A.6.2.2 Dung dịch chuẩn hỗn hợp gồm melamine (nồng độ từ 0 mg/l đến 0,20 mg/l) và axit xyanuric (nồng độ từ 0 mg/l đến 0,30 mg/l) với các chất chuẩn nội tương ứng (nồng độ 0,10 mg/l)

Chuẩn bị năm dung dịch chuẩn hỗn hợp trong các bình định mức 5 ml (A.5.12) có dải nồng độ melamine từ 0 mg/l đến 0,20 mg/l và nồng độ axit xyanuric từ 0 mg/l đến 0,30 mg/l với nồng độ chất chuẩn nội tương ứng cho cả 2 chất là 0,10 mg/l được nêu trong Bảng A.2.

Dung dịch được bảo quản ở 4 ^oC, tránh ánh sáng.

Bảng A.2 - Hỗn hợp chuẩn melamine và axit xyanuric từ 6 đến 10

Dung dịch chuẩn

6

7

8

...

...

...

10

Dung dịch làm việc melamine III (A.4.6.4), ml

0

25

50

75

100

Dung dịch làm việc axit xyanuric III (A.4.4.4), ml

0

...

...

...

75

100

150

Dung dịch làm việc melamine đánh dấu III (A.4.7.4), ml

50

50

50

50

50

...

...

...

50

50

50

50

50

Dung dịch axetonitril-nước (A.6.1), ml

4900

4825

4775

...

...

...

4650

Tương ứng với:

Nồng độ melamine, ng/ml

0

1

2

3

4

Nồng độ axit xyanuric, ng/ml

...

...

...

2

3

4

6

Nồng độ chất chuẩn nội (melamine hoặc axit xyanuric), ng/ml

2

2

2

2

...

...

...

Hàm lượng melamine (tương ứng trong mẫu), mg/kg

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

Hàm lượng axit xyanuric (tương ứng trong mẫu), mg/kg

0,00

0,10

...

...

...

0,20

0,30

Hàm lượng chất chuẩn nội (melamine và axit xyanuric, tương ứng trong mẫu), mg/kg

0,10

0,10

0,10

0,10

0,10

A.6.3 Dung dịch chạy sắc kí

...

...

...

Chuyển 0,77 g amoni axetat (A.4.3) vào bình định mức 1 000 ml (A.5.12). Hòa tan bằng khoảng 50 ml nước (A.4.1). Thêm nước (A.4.1) đến vạch và trộn. Lọc qua màng lọc 0,22 mm.

A.6.3.2 Pha động B: axetonitril.

Sử dụng axetonitril tinh khiết dùng cho HPLC (A.4.2).

A.7 Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không được quy định trong phụ lục này. Nên lấy mẫu theo TCVN 6400 (ISO 707) ^[1].

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện, không bị hư hại hoặc thay đổi trong quá trình vận chuyển và bảo quản.

Nếu không thể tiến hành phân tích ngay thì bảo quản mẫu sữa bò ở 4 ^oC hoặc đông lạnh.

A.8 Chuẩn bị mẫu thử

A.8.1 Thức ăn công thức dạng bột từ sữa dành cho trẻ sơ sinh

...

...

...

Trộn đều hỗn hợp bằng cách lắc và đảo chiều bình chứa nhiều lần.

A.8.2 Sữa bò

Để mẫu thử về nhiệt độ phòng. Đảo trộn mẫu thử nhiều lần để đảm bảo mẫu được đồng nhất trước khi đem cân phần mẫu thử.

A.9 Cách tiến hành

A.9.1 Quy trình chiết mẫu

Cân 1 g mẫu sữa bò (A.8.2) hoặc thức ăn công thức dạng bột dành cho trẻ sơ sinh (A.8.1), chính xác đến 0,01 g, cho vào ống li tâm 50 ml (A.5.1).

a) Đối với mẫu có hàm lượng melamine và hàm lượng axit xyanuric đến 2 mg/kg, với nồng độ chất chuẩn nội 1 mg/kg, thêm vào phần mẫu thử 50 ml dung dịch làm việc melamine đánh dấu I (A.4.7.2) và 50 ml làm việc axit xyanuric đánh dấu I (A.4.5.2). Trộn đều cho đến khi thể tích thêm vào được hấp thụ hoàn toàn bởi nền mẫu.

b) Đối với mẫu có hàm lượng melamine đến 0,2 mg/kg và hàm lượng axit xyanuric đến 0,3 mg/kg với nồng độ chất chuẩn nội 0,1 mg/kg, thêm vào phần mẫu thử 50 ml chuẩn làm việc melamine đánh dấu II (A.4.7.3) và 50 ml chuẩn làm việc axit xyanuric đánh dấu II (A.4.5.3). Trộn đều cho đến khi thể tích thêm vào được hấp thụ hoàn toàn bởi nền mẫu.

Sau đó, thêm 5 ml nước (A.4.1) vào ống li tâm đã được chuẩn bị ở a) hoặc b). Trộn đều để không tạo cục kết dính. Thêm 5 ml axetonitril (A.4.2). Lắc mạnh trong ít nhất 1 min.

...

...

...

Nếu lớp dịch này không trong thì chuyển phần dịch sang ống li tâm khác và li tâm lại với tốc độ 8500g ở nhiệt độ phòng trong 10 min bằng máy li tâm.

Chuyển khoảng 0,5 ml đến 1 ml dịch trong lọ đựng mẫu HPLC. Sau đó đem phân tích trên LC-MS/MS (A.9.3).

