Bảng 2 – Ví dụ về bố trí thử nghiệm 2 – Các chất chuẩn

Số ống

0      2

3      4

5      6

7      8

9    10

11   12

13   14

...

...

...

17   18

19   20

21   22

23   24

25   26

27   28

Nước, ml

4

4

...

...

...

...

...

...

Chất chuẩn PN (2 ng/ml), ml

1

2

3

4

...

...

...

Nanogam PN mỗi ống

...

...

...

4

6

8

...

...

...

Nanogam PN (1 ng/ml), ml

1

...

...

...

3

4

Nanogam PN mỗi ống

...

...

...

1

2

3

4

...

...

...

Chất chuẩn PN (0,5 ng/ml), ml

...

...

...

1

2

3

4

Nanogam PN mỗi ống

...

...

...

0,5

1

...

...

...

2

Nước, ml

1

1

4

3

2

1

4

...

...

...

2

1

4

3

2

1

Môi trường phân tích đậm đặc gấp hai lần, ml

5

5

...

...

...

5

5

5

5

5

5

5

5

5

...

...

...

5

Tổng thể tích, ml

10

10

10

10

10

10

10

...

...

...

10

10

10

10

10

10

6.3.2. Bố trí thử nghiệm – Chất chiết mẫu thử

Tùy thuộc vào quy mô phân tích, dùng pipet lấy một lượng thích hợp của dịch chiết mẫu thử (6.2), lặp lại hai lần, cho vào các ống nghiệm như mô tả trong Bảng 3 và Bảng 4. Điều này phải phù hợp với quy mô được sử dụng đối với các chất chuẩn (6.3.1). Các chất chuẩn và mẫu phải được phân tích ở cùng một thời điểm và trong cùng các điều kiện. Độ pha loãng của dịch chiết mẫu phụ thuộc vào quy mô phân tích được sử dụng và phải được xác định sao cho đồ thị về tốc độ phát triển vi sinh vật của chất chuẩn.

...

...

...

Số lượng ống nghiệm

29 – 30

31 – 32

33 – 34

35 – 36

Dịch chiết mẫu thử

0,10 ml

0,20 ml

0,30 ml

...

...

...

Môi trường phân tích

9,9 ml

9,8 ml

9,7 ml

9,6 ml

Bảng 4 – Ví dụ về bố trí thử nghiệm 2 – Dung dịch mẫu thử

Số ống nghiệm

29 – 30

31 – 32

...

...

...

35 – 36

Dịch chiết mẫu thử

1,0 ml

2,0 ml

3,0 ml

4,0 ml

Nước

4,0 ml

3,0 ml

...

...

...

1,0 ml

Môi trường phân tích nồng độ kép

5,0 ml

5,0 ml

5,0 ml

5,0 ml

Mô hình này được lặp lại trong các ống nghiệm tiếp theo đối với các mẫu.

6.3.3. Tiệt trùng chuẩn và dịch chiết mẫu thử

Đậy nắp tất cả các ống nghiệm (từ 6.3.1 và 6.3.2) để tránh nhiễm khuẩn và hấp áp lực tất cả các ống nghiệm ở 121 ^oC trong 5 min. Làm nguội nhanh các ống nghiệm dưới dòng nước lạnh đến nhiệt độ môi trường.

...

...

...

Cấy một cách vô trùng vào từng ống nghiệm, sử dụng pipet vô trùng hoặc dụng cụ tương tự bổ sung 100 μl chủng cấy (4.3.2), trừ các ống nghiệm 1 và 2 chứa mẫu trắng không cấy. Trộn các lượng chứa trong mỗi ống sau khi cấy. Trước khi cấy, nhiệt độ của lượng các lượng chứa trong ống nghiệm phải thấp hơn 30 ^oC.

6.3.5. Ủ ấm

Ủ ấm ống nghiệm ở 30 ^oC ± 0,5 ^oC trong khoảng từ 18 h đến 24 h trong nồi cách thủy. Nên sử dụng nồi cách thủy có bộ phận lắc.

