Lấy từ 100 µl đến 500 µl dung dịch này dùng cho phép xác định bằng enzym (xem 6.2).

6.2  Xác định

Tiến hành xác định theo Bảng 1 ở nhiệt độ từ 20 ^oC đến 25 ^oC trong cuvet thạch anh (5.6) thường với thể tích mẫu 100 µl. Nếu thể tích của mẫu khác với 100 µl thì thêm nước vào sao cho thể tích cuối cùng của nước và mẫu là 2,00 ml.

Nếu phản ứng không dừng lại thì tiếp tục đọc độ hấp thụ với khoảng thời gian 2 min một lần cho đến khi sự thay đổi về độ hấp thụ là không đổi. Nếu độ hấp thụ giảm ổn định thì ngoại suy độ hấp thụ ngược với thời gian bổ sung huyền phù sulfit oxidase để ước tính A₂ cần sử dụng.

7  Tính kết quả

Tính độ hấp thụ của dung dịch mẫu thử từ Công thức:

A_mẫu = A _{1 mẫu} - A _{2 mẫu}

(1)

A_{mẫu trắng} = A _{1 mẫu trắng} - A _{2 mẫu trắng}

...

...

...

A = A_mẫu - A_{mẫu trắng}

(3)

Giá trị độ hấp thụ của mẫu A_mẫu không được quá 0,05 nếu không thì sử dụng thể tích dung dịch mẫu lớn hơn.

Tính nồng độ khối lượng của sulfit (biểu thị theo lưu huỳnh dioxit) trong mẫu, ρ, tính bằng gam trên lít hoặc phần khối lượng, ω, tính bằng gam trên kilogam (g/kg), từ Công thức (4) hoặc (5).

(4)

(5)

Trong đó:

...

...

...

V₂ là thể tích mẫu được lấy để phân tích bằng enzym, tính bằng mililít (ml) (ở đây là 0,1 ml đến 0,5 ml);

V₃ là tổng thể tích của dung dịch mẫu thử đối với các mẫu dạng rắn, tính bằng mililít (ml) (ở đây là 50 ml).

M là khối lượng phân tử tương đối của lưu huỳnh dioxit (64,1 g/mol);

d là chiều dài đường quang, tính bằng xentimet (ở đây là 1 cm);

ε là hệ số hấp thụ của NADH ở bước sóng 340 nm (6,3 l.mmol^-1.cm^-1);

m là khối lượng của mẫu dạng rắn, tính bằng gam (g) (6.1.3);

F là hệ số pha loãng, nếu mẫu được pha loãng trong quá trình chuẩn bị mẫu (xem 6.1, 6.1.2.2 hoặc 6.1.2.3).

8  Độ chụm

8.1  Yêu cầu chung

...

...

...

8.2  Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm đơn lẻ thu được trên cùng một mẫu thử do một người phân tích, sử dụng cùng một loại thiết bị, thực hiện trong khoảng thời gian ngắn nhất, không được quá 5 % các trường hợp vượt quá giới hạn lặp lại r.

Các giá trị là:

Rượu vang

 = 75 mg/l

r = 8 mg/l

Táo khô

 = 800 mg/kg

r = 298 mg/ kg

...

...

...

 = 960 mg/kg

r = 358 mg/kg

Nước chanh

 = 270 mg/l

r = 37 mg/l

Nho khô (sultanas)

 = 260 mg/kg

r = 45 mg/kg

Bia

...

...

...

r = 0,8 mg/l

Bảng 1 - Thể tích dịch lỏng được hút vào cuvet

Dịch lỏng được hút vào cuvet

Cuvet mẫu

Cuvet mẫu trắng

Dung dịch đệm triethanolamin (4.8)

1,00 ml

1,00 ml

...

...

...

0,10 ml

0,10 ml

Huyền phù peroxidase NADH (4.10)

0,01 ml

0,01 ml

Dung dịch mẫu thử

0,10 ml

-

Nước

...

...

...

2,00 ml

Trộn nhẹ. Đo độ hấp thụ A, của cuvet mẫu và cuvet mẫu trắng sau 5 min (không cho cuvet vào đường quang chuẩn), sau đó bắt đầu cho phản ứng bằng cách bổ sung như sau:

Huyền phù sulfit oxidase (4.11)

0,05 ml

0,05 ml

Trộn đều và đọc độ hấp thụ A₂ sau khoảng 30 min. Lấy số đọc bổ sung sau 5 min để kiểm tra không có sự thay đổi tiếp theo nào ở độ hấp thụ đã lấy.