A.9.2 Mẫu trắng thuốc thử

Nếu cần kiểm soát sự nhiễm bẩn melamine và axit xyanuric trong quá trình chiết mẫu, sử dụng mẫu trắng thuốc thử không cho thêm nền mẫu. Phân tích mẫu trắng thuốc thử cùng với mỗi dãy mẫu phân tích hàng ngày.

A.9.3 Điều kiện LC-MS/MS

A.9.3.1 Điều kiện HPLC

Pha động A:

Dung dịch amoni axetat (A.6.3.1)

Pha động B:

...

...

...

Thể tích bơm:

5 ml

Cột sắc kí:

TOSOH TSKgel Amide-80, đường kính 2,0 mm, chiều dài 250 mm, cỡ hạt 5 mm

Nhiệt độ cột:

Nhiệt độ phòng

Tốc độ dòng:

0,25 ml/min

Gradient:

...

...

...

Van chuyển:

Dòng từ HPLC được cho vào detector MS từ 3,0 min đến 13,5 min

Bảng A.3 - Gradient sắc kí lỏng sử dụng để phân tích melamine và axit xyanuric

Thời gian

min

A

%

B

%

...

...

...

10

90

8

10

90

13

65

35

14

...

...

...

10

15

90

10

15,5

10

90

25

10

...

...

...

Trong các điều kiện trên, thời gian lưu của axit xyanuric khoảng 6,4 min và của melamine khoảng 11,5 min (xem Hình A.1 đến Hình A.3).

A.9.3.2 Các thông số về khối phổ

Các thông số khối phổ thu được bằng cách bơm dung dịch làm việc melamine I (A.4.6.2) và dung dịch làm việc axit xyanuric I (A.4.4.2), đều có nồng độ 20 mg/ml, với tốc độ 5 ml/min tốc độ vào dòng HPLC 0,25 ml/min, sử dụng bộ kết nối chữ T. Dòng HPLC có chứa 50 % pha động A (A.6.3.1) và 50 % pha động B (A.6.3.2). Bảng A.4 đến Bảng A.6 đưa ra điều kiện hoạt động của thiết bị để phân tích melamine và axit xyanuric.

Bảng A.4 - Các thông số khối phổ điển hình đối với melamine

Thông số

Biosystems Aciex 4000 QTrap

Kiểu ion hóa

Ion hóa phun điện tử (ESI)

Điện thế dòng phun

...

...

...

Chiều phân cực

Ion hóa dương

Nhiệt độ buồng ion hóa

500 ^oC

Khí

Khí chắn (curtain gas): 69 kPa (10 psi)

Khí nguồn ion 1: 207 kPa (30 psi)

...

...

...

Điện thế bắn phá (DP)

60 V

Điện thế đầu vào (EP)

10 V

Điện thế bắn đầu ra (CXP)

15 V

Áp suất khí bắn phá (SRM)

0,8 Pa (6 mToor), nitơ

Độ rộng chân pic (mỗi chế độ)

...

...

...

Độ phân giải

Unit (cả hai tứ cực)

Thời gian quét

100 ms

Chuyển đổi ion dương/ion âm tại T

8 min

Bảng A.5 - Các thông số MS cho axit xyanuric

Thông số

Biosystems Aciex 4000 QTrap

...

...

...

Ion hóa phun điện tử (ESI)

Điện thế dòng phun

-3,5 kV

Chiều phân cực

Ion hóa âm

Nhiệt độ buồng ion hóa

500 ^oC

Khí

Khí chắn (curtain gas): 69 kPa (10 psi)

...

...

...

Khí nguồn ion 1: 207 kPa (30 psi)

Khí nguồn ion 2: 207 kPa (30 psi)

Điện thế bắn phá (DP)

- 40 V

Điện thế đầu vào (EP)

- 10 V

Điện thế bắn đầu ra (CXP)

- 15 V

...

...

...

0,8 Pa (6 mToor), nitơ

Độ rộng chân pic (mỗi chế độ)

0,7 Th

Độ phân giải

Unit (cả hai tứ cực)

Thời gian quét

100 ms

Chuyển đổi ion dương/ion âm

8 min

...

...

...

Chất phân tích

Phản ứng chuyển khối (m/z)^a để

Tỉ lệ diện tích píc ± giới hạn (%)

Định lượng

Định tính

Melamine

127,0 ® 85,1 (26)

127,0 ® 68,0 (45)

0,28 ± 25

...

...

...

133,0 ® 89,1 (26)

133,0 ® 71,1 (45)

0,19 ± 25

Axit xyanuric

128,0 ® 42,1 (30)

128,0 ® 85,2 (14)

0,55 ± 20

Axit xyanuric đánh dấu [¹³C₃H₃¹⁵N₃O₃] (IS)

134,0 ® 44,1 (30)

...

...

...

0,52 ± 20

^a Năng lượng bắn phá, đo bằng electron volt, được đưa ra trong dấu ngoặc đơn.

CHÚ THÍCH: Tùy vào loại detector MS sử dụng mà tỉ lệ diện tích pic của các phản ứng chuyển khối có thể khác so với số liệu trong Bảng A.6.

A.9.3.3 Phép thử kiểm tra thiết bị

Cần đảm bảo các điều kiện hoạt động của thiết bị LC-MS/MS để đáp ứng yêu cầu của phương pháp. Điều này liên quan đến việc bơm một dung dịch hiệu chuẩn nồng độ thấp (ví dụ dung dịch chuẩn 7, Bảng A.2) để kiểm tra xem độ nhạy của thiết bị có thích hợp không.