Làm nguội các ống nghiệm dưới dòng nước lạnh sau khi ủ và trước khi đọc mật độ quang.

6.3.6. Đo mật độ quang

Trộn lượng chứa trong mỗi ống (ví dụ bằng máy trộn vortex) và đo mật độ quang trong vùng quang phổ nhìn thấy (ví dụ ở bước sóng từ 550 nm đến 600 nm). Điều này có thể thực hiện được bằng cách đo trực tiếp các ống nghiệm trong các máy đo phổ thích hợp, chuyển một lượng môi trường phân tích vào cuvet và đo, hoặc sử dụng quy trình tự động hóa. Các tấm microtitre được đọc thông qua máy đọc tấm microtitre tự động. Khoảng thời gian từ khi trộn ống nghiệm đến khi đo mật độ quang phải chuẩn hóa đối với tất cả các ống nghiệm.

7. Tính kết quả

7.1. Hiệu chuẩn

Các dữ liệu kép cần thu được đối với tất cả các chất chuẩn. Mẫu trắng không nuôi cấy phải trong. Các mẫu trắng đã có chủng cấy cũng phải trong hoặc chỉ hơi đục. Nếu các mẫu trắng đã cấy đạt yêu cầu thì đọc độ hấp thụ của các ống còn lại. Dựng đồ thị độ hấp thụ của từng ống dựa vào nồng độ của chất chuẩn trong ống phân tích tương ứng và dựng đường chuẩn. Phụ lục A thể hiện đường chuẩn điển hình thu được.

...

...

...

Ở mỗi độ pha loãng phải được đo hai lần lặp lại. Nội suy lượng chất phân tích trong mẫu thử từ đường chuẩn. Việc tính toán có thể được tính thủ công hoặc sử dụng chương trình máy tính thích hợp.

7.3. Tính phần khối lượng vitamin B₆ trong mẫu thử

Tính phần khối lượng của vitamin B₆, ρ, bằng miligam trên 100 g (mg/100 g) mẫu thử theo Công thức (2):

                                                  (2)

Trong đó:

m_B6          là lượng vitamin B₆ trong ống phân tích tại mức pha loãng dung dịch mẫu thử (trung bình của hai lần đọc), tính bằng nanogram (ng);

V_s                        là tổng thể tích cuối cùng của dung dịch mẫu thử (6.2), tính bằng mililít (ml);

V_ts           là tổng thể tích của dung dịch mẫu thử được lấy bằng pipet cho vào ống phân tích, tính bằng mililít (ml);

m_s           là khối lượng phần mẫu thử được lấy để phân tích, tính bằng gam (g);

...

...

...

10⁶           là hệ số để thu được kết quả tính bằng miligam (chuyển đổi từ nanogam).

Tính kết quả vitamin B₆ trong mẫu thử từ giá trị trung bình của tất cả các mức pha loãng, tính bằng miligam trên 100 g. Kết quả được biểu thị bằng hoạt độ vi sinh liên quan đến pyridoxin hydroclorua (4.4) được sử dụng để hiệu chuẩn.

Các phép tính trong 7.3 có thể thực hiện đồng thời với các thao tác trong 7.1 và 7.2 sử dụng một chương trình máy tính phù hợp.

8. Các tiêu chí để chấp nhận dữ liệu

Các tiêu chí để chấp nhận dữ liệu có thể phụ thuộc vào quy mô phân tích và phải được thiết lập trong mỗi phòng thí nghiệm. Ít nhất các tiêu chí dưới đây cần được xem xét.

a) độ đục tối đa của các dung dịch mẫu trắng đã được cấy;

b) độ đục tối thiểu của các dung dịch hiệu chuẩn đậm đặc nhất;

c) dao động giữa các giá trị độ hấp thụ lặp lại thu được ở mỗi mức hiệu chuẩn;

d) dao động các lượng vitamin B₆ tính được theo pyridoxine giữa tất cả các mức pha loãng của dung dịch mẫu thử;

...

...

...

