4.10.3  Dung dịch nội chuẩn, ρ ≈ 80 μg/ml

Pha loãng 4 ml dung dịch chuẩn gốc TMP (4.10.1) trong 50 ml nước.

4.10.4  Dung dịch chuẩn làm việc, ρ ≈ 40 μg/ml

Dùng pipet lấy 2 ml mỗi dung dịch chuẩn gốc (4.10.1) (AMP, CMP, GMP, IMP và UMP) cho vào một bình định mức 50 ml và thêm nước đến vạch.

4.10.5  Dung dịch chuẩn hiệu chuẩn. Xem Bảng 2 về các nồng độ danh nghĩa nucleotid của các dung dịch chuẩn hiệu chuẩn.

Bảng 2 - Nồng độ danh nghĩa của các dung dịch chuẩn hiệu chuẩn

Dung dịch hiệu chuẩn

Nồng độ của mỗi nucleotid:
AMP, CMP, GMP, IMP, UMP μg/ml

Nồng độ của TMP
μg/ml

...

...

...

0,4

3,2

2

0,8

3,2

3

3,2

3,2

4

...

...

...

3,2

4.10.5.1  Dung dịch hiệu chuẩn 1

Dùng pipet lấy 0,25 ml dung dịch chuẩn làm việc (4.10.4) và 1 ml dung dịch nội chuẩn (4.10.3) cho vào bình định mức 25 ml và thêm nước đến vạch.

4.10.5.2  Dung dịch hiệu chuẩn 2

Dùng pipet lấy 0,5 ml dung dịch chuẩn làm việc (4.10.4) và 1 ml dung dịch nội chuẩn (4.10.3) cho vào bình định mức 25 ml và thêm nước đến vạch.

4.10.5.3  Dung dịch hiệu chuẩn 3

Dùng pipet lấy 2 ml dung dịch chuẩn làm việc (4.10.4) và 1 ml dung dịch nội chuẩn (4.10.3) cho vào bình định mức 25 ml và thêm nước đến vạch.

4.10.5.4  Dung dịch hiệu chuẩn 4

Dùng pipet lấy 5 ml dung dịch chuẩn làm việc (4.10.4) và 1 ml dung dịch nội chuẩn (4.10.3) cho vào bình định mức 25 ml và thêm nước đến vạch.

...

...

...

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

5.1  Hệ thống HPLC, được trang bị bơm, bộ bơm mẫu với vòng bơm 50 μl, bộ khử khí, buồng cột và detector mảng diot quang.

5.2  Cột C18, loại Gemini2) có cỡ hạt 5 μm, kích thước 250 mm x 4,6 mm (Phenomenex²⁾).

5.3  Máy đo phổ, có thể cho số đọc đến ba chữ số sau dấu phẩy.

5.4  Dụng cụ đo pH.

5.5  Máy ly tâm.

5.6  Ống ly tâm, Amicon Ultra MWCO 3k, dung tích 4 ml (Millipore)²⁾.

5.7  Ống ly tâm polypropylen, dung tích 50 ml.

5.8  Xyranh sử dụng một lần, dung tích 3 ml.

...

...

...

5.10  Bộ bơm chân không SPE.

5.11  Cột SPE trao đổi anion mạnh polypropylen, 6 ml x 1 000 mg, Chromabond SB²⁾.

5.12  Màng lọc, bằng nylon cỡ lỗ 0,45 μm.

6  Chuẩn bị mẫu thử

a) Lắc hoặc trộn mẫu trước khi mở vật chứa.

b) Cân chính xác khoảng 1 g mẫu thử dạng bột hoặc 10 ml thức ăn công thức dành cho trẻ nhỏ từ sữa dạng lỏng/ăn liền, cho vào ống ly tâm 50 ml.

c) Thêm 30 ml dung dịch chiết (4.9.2).

d) Thêm 1,0 ml dung dịch nội chuẩn TMP (4.10.3).

e) Đậy nắp ống và trộn bằng máy Vortex cho đến khi bột hòa tan.