A.9.4 Quy trình lập đường chuẩn và phân tích mẫu

Melamine và axit xyanuric được định lượng bằng phương pháp ngoại chuẩn. Bơm các dung dịch chuẩn (A.6.2.1 hoặc A.6.2.2) cho mỗi dãy mẫu phân tích hàng ngày.

A.9.5 Khẳng định

Melamine và axit xyanuric được coi là dương tính trong mẫu thử nếu đáp ứng đầy đủ các tiêu chí từ a) đến c) theo quy định tại Quyết định số 2002/657/EC của Ủy ban châu Âu (Tài liệu tham khảo [8]).

...

...

...

b) Tỉ lệ giữa thời gian lưu sắc kí của chất phân tích với thời gian lưu của chất chuẩn nội tương ứng, nghĩa là thời gian lưu tương đối của chất phân tích, tương ứng với thời gian lưu tương đối trung bình của dung dịch hiệu chuẩn trong dung sai ± 2,5 %.

c) Tỉ lệ diện tích pic giữa các phản ứng chuyển khối khác nhau của mỗi chất phân tích nằm trong khoảng cho phép quy định tại Quyết định số 2002/657/EC của Ủy ban châu Âu (Tài liệu tham khảo [8]), được nêu trong Bảng A.6.

A.10 Tính và biểu thị kết quả

A.10.1 Tính kết quả

Phần mềm thích hợp có thể có hướng dẫn xử lý kết quả, kiểm tra tính tuyến tính của đường chuẩn, tính các tỉ lệ diện tích thu được từ các phản ứng chuyển khối khác nhau (như trong Bảng A.6), để khẳng định sự có mặt của chất phân tích và đưa ra kết quả cuối cùng, biểu thị bằng miligam trên kilogam.

CHÚ THÍCH: Đường chuẩn có dạng:

a = bw + a

Trong đó:

a là tỉ lệ diện tích;

...

...

...

w là phần khối lượng;

a là hệ số tự do.

Tính hàm lượng chất cần phân tích, w_a, bằng miligam trên kilogam (đối với chất phân tích là melamine thì w_a = w_m; chất phân tích là axit xyanuric thì w_a = w_c), theo công thức sau:

Trong đó:

A_a

là diện tích píc của chất phân tích có trong mẫu;

A_IS

là diện tích píc của chất chuẩn nội có trong mẫu;

...

...

...

là hệ số tự do;

b

là độ dốc;

m_IS

là khối lượng chất chuẩn nội thêm vào mẫu thử, tính bằng nanogam (ng) (A.9.1);

m_a

là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam (g) (A.9.1).

A.10.2 Biểu thị kết quả

Biểu thị kết quả đến hai chữ số thập phân.

...

...

...

A.11.1 Độ tuyến tính

Các dải tuyến tính đã thử nghiệm được nêu trong a) và b).

a) Melamine:

tương ứng từ 0 mg/kg đến 0,20 mg/kg và từ 0 mg/kg đến 2,00 mg/kg (hàm lượng tương đương trên nền mẫu).

b) Axit xyanuric:

tương ứng từ 0 mg/kg đến 0,30 mg/kg và từ 0 mg/kg đến 2,00 mg/kg (hàm lượng tương đương trên nền mẫu).

Khi hiệu chuẩn theo mô hình tuyến tính thì độ lặp lại phải được phân bố đều và các tín hiệu đo phải ổn định trong dải nồng độ trên.

A.11.2 Giới hạn phát hiện

LOD (tỉ lệ tín hiệu trên nhiễu bằng 3) của melamine là 0,03 mg/kg và của axit xyanuric là 0,05 mg/kg trên cả hai loại mẫu CM và PIF.

...

...

...

LOQ của melamine là 0,05 mg/kg và của axit xyanuric là 0,10 mg/kg trên cả hai loại mẫu CM và PIF.

A.11.4 Giới hạn quyết định và khả năng phát hiện trên thức ăn công thức từ sữa dành cho trẻ sơ sinh

Giả thiết giới hạn tối đa (ML) là 1 mg/kg trong PIF, thì giới hạn quyết định, w_CCa và khả năng phát hiện, w_CCb­, được nêu trong a) và b).

a) Đối với melamine:

w_CCa = 1,03 mg/kg; w_CCb = 1,05 mg/kg;

b) Đối với axit xyanuric:

w_CCa = 1,04 mg/kg; w_CCb = 1,09 mg/kg.

A.11.5 Độ thu hồi

Đối với cả melamine và axit xyanuric, độ thu hồi đã hiệu chỉnh bằng chất chuẩn nội nằm trong khoảng 99 % đến 116 %.

...

...

...

Giá trị về giới hạn lặp lại tương đối và giới hạn tái lập nội bộ phòng thử nghiệm thu được từ các nghiên cứu liên phòng thử nghiệm quy mô nhỏ theo TCVN 6910-1 (ISO 5725-1) và TCVN 6910-2 (ISO 5725-2) ^[5], nhưng không đáp ứng tất cả các yêu cầu của các tiêu chuẩn này.

A.11.6.1 Giới hạn lặp lại tương đối

Giá trị giới hạn lặp lại tương đối thu được bằng cách sử dụng quy trình mô tả trong phương pháp này được trình bày trong Bảng A.7.