9. Độ chụm

9.1. Tóm tắt thống kê

Các chi tiết của phép thử nghiệm liên phòng về độ chụm của phương pháp được đưa ra trong Phụ lục B. Các giá trị thu được từ phép thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng cho các dải nồng độ và các chất nền khác được đưa ra trong Phụ lục B.

9.2. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử độc lập, đơn lẻ thu được trên vật liệu thử giống hệt nhau sử dụng cùng thiết bị, thực hiện trong một khoảng thời gian ngắn, không được quá 5% các trường hợp vượt quá giới hạn lặp lại r.

Các giá trị pyridoxin tính bằng miligam trên 100 g chất khô:

Bột mì nguyên cám

= 0,45 mg/100 g

r = 0,08 mg/100 g

...

...

...

 = 0,65 mg/100 g

r = 0,11 mg/100 g

Rau trộn

 = 0,46 mg/100 g

r = 0,07 mg/100 g

Gan lợn

= 1,87 mg/100 g

r = 0,50 mg/100 g

9.3. Độ tái lập

...

...

...

Bột mì nguyên cám

= 0,45 mg/100 g

R = 0,36 mg/100 g

Sữa bột

 = 0,65 mg/100 g

R = 0,29 mg/100 g

Rau trộn

 = 0,46 mg/100 g

R = 0,29 mg/100 g

...

...

...

= 1,87 mg/100 g

R = 1,37 mg/100 g

10. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm ít nhất phải bao gồm các thông tin sau đây:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) viện dẫn tiêu chuẩn này hoặc phương pháp thử đã sử dụng;

c) ngày nhận mẫu;

d) ngày thử mẫu;

e) các kết quả và các đơn vị biểu thị kết quả;

...

...

...

g) mọi chi tiết thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này hoặc những điều này được coi là tùy chọn có thể ảnh hưởng đến kết quả;

h) ngày đưa ra báo cáo kết quả, tên và chữ ký của người chịu trách nhiệm phân tích.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Đường chuẩn vitamin B₆ thu được bằng phép thử vi sinh sử dụng Saccharomyces uvarum làm vi sinh vật thử nghiệm

CHÚ DẪN:

Trục x: ng/ống

...

...

...

1: pyridoxine

2: pyridoxai

3: pyrydoxamin

Hình A.1 – Liều phản ứng của Saccharomyces uvarum tạo các đồng phân B₆

Phụ lục B

(Tham khảo)

Dữ liệu về độ chụm

Theo dữ liệu thu được trong phép thử liên phòng thử nghiệm năm 1996 giữa các phòng thử nghiệm Châu Âu, xem [3].

...

...

...

Mẫu

Bột mì nguyên cám

Sữa bột

Rau trộn

Gan lợn

Năm thử nghiệm

1996

1996

1996

...

...

...

Số phòng thử nghiệm

7

7

7

7

Ngoại lệ

0

0

0

...

...

...

Giá trị trung bình  (mg/100g)

0,45

0,65

0,45

1,87

Độ lệch chuẩn lặp lại s_r (mg/100 g)

0,03

0,04

0,02

...

...

...

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại

6%

6%

5%

9%

Giá trị lặp lại r (95%) (mg/100 g)

0,08

0,11

0,07

...

...

...

Độ lệch chuẩn tái lập s_R (mg/100 g)

0,13

0,10

0,10

0,49

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập

28%

15%

23%

...

...

...

Giá trị tái lập R (95%) (mg/100g)

0,36

0,28

0,29

1,37

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Microbiological assay of vitamins of the B group, Bell, J.G., Lab. Practice, 1974, 23, 235 – 242

[2] Metzler and Snell (1955): Spectra and ionisation constants of the vitamin B6 group and related 3-hydroxypyridine derivates. Journal of the American Chemical Society 77:2431-2437

...

...

...

1) Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng, tiêu chuẩn này không ấn định phải sử dụng chúng. Có thể sử dụng các sản phẩm tương đương cho kết quả tương tự.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8976:2011 (EN 14166 : 2009) về Thực phẩm - Xác định vitamin B6 bằng phép thử vi sinh