...

...

...

g) Pha loãng bằng nước đến thể tích cuối cùng xấp xỉ 50 ml.

h) Đậy nắp ống ly tâm và trộn bằng máy Vortex.

i) Đối với các sản phẩm từ tinh bột, chuyển vào hai ống siêu ly tâm, mỗi ống 4 ml mẫu đã chuẩn bị và ly tâm ở 3500g trong 60 min, sau đó rót dịch lọc ra khỏi hai ống.

7  Cách tiến hành

7.1  Chiết mẫu

Trong quá trình chiết, không để cột bị khô mà cho chảy từng giọt vào cột.

Khi tháo dịch chiết ra khỏi cột, tốc độ dòng cần nhỏ hơn 2 ml/min.

a) Đối với mỗi mẫu thử, đặt cột SPE lên nhánh hút của bộ bơm chân không.

b) Ổn định cột bằng cách thêm 4 ml metanol và cho chảy đến đáy cột, sau đó thêm hai lần bằng nước, (mỗi lần dùng 5 ml) và cho chảy đến đáy cột.

...

...

...

d) Rửa cột bằng 4 ml dung dịch rửa (4.9.3) để loại bỏ các chất gây nhiễu và cho chảy đến đáy cột.

e) Đưa ống thu nhận mẫu vào bộ bơm chân không SPE.

f) Rửa giải các nucleotid bằng 4 ml dung dịch rửa giải (4.9.4) vào ống thu nhận mẫu và cho cột chảy hết.

g) Lọc khoảng 2 ml dịch rửa giải qua bộ lọc xyranh 0,2 μm vào lọ lấy mẫu tự động.

7.2  Chạy sắc ký

a) Tạo gradient bằng cách trộn nhẹ pha động A và pha động B để tách các nucleotid theo quy trình nêu trong Bảng 3.

Bảng 3 - Quy trình gradient để phân tách bằng sắc ký

Thời gian

min

...

...

...

ml/min

Pha động A

%

Pha động B

%

0

0,6

100

0

...

...

...

0,6

80

20

26

0,6

100

0

40

0,6

...

...

...

0

b) Dải phổ yêu cầu trong khoảng từ 210 nm đến 300 nm, dùng detector mảng diot quang với chương trình sắc ký được kiểm soát ở các bước sóng quy định sau đây trước khi định lượng.

1) IMP ở bước sóng 250 nm;

2) AMP, GMP và TMP ở bước sóng: 260 nm;

3) CMP và UMP ở bước sóng: 270 nm.

c) Cài đặt nhiệt độ buồng cột đến 40 °C.

Ví dụ về sắc ký đồ được nêu trong Phụ lục A.

8  Tính kết quả

8.1  Tính độ tinh khiết của mỗi nucleotid (tính theo axit tự do) của dung dịch chuẩn tinh khiết (4.10.2), bằng phần trăm (%), theo Công thức (1):

...

...

...

(1)

Trong đó:

Abs_λmax là độ hấp thụ tia UV tại bước sóng cực đại;

 là hệ số tắt của nucleotid;

mSS là khối lượng nucleotid trong dung dịch chuẩn gốc, tính bằng miligam (mg);

50  là tổng thể tích của dung dịch chuẩn gốc, tính bằng mililit (ml):

50  là tổng thể tích của dung dịch chuẩn tinh khiết, tính bằng mililit (ml);

1 là thể tích của dung dịch chuẩn gốc bổ sung vào chất chuẩn tinh khiết, tính bằng mililit (ml).

1000  là khối lượng chuyển đổi từ miligam sang gam.

...

...

...

(2)

Trong đó:

mSS là khối lượng nucleotid trong dung dịch chuẩn gốc, tính bằng miligam (mg);

50 là tổng thể tích của dung dịch chuẩn gốc SS, tính bằng mililit (ml);

10³ là hệ số chuyển đổi nồng độ từ miligam trên mililit (mg/ml) sang microgam trên mililit (μg/ml).