Bảng A.7 - Giá trị độ lặp lại tương đối điển hình

Chất phân tích

Nền mẫu

Giá trị độ lặp lại tương đối

%

Khoảng nồng độ

...

...

...

CM

6

0,05 đến 0,15

Melamine

PIF

12

0,05 đến 0,15

...

...

...

4

0,5 đến 1,5

CM

8

0,1 đến 0,2

Axit xyanuric

PIF

11

...

...

...

PIF

5

0,5 đến 1,5

A.11.6.2 Giới hạn tái lập nội bộ phòng thử nghiệm

Giá trị giới hạn tái lập phòng thử nghiệm thu được bằng cách sử dụng quy trình mô tả trong phương pháp này được trình bày trong Bảng A.8.

Bảng A.8 - Giá trị tái lập tương đối nội bộ phòng thử nghiệm điển hình

Chất phân tích

Nền mẫu

...

...

...

%

Khoảng nồng độ

mg/kg

CM

13

0,05 đến 0,15

Melamine

PIF

...

...

...

0,05 đến 0,15

PIF

6

0,5 đến 1,5

CM

10

0,1 đến 0,2

...

...

...

PIF

31

0,1 đến 0,2

PIF

13

0,5 đến 1,5

A.12 Sắc đồ mẫu

...

...

...

Hình A.2 - Ví dụ về sắc đồ LC-MS/MS của melamine (MEL) và axit xyanuric (CA) từ dịch chiết mẫu thức ăn công thức dạng bột từ sữa dành cho trẻ sơ sinh thêm chuẩn ở mức: MEL = 0,05 mg/kg (IS = 0,1 mg/kg), CA = 0,1 mg/kg (IS = 0,1 mg/kg)

Hình A.3 - Ví dụ về sắc đồ LC-MS/MS của melamine (MEL) và axit xyanuric (CA) từ dịch chiết mẫu thức ăn công thức từ sữa dành cho trẻ sơ sinh thêm chuẩn ở mức: MEL = 0,5 mg/kg (IS = 0,1 mg/kg), CA = 0,5 mg/kg (IS = 0,1 mg/kg)

A.13 Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm của phương pháp A phải bao gồm ít nhất các thông tin sau:

a) tất cả thông tin cần thiết để nhận dạng đầy đủ mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu được sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử được sử dụng, viện dẫn phụ lục này [Phụ lục A của TCVN 9048 (ISO/TS 15495)];

...

...

...

e) kết quả thử nghiệm thu được;

f) kết quả cuối cùng thu được, nếu kiểm tra độ lặp lại.

Phụ lục B

(Tham khảo)

Ví dụ B - Phân tích định lượng melamine và axit xyanuric trong thức ăn công thức từ sữa dành cho trẻ sơ sinh và sữa bò bằng sắc kí lỏng sử dụng khối phổ bẫy ion tuyến tính

B.1 Phạm vi áp dụng

Phụ lục này quy định phương pháp xác định melamine và axit xyanuric trong thức ăn công thức từ sữa dành cho trẻ sơ sinh và trong sữa bò bằng phương pháp khối phổ hai lần (LC-MS/MS) bẫy ion tuyến tính với nguồn ion hóa phun điện tử và chế độ theo dõi phản ứng được chọn (SRM). Định lượng bằng cách dùng dung dịch đồng vị (¹³C, ¹⁵N)-melamine và đồng vị (¹³N, ¹⁵C)-axit xyanuric làm chất chuẩn nội (IS).

B.2 Thuật ngữ và định nghĩa

...

...

...

B.3 Nguyên tắc

Melamine và axit xyanuric được chiết đồng thời bằng axetonitril cùng lúc với kết tủa protein. Sau khi li tâm, lớp trên được tiếp tục phân tích bằng LC-MS/MS bẫy ion ở chế độ SRM. Melamine và axit xyanuric được phân tích riêng biệt lần lượt ở hai chế độ ion dương và ion âm.

B.4 Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác và sử dụng nước cất hoặc nước đã loại kháng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương.

CHÚ THÍCH: Số CAS được cung cấp cho mỗi thuốc thử.

Trước khi sử dụng hóa chất, cần tuân theo hướng dẫn hoặc thủ tục đảm bảo an toàn được quy định bởi cơ quan có thẩm quyền.

B.4.1 Nước, dùng cho sắc kí (số CAS 7732-18-5).

B.4.2 Axetonitril (CH₃CN), loại dùng cho sắc kí lỏng (số CAS 75-05-8).

B.4.3 Amoni axetat (CH₃COONH₄), tinh khiết phân tích (số CAS 631-61-8).

...

...

...

Dùng pipet lấy 10 ml axit formic (số CAS 64-18-6, tinh khiết phân tích) cho vào bình định mức 1000 ml (B.5.8). Thêm nước (B.4.1) đến vạch và trộn.

B.4.5 Axit xyanuric [(CHOH)₃], độ tinh khiết lớn hơn 98 % khối lượng (số CAS 108-80-5)

B.4.5.1 Dung dịch chuẩn gốc axit xyanuric, nồng độ 0,1 mg/ml

Cân 20 mg axit xyanuric (B.4.5), chính xác đến 0,1 mg, cho vào bình định mức 200 ml (B.5.8). Hòa tan và thêm dung dịch axit formic (B.4.4) đến vạch. Siêu âm 10 min cho tan hoàn toàn.

Dung dịch chuẩn gốc axit xyanuric có thể bảo quản được 10 ngày ở 4^oC. Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc mới sau 10 ngày.