8.3  Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm đơn lẻ trên cùng một vật liệu thử do hai phòng thử nghiệm thực hiện không được quá 5 % các trường hợp vượt quá giới hạn tái lập R.

Các giá trị là:

...

...

...

 = 75 mg/l

R = 16 mg/l

Táo khô

 = 800mg/kg

R = 311 mg/kg

Táo khô

 = 960 mg/kg

R = 374 mg/kg

Nước chanh

...

...

...

R = 79 mg/l

Nho khô (sultanas)

 = 260 mg/kg

R = 129 mg/kg

Bia

 = 4,9mg/l

R = 1,6mg/l

9  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin sau đây:

...

...

...

- viện dẫn tiêu chuẩn này hoặc phương pháp thử đã sử dụng;

- các kết quả và các đơn vị biểu thị các kết quả;

- ngày và quy trình lấy mẫu (nếu biết);

- ngày nhận mẫu;

- ngày thử mẫu;

- các điểm cụ thể quan sát được trong quá trình thử;

- mọi thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được xem là tùy chọn có thể ảnh hưởng đến kết quả.

Phụ lục A

...

...

...

Dữ liệu về độ chụm

Độ chụm của phương pháp được thiết lập bởi phép thử liên phòng thử nghiệm theo ISO 5725:1986 (xem Tài liệu tham khảo [8]) đặc biệt trên mẫu có nồng độ sulfit thấp (xem Tài liệu tham khảo [1], [4] và [5]).

Các mẫu nghiên cứu xem xét trên sản phẩm khoai tây dạng miếng mỏng, rượu vang, nước chanh, táo khô, nho khô và bia có hàm lượng sulfit từ 0 mg/kg đến 960 mg/kg. Mười một phòng thử nghiệm đã tham gia tiến hành phân tích trên mười hai mẫu trong toàn bộ nghiên cứu. Sáu phòng thử nghiệm phân tích trên tám mẫu trong nghiên cứu bổ sung.

Các kết quả nghiên cứu cộng tác cho thấy, phương pháp thích hợp với phép phân tích định lượng sulfit ở mức dưới 100 mg SO₂/kg. Trong phép phân tích các mẫu dạng rắn hoặc khi sulfit bám dính vào các hạt (ví dụ trong nước quả), thì cho hệ số biến thiên cao, đặc biệt nếu người phân tích ít có kinh nghiệm với phương pháp enzym. Nồng độ trong rượu vang từ 1 mg/l đến 10 mg/l có thể xác định được với độ tin cậy cao.

Giới hạn phát hiện của phương pháp được biểu thị theo độ hấp thụ là 0,04. Đối với mẫu 1 ml, giới hạn phát hiện của phương pháp được tính theo giá trị trung bình của mẫu trắng đại diện (n > 20) cộng với ba lần hệ số biến thiên của giá trị trung bình (theo khuyến cáo của Ủy ban Châu Âu) là 1,2 mg SO₂/kg.

Theo ISO 5725:1986 [8], trong phép thử liên phòng thử nghiệm, các thông số đã cho trong Bảng A.1 (so sánh cặp đôi/mẫu kép mù) và Bảng A.2 là như nhau. Phép thử được thực hiện trên khoai tây dạng miếng mỏng, táo khô và nước quả (xem Tài liệu tham khảo [9]) do Cục thực phẩm quốc gia Thụy Điển tiến hành.

Theo ISO 5725:1986 [8], các thông số trong Bảng A.3 được xác định trong phép thử liên phòng thử nghiệm. Phép thử được tiến hành trên nho khô và bia (xem tài liệu tham khảo [4], [5]) do Viện Max von Pettenkofer của Văn phòng Y tế liên bang, Cục thực phẩm, Berlin, Đức thực hiện.

Bảng A.1 - Dữ liệu liên phòng thử nghiệm trên rượu vang, táo khô và nước chanh

Mẫu

...

...

...

Táo khô

Táo khô

Nước chanh

Năm tiến hành phép thử liên phòng thử nghiệm

1991

1990

1990

1990

Số lượng phòng thử nghiệm

...

...

...

11

11

11

Số lượng phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ

6

10

10

10

Số lượng phòng thử nghiệm ngoại lệ

...

...

...

1

1

1

Số lượng mẫu

1

1

1

2

Số lượng các kết quả được chấp nhận

...

...

...

7

7

10

Giá trị trung bình (), mg/kg hoặc mg/l

75

800

960

270

Độ lệch chuẩn lặp lại (s_r), mg/kg hoặc mg/l

...

...

...

