cho 10 ml dung dịch đã pha loãng (tương đương 5 ml rượu vang hoặc bia) vào bể và cho đi qua cột ái lực miễn nhiễm ở tốc độ dòng khoảng 1 giọt trên giây. Không để cột chảy đến khô. Rửa cột bằng 5 ml dung dịch rửa (4.10) và sau đó rửa bằng 5 ml nước với tốc độ dòng từ 1 giọt đến 2 giọt trên giây. Cho không khí đi qua cột để làm khô cột. Tách cột ra khỏi ống chân không và đặt lên trên lọ (5.2).

6.3 Chuẩn bị dung dịch mẫu thử

...

...

...

7. Phân tích bằng HPLC

7.1 Phân tích mẫu

Bơm 100 ml dịch chiết (6.3) (tương đương với 2 ml rượu vang hoặc bia) vào máy sắc kí sử dụng pha động (4.11) ở tốc độ dòng 1,0 ml/min.

7.2 Chuẩn bị đường chuẩn

Chuẩn bị đường chuẩn trong ngày phân tích và khi có sự thay đổi về điều kiện sắc kí.

Bơm 100 ml mỗi dung dịch hiệu chuẩn (4.16) vào máy HPLC và dựng đồ thị các giá trị chiều cao pic hoặc diện tích pic của các dung dịch hiệu chuẩn ochratoxin A theo khối lượng ochratoxin A tính bằng nanogam.

Nếu hàm lượng ochratoxin A của mẫu nằm ngoài dải hiệu chuẩn, thì tiến hành pha loãng hoặc sử dụng thể tích bơm nhỏ hơn; trong các trường hợp này, phần tính kết quả phải được điều chỉnh tương ứng.

Do dải các nồng độ rộng, nên đường chuẩn cần phải đi qua điểm "zero" để định lượng chính xác hơn các nồng độ ochratoxin A thấp (< 0,1 ng/ml).

7.3 Nhận biết

...

...

...

Đôi khi có thể cần phải nhận biết pic bằng cách bơm đồng thời dung dịch mẫu thử và dung dịch chuẩn.

7.4 Xác định

Tiến hành xác định bằng phương pháp ngoại chuẩn, tích phân diện tích pic hoặc xác định chiều cao pic và so sánh các kết quả với các giá trị tương ứng đối với chất chuẩn có diện tích hoặc chiều cao pic gần nhất, hoặc sử dụng đường chuẩn. Khi sử dụng đường chuẩn, có thể chuẩn bị thêm các dung dịch bổ sung với các nồng độ nằm trong dải tuyến tính.

Bơm các thể tích bằng nhau của dung dịch mẫu thử và dung dịch chuẩn để dựng đường chuẩn.

Nếu độ đáp ứng ochratoxin A của mẫu thử nằm ngoài dải hiệu chuẩn, thì điều chỉnh lượng mẫu bơm vào bằng cách pha loãng dung dịch mẫu thử.

8. Tính kết quả

Đọc từ đường chuẩn khối lượng ochratoxin A trong phần dung dịch mẫu thử được bơm vào cột HPLC, tính bằng nanogam.

Tính nồng độ khối lượng ochratoxin A, r_OTA, bằng nanogram trên mililit, theo Công thức (2):

r_OTA =                             (2)

...

...

...

m_OTA là khối lượng ochratoxin A trong phần dung dịch mẫu thử được bơm vào cột HPLC xác định được từ đường chuẩn, tính bằng nanogam (ng);

2 là hệ số pha loãng;

V₁ là thể tích mẫu thử cần phân tích, tính bằng mililit (trong trường hợp này là 10 ml);

V₂ là thể tích dung dịch thử được bơm lên cột, tính bằng microlit (trong trường hợp này là 100 ml);

V₃ là thể tích pha động được dùng để hòa tan chất rửa giải đã làm khô, tính bằng microlit (trong trường hợp này là 250 ml).

9. Độ chụm

9.1 Phép thử liên phòng thử nghiệm

Các chi tiết của phép thử liên phòng thử nghiệm về độ chụm của phương pháp được nêu trong Phụ lục A. Các giá trị thu được từ phép thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng cho các dải nồng độ và chất nền khác với các dải nồng độ và chất nền nêu trong Phụ lục A.

9.2 Độ lặp lại

...

...

...

Các giá trị đối với rượu vang trắng là:

 = 0,105 ng/ml

r = 0,028 ng/ml

có thêm chuẩn

 = 0,998 ng/m

r = 0,196 ng/ml

có thêm chuẩn

 = 1,764 ng/ml

r = 0,420 ng/ml

...