B.4.5.2 Dung dịch làm việc axit xyanuric, nồng độ 10 mg/ml

Dùng pipet lấy 10 ml dung dịch chuẩn gốc axit xyanuric (B.4.5.1) vào bình định mức 100 ml (B.5.8). Thêm dung dịch axit formic (B.4.4) đến vạch. Siêu âm ít nhất 10 min cho tan hoàn toàn.

Dung dịch làm việc axit xyanuric có thể bảo quản được 10 ngày ở 4^oC. Chuẩn bị dung dịch làm việc mới sau 10 ngày.

B.4.6 Axit xyanuric đánh dấu (¹³C₃H₃¹⁵N₃O₃), độ tinh khiết đồng vị: ¹³C₃ = 99 %; vòng ¹⁵N₃ > 98%; độ tinh khiết hóa học > 90 % khối lượng, nồng độ 100 mg/ml - 1,2 ml.

...

...

...

Dung dịch chuẩn gốc axit xyanuric đánh dấu có thể được mua từ Cambridge Isotope Laboratories5) (độ tinh khiết 90% khối lượng). Bảo quản ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng.

B.4.6.2 Dung dịch làm việc axit xyanuric đánh dấu, nồng độ 10 mg/ml

Dùng pipet lấy 1,1 ml dung dịch chuẩn gốc axit xyanuric đánh dấu (B.4.6.1) vào bình định mức 10 ml (B.5.8). Thêm dung dịch axit formic (B.4.4) đến vạch và trộn.

Dung dịch làm việc axit xyanuric đánh dấu được sử dụng làm chất chuẩn nội (IS). Bảo quản dung dịch ở 4 ^oC.

B.4.7 Melamine (C₃H₆N₆), > 98 % khối lượng (số CAS 108-78-1)

B.4.7.1 Dung dịch chuẩn gốc melamine, nồng độ 0,1 mg/ml.

Cân 20 mg melamine (B.4.7), chính xác đến 0,1 mg, vào bình định mức 200 ml (B.5.8). Hòa tan và thêm dung dịch axit formic (B.4.4) đến vạch. Siêu âm ít nhất 10 min cho tan hoàn toàn.

Dung dịch chuẩn gốc melamine có thể bảo quản được 10 ngày ở 4^oC. Chuẩn bị dung dịch chuẩn làm việc mới sau 10 ngày.

B.4.7.2 Dung dịch làm việc melamine I, nồng độ 10 mg/ml.

...

...

...

Dung dịch làm việc melamine I có thể bảo quản được 10 ngày ở 4^oC. Chuẩn bị dung dịch làm việc mới sau 10 ngày.

B.4.7.3 Dung dịch làm việc melamine II, nồng độ 1 mg/ml.

Dùng pipet lấy 10 ml dung dịch làm việc melamine I (B.4.7.2) vào bình định mức 100 ml (B.5.8). Thêm dung dịch axit formic (B.4.4) đến vạch. Siêu âm ít nhất 10 min cho hòa tan hoàn toàn.

Dung dịch làm việc melamine II có thể bảo quản được 10 ngày ở 4^oC. Chuẩn bị dung dịch làm việc mới sau 10 ngày.

B.4.8 Melamine đánh dấu [¹³C₃N₃(¹⁵NH₂)₃], độ tinh khiết đồng vị: ¹³C₃ = 99%, amino-¹⁵N₃ = 98%; độ tinh khiết hóa học ≥ 98 % khối lượng, 100 mg/ml trong nước - 1,2 ml.

B.4.8.1 Dung dịch chuẩn gốc melamine đánh dấu, nồng độ 100 mg/ml.

Dung dịch chuẩn gốc melamine đánh dấu được bán sẵn. Bảo quản dung dịch ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng.

B.4.8.2 Dung dịch làm việc melamine đánh dấu, nồng độ 10 mg/ml.

Dùng pipet lấy 1 ml dung dịch chuẩn gốc melamine đánh dấu (B.4.8.1) vào bình định mức 10 ml (B.5.8). Thêm dung dịch axit formic (B.4.4) đến vạch và trộn.

...

...

...

B.5 Thiết bị, dụng cụ

Dụng cụ thủy tinh (ví dụ bình định mức, B.5.8) dùng để chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc và dung dịch làm việc có thể bị nhiễm bẩn, đặc biệt là nhiễm melamine. Vì thế, tất cả dụng cụ cần được rửa sạch bằng chất tẩy rửa phòng thử nghiệm, tráng bằng nước cất và làm khô trong không khí.

Sử dụng các thiết bị của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

B.5.1 Ống li tâm, hình trụ, bằng polypropylen, dung tích 50 ml, ví dụ 21008-1696).

B.5.2 Máy li tâm, có rotor thích hợp với ống 50 ml và gia tốc góc 4 000g, ví dụ RC67).

B.5.3 Cột HPLC, ZIC-HILIC8), 2,1 mm x 150 mm, 5 mm, 20 nm.

B.5.4 Xyranh bằng nhựa, dung tích 3 ml, Norm-Ject⁶⁾.

B.5.5 Bộ lọc dạng xyranh, loại đĩa 13 mm, màng nylon 0,2 mm, ví dụ 28143-985⁶⁾.

B.5.6 Bơm HPLC Surveyor MS9) nối với khối phổ bẫy ion tuyến tính LTQ-XL⁹⁾, được trang bị nguồn ion hóa phun điện tử.

...

...

...