PS% là phần trăm độ tinh khiết;

100 là hệ số chuyển đổi khối lượng từ phần trăm sang số thập phân.

8.3  Tính nồng độ của TMP trong dung dịch nội chuẩn (IS) (4.10.3), bằng microgam trên mililit (μg/ml), theo Công thức (3):

...

...

...

(3)

Trong đó:

SS là nồng độ của TMP trong dung dịch chuẩn gốc, tính bằng microgam trên mililit (μg/ml);

4 là thể tích dung dịch chuẩn gốc TMP trong dung dịch nội chuẩn, tính bằng mililit (ml);

50 là tổng thể tích dung dịch nội chuẩn, tính bằng mililit (ml).

8.4  Tính nồng độ các nucleotid trong dung dịch chuẩn làm việc (WS) (4.10.4), tính bằng microgam trên mililit (μg/ml), theo công thức (4):

(4)

Trong đó:

...

...

...

2 là thể tích dung dịch chuẩn gốc nucleotid trong dung dịch chuẩn làm việc, tính bằng mililit (ml);

50 là tổng thể tích dung dịch chuẩn làm việc, tính bằng mililit (ml);

8.5  Tính nồng độ của TMP trong các dung dịch chuẩn hiệu chuẩn (CS) (4.10.5), bằng microgam trên mililit (μg/ml), theo Công thức (5):

(5)

Trong đó:

IS là nồng độ của nucleotid trong dung dịch nội chuẩn, tính bằng microgam trên mililit (μg/ml);

1 là thể tích của IS trong dung dịch chuẩn hiệu chuẩn, tính bằng mililit (ml);

25 là tổng thể tích dung dịch chuẩn hiệu chuẩn, tính bằng mililit (ml).

...

...

...

(6)

Trong đó:

WS là nồng độ của nucleotid trong dung dịch chuẩn làm việc, tính bằng microgam trên mililit (μg/ml);

V_ws là thể tích dung dịch chuẩn làm việc trong dung dịch chuẩn hiệu chuẩn, tính bằng mililit (ml);

25 là tổng thể tích dung dịch hiệu chuẩn, tính bằng mililit (ml).

8.7  Xác định đường hồi quy tuyến tính về tỷ lệ các diện tích pic (nucleotid/TMP; trục y) với tỷ lệ các nồng độ (nucleotid/TMP; trục x) đối với các chất chuẩn hiệu chuẩn và tính độ dốc có điểm cắt với trục y phải đi qua tọa độ 0.

8.8  Nội suy các hàm lượng nucleotid có trong các mẫu chưa biết từ đường chuẩn.

a) Đối với mẫu dạng bột:

...

...

...

(7)

b) Đối với mẫu dạng lỏng ăn liền:

Hàm lượng nucleotid, bằng miligam trên 100 g, tính được theo Công thức (8):

(8)

Trong đó:

A_NT là diện tích pic nucleotid trong mẫu thử;

A_IS là diện tích pic TMP trong mẫu thử;

...

...

...

C_IS là nồng độ của chất nội chuẩn bổ sung vào mẫu thử, tính bằng microgam trên mililit (μg/ml);

V_IS là thể tích chất nội chuẩn bổ sung vào mẫu thử, tính bằng mililit (ml);

m_s là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam (g);

100 là hệ số chuyển đổi kết quả từ miligam sang miligam;

V_s là thể tích mẫu thử, tính bằng mililit (ml);

100 là hệ số chuyển đổi khối lượng hoặc thể tích từ gam sang 100 gam hoặc từ mililit sang 100 mililit.

9  Biểu thị kết quả

Báo cáo kết quả thử nghiệm bằng mg/100 g hoặc mg/100 ml đến một chữ số sau dấu phẩy.

...

...

...