...

...

 = 0,283 ng/ml

r = 0,084 ng/ml

nhiễm tự nhiên

Các giá trị đối với rượu vang đỏ là:

 = 0,186 ng/ml

r = 0,028 ng/ml

có thêm chuẩn

 = 0,813 ng/m

r = 0,224 ng/ml

...

...

...

 = 2,530 ng/ml

r = 0,616 ng/ml

có thêm chuẩn

 = 1,690 ng/ml

r = 0,504 ng/ml

nhiễm tự nhiên

Các giá trị đối với bia là:

 = 0,190 ng/ml

r = 0,056 ng/ml

...

...

...

 = 0,696 ng/m

r = 0,140 ng/ml

có thêm chuẩn

 = 1,403 ng/ml

r = 0,196 ng/ml

có thêm chuẩn

 = 0,070 ng/ml

r = 0,028 ng/ml

nhiễm tự nhiên

...

...

...

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử đơn lẻ, thu được trên vật liệu thử giống hệt nhau được báo cáo từ hai phòng thử nghiệm, không được quá 5 % các trường hợp vượt quá giá trị giới hạn tái lập R.

Các giá trị đối với rượu vang trắng là:

 = 0,105 ng/ml

R = 0,056 ng/ml

có thêm chuẩn

 = 0,998 ng/m

R = 0,364 ng/ml

có thêm chuẩn

 = 1,764 ng/ml

...

...

...

có thêm chuẩn

 = 0,283 ng/ml

R = 0,112 ng/ml

nhiễm tự nhiên

Các giá trị đối với rượu vang đỏ là:

 = 0,186 ng/ml

R = 0,056 ng/ml

có thêm chuẩn

 = 0,813 ng/m

...

...

...

có thêm chuẩn

 = 2,530 ng/ml

R = 0,980 ng/ml

có thêm chuẩn

 = 1,690 ng/ml

R = 0,644 ng/ml

nhiễm tự nhiên

Các giá trị đối với bia là:

 = 0,190 ng/ml

...

...

...

có thêm chuẩn

 = 0,696 ng/m

R = 0,364 ng/ml

có thêm chuẩn

 = 1,403 ng/ml

R = 0,588 ng/ml

có thêm chuẩn

 = 0,070 ng/ml

R = 0,056 ng/ml

...

...

...

10. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm các thông tin sau:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết mẫu thử (kiểu loại mẫu, nguồn gốc mẫu, tên gọi);

b) viện dẫn tiêu chuẩn này;

c) ngày và loại quy trình lấy mẫu (nếu biết);

d) ngày nhận mẫu;

e) ngày thử nghiệm;

f) các kết quả thử và các đơn vị biểu thị kết quả;

g) các chi tiết bất thường quan sát được trong khi tiến hành thử nghiệm;

...

...

...

Phụ lục A

(Tham khảo)

Dữ liệu về độ chụm

Các dữ liệu nêu trong Bảng A.1 đến Bảng A.3 thu được từ một phép thử liên phòng thử nghiệm [5] phù hợp với các Hướng dẫn của AOAC về thủ tục nghiên cứu cộng tác để đánh giá xác nhận phương pháp phân tích [4].

Bảng A.1 - Dữ liệu về độ chụm đối với rượu vang trắng

Rượu vang trắng

Mẫu trắng

Mẫu thêm OTA (ng/ml)

...

...

...

0,100

1,100

2,000

Năm tiến hành phép thử liên phòng thử nghiệm

1999

1999

1999

...

...

...

1999

Số lượng phòng thử nghiệm

16

16

16

16

16

Số lượng các phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ

14^a

...

...

...

14

14

15

Số lượng các phòng thử nghiệm ngoại lệ

-

1

2

2

1

...

...

...

28

26

28

28

30

Giá trị trung bình, ng/ml

< 0,01

0,105

0,998

...

...

...

0,283

Độ lệch chuẩn lặp lại, s_r, ng/ml

-

0,01

0,07

0,15

0,03

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSD_r, %

-

...

...

...

6,6

8,4

10,8

Giới hạn lặp lại, r (r = 2,8 x s_r), ng/ml

-

0,028

0,196

0,420

0,084

...

...

...

-

0,02

0,13

0,23

0,04

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSD_R, %

-

15,9

13,3

...

...

...

14,6

Giới hạn tái lập, R (R = 2,8 x s_R), ng/ml

-

0,056

0,364

0,644

0,112

Độ thu hồi, %

-

...