B.5.8 Bình định mức, dung tích 10 ml, 100 ml, 200 ml và 1 000 ml, TCVN 7153 (ISO 1042)^[3], loại A.

B.6 Chuẩn bị thuốc thử

B.6.1 Đường chuẩn của melamine và axit xyanuric

B.6.1.1 Dung dịch chuẩn melamine (0 mg/l đến 5 ml/l) với chất chuẩn nội tương ứng (ở mức 1,00 mg/l)

Chuẩn bị dung dịch chuẩn melamine vào 6 bình định mức dung tích 10 ml riêng biệt (B.5.8) như trong Bảng B.1. Bảo quản các dung dịch ở 4^oC.

Bảng B.1 - Dung dịch chuẩn melamine

Dung dịch chuẩn

1

...

...

...

3

4

5

6

Dung dịch làm việc melamine I (B.4.7.2), ml

0

0

100

200

...

...

...

700

Dung dịch làm việc melamine II (B.4.7.3), ml

0

150

0

0

0

0

Dung dịch melamine đánh dấu (IS) (B.4.8.2), ml

...

...

...

150

150

150

150

150

Axetonitril (B.4.2), ml

9850

9700

9750

...

...

...

9400

9150

Tương ứng với

Nồng độ melamine, ng/ml

0

15

100

200

450

...

...

...

Nồng độ melamine đánh dấu (IS), ng/ml

150

150

150

150

150

150

Hàm lượng melamine (tương ứng trong mẫu), mg/kg

0,00

...

...

...

0,66

1,33

3,00

4,66

Hàm lượng chất chuẩn nội melamine (tương ứng trong mẫu), mg/kg

1,00

1,00

1,00

1,00

...

...

...

1,00

B.6.1.2 Dung dịch chuẩn axit xyanuric (0 mg/l đến 5 ml/l) với chất chuẩn nội axit xyanuric tương ứng (ở mức 0,66 mg/l)

Chuẩn bị dung dịch chuẩn axit xyanuric vào 6 bình định mức riêng biệt (B.5.8) như trong Bảng B.1. Bảo quản các dung dịch ở 4^oC.

Bảng B.2 - Dung dịch chuẩn axit xyanuric

Dung dịch chuẩn

1

2

3

...

...

...

5

6

Dung dịch chuẩn làm việc axit xyanuric (B.4.5.2), ml

0

25

100

200

550

700

...

...

...

100

100

100

100

100

100

Axetonitril (B.4.2), ml

9900

9875

...

...

...

9700

9350

9200

Tương ứng với:

Nồng độ axit xyanuric, ng/ml

0

25

100

200

...

...

...

700

Nồng độ axit xyanuric đánh dấu (IS), ng/ml

100

100

100

100

100

100

Hàm lượng axit xyanuric (tương ứng trong mẫu), mg/kg

...

...

...

0,17

0,66

1,33

3,66

4,66

Hàm lượng chất chuẩn nội axit xyanuric (tương ứng trong mẫu), mg/kg

0,66

0,66

0,66

...

...

...

0,66

0,66

B.6.2 Dung môi sắc kí

B.6.2.1 Pha động A, dung dịch amoni axetat, nồng độ 10 mmol/l trong hỗn hợp axetonitril và nước (1:1).

Chuyển 0,77 g amoni axetat vào bình định mức 1 000 ml (B.5.8). Thêm 500 ml nước (B.4.1) và hòa tan amoni axetat. Thêm axetonitril (B.4.2) đến vạch và trộn. Lọc dung dịch qua màng lọc 0,22 mm.

B.6.2.2 Pha động B, axetonitril.

Sử dụng axetonitril (B.4.2).

B.7 Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không phải là một phần của phương pháp mô tả trong phụ lục này. Nên lấy mẫu theo TCVN 6400 (ISO 707)^[1].

...

...

...

Bảo quản sữa tươi ở 4 ^oC nếu không thực hiện phân tích ngay sau khi nhận mẫu.

B.8 Chuẩn bị phần mẫu thử

B.8.1 Thức ăn công thức từ sữa dành cho trẻ sơ sinh

Đảm bảo mẫu phòng thử nghiệm được đồng nhất bằng cách chuyển vào bình chứa có dung tích lớn gấp hai lần dung tích mẫu. Đậy kín ngay bình. Trộn đều bằng cách lắc kỹ và dốc ngược bình chứa.

B.8.2 Sữa bò

Giữ mẫu ở nhiệt độ phòng. Đảm bảo mẫu đồng nhất trước khi cân bằng cách quay ngược bình nhiều lần.

B.9 Cách tiến hành

B.9.1 Quy trình chiết

Cân 3,00 g thức ăn công thức từ sữa dành cho trẻ sơ sinh (B.8.1) hoặc sữa bò (B.8.2), chính xác đến 0,01 g, cho vào ống li tâm 50 ml (B.5.1). Thêm 300 ml dung dịch làm việc melamine đánh dấu (IS) (B.4.8.2). Thêm 200 ml dung dịch làm việc axit xyanuric đánh dấu (IS) (B.4.6.2). Sau đó thêm 19,5 ml axetonitril (B.4.2) và lắc kỹ để đảm bảo không tạo cục kết dính.

...

...

...

B.9.2 Điều kiện LC-MS/MS

Bơm dung dịch mẫu vào LC-MS/MS để phân tích.

CHÚ THÍCH: Melamine và axit xyanuric được phát hiện riêng biệt bằng các lần phân tích LC-MS khác nhau.