(Tham khảo)

Các ví dụ về sắc ký đồ

CHÚ DẪN

A hỗn hợp các chất chuẩn nucleotid

B thức ăn công thức dành cho trẻ sơ sinh từ sữa bò

C thức ăn công thức dành cho trẻ sơ sinh từ đậu nành

D thức ăn công thức cho trẻ sơ sinh từ protein sữa đã thủy phân

1 cytidin 5’-monophosphat (CMP)

...

...

...

3 guanosin 5'-monophosphat (GMP)

4 inosin 5'-monophosphat (IMP)

5 thymidin 5'-monophosphat (TMP)

6 adenosine 5‘-monophosphat (AMP)

Hình A.1 - Ví dụ về các sắc ký đồ

Phụ lục B

(Tham khảo)

Dữ liệu về độ chụm

...

...

...

Bảng B.1 - Dữ liệu độ chụm đối với mẫu thực hành trên chất chuẩn NIST 1849^a được chứng nhận

Thông số

CMP

UMP

GMP

IMP

AMP

Tổng số phòng thí nghiệm, n

12

...

...

...

12

11a

12

Tổng số phép lặp lại, 2n

24

24

24

22

24

...

...

...

28,14

11,76

15,07

n/a

10,87

Độ lệch chuẩn lặp lại, s_r, mg/100 g

0,46

0,30

0,38

...

...

...

0,22

Độ lệch chuẩn tái lập, s_R, mg/100 g

1,36

0,59

0,68

n/a

0,47

Giới hạn lặp lại trong SMPR

≤ 6%

...

...

...

≤ 6%

n/a

≤ 6%

Hệ số biến thiên lặp lại, C_v,r,%

1,6

2,5

2,5

n/a

2,1

...

...

...

≤ 11%

≤ 11%

≤ 11%

n/a

≤ 11%

Hệ số biến thiên tái lập, C_V,R,%

4,8

5,0

4,5

...

...

...

4,4

Trị số HorRat

0,7

0,6

0,6

n/a

0,6

^a Không quá 2/9 phòng thử nghiệm loại trừ khỏi phép phân tích thống kê.

n/a Không xác định.

...

...

...

Thông số

CMP

UMP

GMP

IMP

AMP

Tổng số phòng thí nghiệm, n

12

12

...

...

...

12

12

Tổng số phép lặp lại, 2n

24

24

1,45

24

24

Trung bình tổng các dữ liệu, , mg/100 g

...

...

...

3,84

0,03

1,65

3,34

Độ lệch chuẩn lặp lại, s_r, mg/100 g

0.12

0,09

0,04

0,05

...

...

...

Độ lệch chuẩn tái lập, s_R, mg/100 g

0,89

0,30

24

0,10

0,09

Giới hạn lặp lại trong SMPR

≤ 6%

≤ 6%

...

...

...

≤ 6%

≤ 6%

Hệ số biến thiên lặp lại, C_v,r,%

1,1%

2,4%

1,8%

2,8%

1,4%

Giới hạn tái lập trong SMPR

...

...

...

≤ 11%

≤ 11%

≤ 11%

≤ 11%

Hệ số biến thiên tái lập, C_V,R,%

7,8%

7,9%

2,8%

6,1%

...

...

...

Trị số HorRat

1,0

0,9

0,3

0,6

0,3

Bảng B.3 - Dữ liệu độ chụm đối với mẫu thức ăn công thức cho trẻ sơ sinh từ tinh bột

Thông số

CMP

...

...

...

GMP

IMP

AMP

Tổng số phòng thí nghiệm, n

11^a

11^a

11^a

11^a

11^a

...

...

...

22

22

22

22

22

Trung bình tổng các dữ liệu, , mg/100 g

10,99

3,88

1,67

...

...

...

3,54

Độ lệch chuẩn lặp lại, s_r, mg/100 g

0,30

0,21

0,03

0,02

0,08

Độ lệch chuẩn tái lập, s_R, mg/100 g

0,81

...