...

...

90,7

88,2

-

^a Hai phòng thử nghiệm đã loại ra khỏi đánh giá thống kê vì có giới hạn phát hiện cao (= 0,2 ng/ml).

^b n.c mẫu nhiễm tự nhiên.

Bảng A.2 - Dữ liệu về độ chụm đối với rượu vang đỏ

Rượu vang đỏ

Mẫu trắng

Mẫu thêm OTA (ng/ml)

...

...

...

0,200

0,900

3,000

Năm tiến hành phép thử liên phòng thử nghiệm

1999

1999

1999

...

...

...

1999

Số lượng phòng thử nghiệm

15

15

15

15

15

Số lượng các phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ

14^a

...

...

...

14

15

14

Số lượng các phòng thử nghiệm ngoại lệ

-

2

1

-

1

...

...

...

28

24

28

30

28

Giá trị trung bình, ng/ml

< 0,01

0,186

0,813

...

...

...

1,690

Độ lệch chuẩn lặp lại, s_r, ng/ml

-

0,01

0,08

0,22

0,18

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSD_r,%

-

...

...

...

9,9

8,9

10,8

Giới hạn lặp lại, r (r = 2,8 x s_r), ng/ml

-

0,028

0,224

0,616

0,504

...

...

...

-

0,02

0,10

0,35

0,23

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSD_R,%

-

11,9

12,5

...

...

...

13,6

Giới hạn tái lập, R (R = 2,8 x s_R), ng/ml

-

0,056

0,280

0,980

0,644

Độ thu hồi, %

-

...

...

...

90,3

84,3

-

^a Một phòng thử nghiệm đã loại ra khỏi đánh giá thống kê vì có giới hạn phát hiện cao (= 0,2 ng/ml).

^b n.c mẫu nhiễm tự nhiên.

Bảng A.3 - Dữ liệu về độ chụm đối với bia

Bia

Mẫu trắng

Mẫu thêm OTA (ng/ml)

...

...

...

0,200

0,800

1,500

Năm tiến hành phép thử liên phòng thử nghiệm

1999

1999

1999

...

...

...

1999

Số lượng phòng thử nghiệm

15

15

15

15

15

Số lượng các phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ

14^a

...

...

...

15

13

14^a

Số lượng các phòng thử nghiệm ngoại lệ

-

1

-

2

-

...

...

...

28

26

30

26

28

Giá trị trung bình, ng/ml

< 0,01

0,190

0,696

...

...

...

0,070

Độ lệch chuẩn lặp lại, s_r, ng/ml

-

0,02

0,05

0,07

0,01

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSD_r,%

-

...

...

...

7,2

4,7

16,5

Giới hạn lặp lại, r (r = 2,8 x s_r), ng/ml

-

0,056

0,140

0,196

0,028

...

...

...

-

0,04

0,13

0,21

0,02

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSD_R,%

-

20,9

18,3

...

...

...

26,1

Giới hạn tái lập, R (R = 2,8 x s_R), ng/ml

-

0,112

0,364

0,588

0,056

Độ thu hồi, %

-

...

...

...

87,0

93,6

-

^a Một phòng thử nghiệm đã loại ra khỏi đánh giá thống kê vì có giới hạn phát hiện cao (= 0,2 ng/ml).

^b n.c mẫu nhiễm tự nhiên.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Castegnaro M., Barek J., Fremy J.M., Lafontaine M., Miraglia M., Sansone E.B. and Telling G.M Laboratory decontamination and destruction of carcinogens in laboratory wastes: some mycotoxins. IARC Scientific Publication No. 113, International Agency for Research on Cancer, Lyon (France), 1991, 63 p.

[2] Visconti, A., Pascale, M., and Centonze, G.: Determination of ochratoxin A in wine by means of immunoaffinity column clean-up and high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography A, 864, 1999, 89-101.

...

...

...

[4] Guidelines for Collaborative Study to Validate Characteristics of a Method of Analysis" J.AOAC Int. 72, 1989, 694-704.

[5] Visconti A, Pascale M, Centonze G.: (2001) Determination of ochratoxin A in wine and beer by  immunoaffinity column clean-up and liquid chromatographic analysis with flurometric detection: Collaborative study. J AOAC Int 84:1818-1827.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9524:2012 (EN 14133:2009) về Thực phẩm - Xác định hàm lượng ochratoxin A trong rượu vang và bia - Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) có làm sạch bằng cột ái lực miễn nhiễm