B.9.2.1 Điều kiện HPLC

Pha động A:

Dung dịch amoni axetat (B.6.2.1)

Pha động B:

Axetonitrile (B.6.2.2)

Thể tích bơm:

...

...

...

Cột sắc kí:

ZIC-HILIC, 2,1 mm x 150 mm, 5 mm, 20 nm

Nhiệt độ cột:

Nhiệt độ phòng

Tốc độ dòng:

0,4 ml/min

Gradient:

Xem Bảng B.3

Van chuyển:

...

...

...

Bảng B.3 - Gradient sắc kí lỏng sử dụng để phân tích melamine hoặc axit xyanuric

Thời gian

min

A

%

B

%

0

3

...

...

...

2

3

97

2,5

20

80

11

20

80

...

...

...

3

97

16

30

97

Điều kiện HPLC đối với melamine và axit xyanuric là giống nhau. Trong các điều kiện này, thời gian lưu của cả melamine và axit xyanuric là khoảng 5 min.

B.9.2.1 Các thông số về khối phổ

Hiệu chuẩn chất phân tích bằng cách dùng xyranh bơm dung dịch chuẩn melamine và dung dịch chuẩn axit xyanuric nồng độ 10 mg/ml. Giữ tốc độ bơm của xyranh không đổi 5 ml/min bằng van nối chữ T với tốc độ dòng HPLC là 0,4 ml/min. Giữ tỉ lệ dòng HPLC là 20 % pha động A và 80 % pha động B. Các điều kiện vận hành MS cho phân tích melamine và axit xyanuric được liệt kê trong Bảng B.4 đến Bảng B.6.

Bảng B.4 - Các thông số khối phổ điển hình đối với melamine

...

...

...

Bẫy ion tuyến tính LTQ-XL

Kiểu ion hóa

Ion hóa phun điện tử (ESI)

Điện thế dòng phun

5 kV

Chiều phân cực

Ion hóa dương

Nhiệt độ ống chuyển

350 ^oC

...

...

...

Khí mang: 60 đơn vị tùy ý

Khí bổ trợ: 20 đơn vị tùy ý

Khí làm sạch: 0

Dòng điện phun

5,6 mA

Điện thế mao quản

20 V

...

...

...

100 ms

Bảng B.5 - Các thông số khối phổ điển hình đối với axit xyanuric

Thông số

Bẫy ion tuyến tính LTQ-XL

Kiểu ion hóa

Ion hóa phun điện tử (ESI)

Điện thế dòng phun

- 4 kV

Chiều phân cực

...

...

...

Nhiệt độ ống chuyển

400 ^oC

Khí

Khí mang: 60 đơn vị tùy ý

Khí bổ trợ: 20 đơn vị tùy ý

Khí làm sạch: 0

Dòng điện phun

...

...

...

Điện thế mao quản

- 14 V

Thời gian bơm mẫu tối đa

100 ms

Bảng B.6 - Các phản ứng chuyển khối xảy ra trong bẫy ion đối với phân tích melamine, axit xyanuric và các chất chuẩn nội tương ứng

Chất phân tích

Phản ứng chuyển khối (m/z)^a:

Melamine

127,1 ® 85,1 (24)

...

...

...

133,1 ® 89,1 (24)

Axit xyanuric

128,0 ® 85,0 (24)

Axit xyanuric đánh dấu (¹³C₃H₃¹⁵N₃O₃) (IS)

134,0 ® 88,9 (24)

^a Năng lượng va chạm, đo bằng electron vôn, được đưa ra trong dấu ngoặc đơn

B.10 Tính và biểu thị kết quả

B.10.1 Tính kết quả

CHÚ THÍCH: Đường chuẩn có dạng:

...

...

...

Trong đó:

a là tỉ lệ diện tích;

b là độ dốc;

w là phần khối lượng;

a là hệ số tự do.

Tính hàm lượng chất cần phân tích, w_a, bằng miligam trên kilogam (nếu chất phân tích là melamine: w_a = w_m; chất phân tích là axit xyanuric w_a = w_c) theo công thức sau:

Trong đó:

a là tỉ lệ diện tích peak của chất phân tích và diện tích peak của chất chuẩn nội (IS) sau khi phân tích bằng LC/MS;

...

...

...

b là độ dốc;

m là khối lượng của phần mẫu thử (B.9.1), tính bằng gam (g).

B.10.2 Biểu thị kết quả

Biểu thị kết quả phân tích đến hai chữ số thập phân.

B.11 Các đặc tính hiệu năng

B.11.2 Độ tuyến tính

Đường chuẩn melamine tuyến tính trong khoảng từ 0 mg/kg đến 5 mg/kg (hàm lượng tương đương trong mẫu). Tương tự với axit xyanuric là từ 0 mg/kg đến 7 mg/kg (hàm lượng tương đương trong mẫu).

B.11.2 Độ thu hồi

Tổng số có 16 mẫu thức ăn công thức từ sữa dành cho trẻ sơ sinh đã được thêm melamine và axit xyanuric với các mức gấp 0,1; 0,5; 1 và 1,5 lần mức tối đa (ML).

...

...

...

B.11.3 Giới hạn phát hiện (LOD)

Giới hạn phát hiện (tỉ lệ tín hiệu trên nhiễu bằng 3) của melamine trong thức ăn công thức từ sữa dành cho trẻ sơ sinh là 0,08 mg/kg và trong sữa bò là 0,07 mg/kg.