...

...

0,07

0,17

0,11

Giới hạn lặp lại trong SMPR

≤ 6%

≤ 6%

≤ 6%

≤ 6%

≤ 6%

...

...

...

2,7%

5,4%

1,6%

1,4%

2,1%

Giới hạn tái lập trong SMPR

≤ 11%

≤ 11%

≤ 11%

...

...

...

≤ 11%

Hệ số biến thiên tái lập, C_V,R,%

7,4%

8,4%

4,2%

10,3%

3,0%

Trị số HorRat

0,9

...

...

...

0,4

1,0

0,3

^a Không quá 2/9 phòng thử nghiệm loại trừ khỏi phép phân tích thống kê.

Bảng B.4 - Dữ liệu độ chụm đối với mẫu thức ăn công thức cho trẻ sơ sinh có chất thủy phân

Thông số

CMP

UMP

GMP

...

...

...

AMP

Tổng số phòng thí nghiệm, n

12

12

12

11^a

12

Tổng số phép lặp lại, 2n

24

...

...

...

24

22

24

Trung bình tổng các dữ liệu, , mg/100 g

9,72

4,15

1,38

2,46

4,73

...

...

...

0,26

0,13

0,05

0,04

0,19

Độ lệch chuẩn tái lập, s_R, mg/100 g

0,69

0,36

0,11

...

...

...

0,30

Giới hạn lặp lại trong SMPR

≤ 6%

≤ 6%

≤ 6%

≤ 6%

≤ 6%

Hệ số biến thiên lặp lại, C_v,r,%

2,7%

...

...

...

3,9%

1,8%

3,9%

Giới hạn tái lập trong SMPR

≤ 11%

≤ 11%

≤ 11%

≤ 11%

≤ 11%

...

...

...

7,1%

8,7%

7,7%

5,5%

6,2%

Trị số HorRat

0,9

1,0

0,7

...

...

...

0,7

^a Không quá 2/9 phòng thử nghiệm loại trừ khỏi phép phân tích thống kê.

Bảng B.5 - Dữ liệu độ chụm đối với mẫu thức ăn công thức cho trẻ sơ sinh từ đậu nành

Thông số

CMP^a

UMP^a

GMP^a

IMP^a

AMP^a

...

...

...

12

12

12

12

12

Tổng số phép lặp lại, 2n

24

24

24

...

...

...

24

Trung bình tổng các dữ liệu, , mg/100 g

0,50

0,19

0,22

0,16

0,54

Độ lệch chuẩn lặp lại, s_r, mg/100 g

0,19

...

...

...

0,05

0,07

0,11

Độ lệch chuẩn tái lập, s_R, mg/100 g

0,34

0,14

0,18

0,25

0,30

...

...

...

≤ 8%

≤ 10%

≤ 10%

≤ 10%

≤ 8%

Hệ số biến thiên lặp lại, C_v,r,%

38,5%

25,0%

22,9

...

...

...

20,4%

Giới hạn tái lập trong SMPR

≤ 16%

≤ 20%

≤ 20%

≤ 20%

≤ 16%

Hệ số biến thiên tái lập, C_V,R,%

67,1%

...

...

...

82,7%

156,2%

55,7%

Trị số HorRat

5,3

5,0

5,8

10,5

4,5

...

...

...

^a Không quá 2/9 phòng thử nghiệm loại trừ khỏi phép phân tích thống kê.

Bảng B.6 - Dữ liệu độ chụm đối với mẫu 1 thức ăn công thức cho trẻ sơ sinh chứa whey

Thông số

CMP

UMP

GMP

IMP

AMP

Giá trị

...

...

...

Giá trị

Giá trị

Giá trị

Tổng số phòng thí nghiệm, n

12

12

12

10a

12

...

...

...

24

24

24

18

24

Trung bình tổng các dữ liệu, , mg/100 g

5,47

3,52

1,05

...