106

128

13

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại (RSD_r) %

4

13

13

5

Giới hạn lặp lại (r), mg/kg hoặc mg/l

...

...

...

298

358

37

Độ lệch chuẩn tái lập (s_R), mg/kg hoặc mg/l

6

111

133

28

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập (RSD_R) %

...

...

...

14

14

10

Giới hạn tái lập (R), mg/kg hoặc mg/l

16

311

374

79

CHÚ THÍCH Các giá trị đối với rượu vang và nước chanh được tính bằng miligam trên lít và các giá trị đối với táo khô được tính bằng miligam trên kilogam.

...

...

...

Mẫu

Khoai tây dạng miếng mỏng

Khoai tây dạng miếng mỏng

Năm tiến hành phép thử liên phòng thử nghiệm

1990

1990

Số lượng phòng thử nghiệm

11

11

...

...

...

10

10

Số lượng phòng thử nghiệm ngoại lệ

1

1

Số lượng mẫu

1

1

Số lượng các kết quả được chấp nhận

...

...

...

7

Giá trị trung bình (), mg/kg

28,3

110

Độ lệch chuẩn tái lập (s_R) mg/kg

13

15

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập (RSD_R), mg/kg

45

...

...

...

Giới hạn tái lập (R), mg/kg

36

42

Bảnh A.3 - Dữ liệu liên phòng thử nghiệm trên nho khô và bia

Mẫu

Nho khô

Bia

Năm tiến hành phép thử liên phòng thử nghiệm

1986

...

...

...

Số lượng phòng thử nghiệm

14

16

Số lượng phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ

13

14

Số lượng phòng thử nghiệm ngoại lệ

1

2

...

...

...

1

1

Số lượng các kết quả được chấp nhận

74

70

Giá trị trung bình (), mg/kg hoặc mg/l

260 mg/kg

4,9 mg/l

Độ lệch chuẩn lặp lại (s_r), mg/kg hoặc mg/l

...

...

...

0,3 mg/l

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại (RSD_r) %

6%

5,8 %

Giới hạn lặp lại (r), mg/kg hoặc mg/l

45 mg/kg

0,8 mg/l

Độ lệch chuẩn tái lập (s_R), mg/kg hoặc mg/l

46 mg/kg

...

...

...

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, (RSD_R) %

18%

11,6%

Giới hạn tái lập (R), mg/kg

129 mg/kg

1,6 mg/l

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Nordic Committee on food analysis, No 135 (1990).

...

...

...

[3] Beutler, H O: Food chemistry 15, 157-164 (1984).

[4] Official collection of methods of foods analysis according to §35 IMBG (German food and commodities regulations), Beuth, Berlin, 1993, method L 30.001.

[5] Official collection of methods of food analysis arcoding to §35 LMBG (German food and commodities regulations), Beuth, Berlin, 1993, method L 36.008.

[6] Journal of the Institute f Brewing, European Brewery convention, Vol.98, 1992, Method 9.12.3.

[7] Enzyme Commission (EC): Classification system. Enzyme Handbook, springer, Berlin 1969.

[8] ISO 5725:19861) Precision of test methods -- Determination of repeatabilíty and reproducibilíty for a standard test method by inter-laboratory tests¹⁾.

[9] Edberg, U.: Journal of AOAC International, 76 (1993) 53-58.

1) Việc phân tích protein đậu tương đã dẫn đến kết quả dương tính giả trong dải từ 20 mg/kg đến 30 mg/kg được tính theo theo lưu huỳnh dioxit. Vì vậy, khi phân tích thực phẩm chữa protein đậu tương đã phân tách thì tỷ lệ kết quả thu được có thể tăng lên và cần lưu ý điều này.

2) Thuốc thử này bao gồm trong bộ kit thử có bán sẵn. Nếu sử dụng bộ kit thử này, cần tuân thủ các chỉ dẫn của nhà sản xuất.

...

...

...

2) Thuốc thử này bao gồm trong bộ kít thử có bán sẵn. Nếu sử dụng bộ kit thử này, cần tuân thủ các chỉ dẫn của nhà sản xuất.

3) Đơn vị này (thường là đơn vị quốc tế hoặc đơn vị chuẩn) được định nghĩa là lượng enzym xúc tác chuyển đổi 1 µmol cơ chất trong 1 min ở các điều kiện chuẩn.

1) Tiêu chuẩn này hiện nay đã hủy, được sử dụng để thu lấy dữ liệu về độ chụm.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9519-2:2016 (EN 1988-2:1998) về Thực phẩm - Xác định sulfit - Phần 2: Phương pháp enzym