Giới hạn phát hiện của axit xyanuric trong thức ăn công thức từ sữa dành cho trẻ sơ sinh là 0,10 mg/kg và trong sữa bò 0,07 mg/kg.

B.11.4 Giới hạn định lượng (LOQ)

Giới hạn định lượng (mức thấp nhất đã được xác nhận giá trị sử dụng) của melamine trong thức ăn công thức từ sữa dành cho trẻ sơ sinh là 0,11 mg/kg và trong sữa bò là 0,10 mg/kg.

Giới hạn định lượng của melamine trong thức ăn công thức từ sữa dành cho trẻ sơ sinh là 0,13 mg/kg và trong sữa bò 0,10 mg/kg.

B.11.5 Giới hạn quyết định và khả năng phát hiện melamine và axit xyanuric trong thức ăn công thức từ sữa dành cho trẻ sơ sinh và trong sữa bò

Giả thiết giới hạn tối đa (ML) là 1 mg/kg trong thức ăn công thức từ sữa dành cho trẻ sơ sinh, giới hạn quyết định, w_CCa , và khả năng phát hiện, w_CCb­ , được tính bằng cách thêm chuẩn vào 20 mẫu thức ăn công thức từ sữa dành cho trẻ sơ sinh ở giới hạn tối đa 1 mg/kg, cho kết quả nêu trong a) và b):

a) Đối với melamine:

...

...

...

b) Đối với axit xyanuric:

w_CCa = 1,11 mg/kg; w_CCb = 1,19 mg/kg.

CẢNH BÁO: Các giá trị trên thu được trong các điều kiện lặp lại và cần được kiểm tra độ tái lập trước khi sử dụng các giá trị này.

B.11.6 Độ chụm

B.11.6.1 Độ lặp lại

Độ lặp lại điển hình thu được từ cùng một người phân tích trong cùng một phòng thử nghiệm, sử dụng phương pháp này là:

a) Đối với melamine:

8 % nằm ngoài dải hàm lượng từ 0,5 mg/kg đến 1,5 mg/kg;

b) Đối với axit xyanuric:

...

...

...

CHÚ THÍCH: Các giá trị này được tính theo hệ số biến thiên độ lặp lại, C_V,r, cho một dãy các phân tích. Ba dãy phân tích được tiến hành ở các mức 0,5 mg/kg, 1 mg/kg và 1,5 mg/kg. Trong ba trường hợp này, giá trị C_V,r cho mỗi dãy là 8 % đối với chất phân tích là melamine và 9 % đối với chất phân tích là axit xyanuric.

B.11.6.2 Độ tái lập

Chưa xác định.

B.12 Sắc kí đồ của mẫu

Xem Hình B.1 và Hình B.2.

Hình B.1 - Sắc kí đồ chạy LC-MS/MS của melamine (MEL) từ dịch chiết mẫu thức ăn công thức từ sữa dành cho trẻ sơ sinh NIST với mức thêm chuẩn: MEL = 0,50 mg/kg

Hình B.2 - Sắc kí đồ chạy LC-MS/MS của axit xyanuric (CA) trong mẫu thức ăn công thức từ sữa dành cho trẻ sơ sinh ở mức thêm chuẩn: CA = 0,50 mg/kg

...

...

...

Báo cáo thử nghiệm của phương pháp B phải bao gồm ít nhất các thông tin sau:

a) tất cả thông tin cần thiết để nhận dạng đầy đủ mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu được sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử được sử dụng, viện dẫn phụ lục này [Phụ lục B của TCVN 9048 (ISO/TS 15495)];

d) tất cả các chi tiết vận hành không được quy định trong phụ lục này, hoặc được coi là tùy chọn, cùng với chi tiết về bất kì sự cố nào có thể ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm;

e) kết quả thử nghiệm thu được;

f) kết quả cuối cùng thu được, nếu kiểm tra độ lặp lại.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

...

...

...

[2] TCVN 7150 (ISO 835), Dụng cụ thí nghiệm bằng thủy tinh - Pipet chia độ

[3] TCVN 7153 (ISO 1042), Dụng cụ thí nghiệm bằng thủy tinh - Bình định mức

[4] TCVN 8488 (ISO 4788), Dụng cụ thí nghiệm bằng thủy tinh - Ống đong chia độ

[5] TCVN 6910-2 (ISO 5725-2), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 2: Phương pháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp đo tiêu chuẩn

[6] ISO 8655-2, Piston-operated volumetric apparatus - Part 2: Piston pipettes

[7] ISO 11843-5, Capability of detection - Part 5: Methodology in the linear and non-linear calibration cases

[8] Commission Decision 2002/657/EC, 2002, Official Journal of the European Communities, L221, 8-36, 12 August 2002, implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results, last amended by Commission Decision 2005/34 of 11 January 2005

[9] SANCO/2004/276rev4, Guidelines for the implementation of decision 2002/657/EC, 2008-12

[10] DESMARCHELIER, A., GUILLAMON CUADRA, M., DELATOUR, T., MOTTIER, P. Simultaneous quantitative determination of melamine and axit xyanuric in cow's milk and milk-based infant formula by liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry. J. Agric. Food Chem. 2009, 57, pp. 7186-7193

...

...

...

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9048:2012 (ISO/TS 15495:2010) về sữa, sản phẩm sữa và thức ăn công thức dành cho trẻ sơ sinh - Hướng dẫn định lượng melamine và axit xyanuric bằng sắc ký lỏng- khối phổ hai lần (LC-MS/MS)