...

...

3,51

Độ lệch chuẩn lặp lại, s_r, mg/100 g

0,15

0,05

0,02

n/a

0,06

Độ lệch chuẩn tái lập, s_R, mg/100 g

0,48

...

...

...

0,04

n/a

0,18

Giới hạn lặp lại trong SMPR

≤ 6%

≤ 6%

≤ 6%

n/a

≤ 6%

...

...

...

2,7%

1,5%

2,2%

n/a

1,7%

Giới hạn tái lập trong SMPR

≤ 11%

≤ 11%

≤ 11%

...

...

...

≤ 11%

Hệ số biến thiên tái lập, C_V,R,%

8,7%

8,8%

4,1%

n/a

5,0%

Trị số HorRat

1,0

...

...

...

0,4

n/a

0,5

^a Không quá 2/9 phòng thử nghiệm loại trừ khỏi phép phân tích thống kê.

n/a Không xác định.

Bảng B.7 - Dữ liệu độ chụm đối với mẫu 2 thức ăn công thức cho trẻ sơ sinh chứa whey

Thông số

CMP

UMP

...

...

...

IMP

AMP

Giá trị

Giá trị

Giá trị

Giá trị

Giá trị

Tổng số phòng thí nghiệm, n

11^a

...

...

...

11^a

10^a

11^a

Tổng số phép lặp lại, 2n

22

24

22

22

22

...

...

...

5,43

3,54

1,05

n/a

3,51

Độ lệch chuẩn lặp lại, s_r, mg/100 g

0,09

0,11

0,04

...

...

...

0,05

Độ lệch chuẩn tái lập, s_R, mg/100 g

0,43

0,32

0,05

n/a

0,15

Giới hạn lặp lại trong SMPR

≤ 6%

...

...

...

≤ 6%

n/a

≤ 6%

Hệ số biến thiên lặp lại, C_v,r,%

1,6%

3,2

3,4%

n/a

1,3%

...

...

...

≤ 11%

≤ 11%

≤ 11%

n/a

≤ 11%

Hệ số biến thiên tái lập, C_V,R,%

7,9%

9,0%

5,2%

...

...

...

4,3%

Trị số HorRat

0,9

1,0

0,5

n/a

0,5

^a Không quá 2/9 phòng thử nghiệm loại trừ khỏi phép phân tích thống kê.

n/a Không xác định.

...

...

...

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] GILL B.D., INDYK H.E., KUMAR M.C., SIEVWRIGHT N.K., MANLEY-HARRIS M. A liquid chromatographic method for routine analysis of 5'-mononucleotides in pediatric formulas. J. AOAC Int. 2010, 93 pp. 966-973

[2] GILL B.D., INDYK H.E., MANLEY-HARRIS M. Analysis of nucleosides and nucleotides in infant formula by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Anal. Bioanal. Chem. 2013, 405 pp. 5311-5319

[3] OMA 2011.20, Analysis of Nucleotide 5'-Monophosphates in Infant Formulas by HPLC-UV: Collaborative Study

[4] GILL B.D., INDYK H.E. Analysis of Nucleotide 5'-Monophosphates in Infant Formulas by HPLC-UV: Collaborative Study, Final Action 2011.20. J. AOAC Int. 2015, 98 pp. 971-979

[5] TCVN 6910-2 (ISO 5725-2) Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo. Phần 2: Phương pháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp đo tiêu chuẩn.

[6] AOAC INTERNATIONAL AOAC Official Methods Program, Associate Referee's Manual on development, Study, Review, and Approval Process. Part IV AOAC Guidelines for Collaborative Studies, 1995, pp. 23-51.

[7] AOAC SMPR 2011.008, Standard method performance requirements for nucleotides in infant formula and adult/pediatric nutritional formula

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9515:2017 (ISO 20638:2015) về Thức ăn công thức dành cho trẻ sơ sinh - Xác định các nucleotid bằng sắc ký lỏng