Tính chênh lệch độ hấp thụ trước và sau khi phản ứng (A₂ – A₁) đối với dung dịch thử trắng và đối với dung dịch mẫu thử.

Lấy chênh lệch độ hấp thụ của mẫu thử trừ đi chênh lệch độ hấp thụ của mẫu trắng:

ΔA = ΔA_Mẫu – ΔA_{Mẫu trắng}                          (5)

7.2.4. Dung dịch thử axit D-lactic

Dùng pipet lấy 1,00 ml dung dịch đệm (5.11), 0,20 ml dung dịch NAD (5.12), 1,40 ml nước, 0,02 ml huyền phù GPT (5.13) và 0,10 ml dung dịch mẫu thử (7.1) cho vào cuvet.

Trộn và đọc độ hấp thụ A1 sau 5 min.

Thêm 0,05 ml dung dịch D-LDH (5.15). Trộn và đọc độ hấp thụ A2 sau 30 min.

Nếu dung dịch được ủ ở 37 ^oC, độ hấp thụ có thể được đọc sau 20 min.

Kiểm tra xem phản ứng đã kết thúc chưa bằng cách cứ sau 2 min trong khoảng 10 min, đọc độ hấp thụ thu được. Nếu cần, điều chỉnh phản ứng "phụ" (giá trị tăng lên không đổi) bằng cách ngoại suy độ hấp thụ về thời điểm thêm D-LDH (xem Phụ lục B).

...

...

...

Dùng pipet cho vào cuvet

Mẫu trắng

Mẫu thử

Dung dịch đệm (5.11)

Dung dịch NAD (5.12)

Huyền phù GPT (5.13)

Dung dịch mẫu thử (7.1)

Nước

1,00 ml

...

...

...

0,02 ml

–

1,50 ml

1,00 ml

0,20 ml

0,02 ml

0,10 ml

1,40 ml

Trộn và đọc độ hấp thụ A1 của dung dịch sau khoảng 5 min.

...

...

...

Huyền phù D-LDH (5.15)

0,05 ml

0,05 ml

Trộn và sau khi phản ứng kết thúc (khoảng 30 min), đọc độ hấp thụ A2 của mẫu trắng và mẫu thử. Để thúc đẩy phản ứng, dung dịch có thể được ủ ở 37 ^oC. Trong trường hợp này, phản ứng kết thúc sau 20 min.

Kiểm tra xem phản ứng đã kết thúc chưa bằng cách cứ sau 2 min trong khoảng 10 min,. đọc độ hấp thụ thu được.

Tính chênh lệch độ hấp thụ trước và sau khi phản ứng (A₂ – A₁) đối với dung dịch thử trắng và đối với dung dịch mẫu thử.

Lấy chênh lệch độ hấp thụ của mẫu thử trừ đi chênh lệch độ hấp thụ của mẫu trắng:

Δ_A = Δ_Mẫu – ΔA_{Mẫu trắng}                                          (6)

8. Tính kết quả

...

...

...

                                            (7)

trong đó:

V₁         là thể tích cuối cùng, tính bằng mililit (ml);

M         là khối lượng phân tử của axit lactic (90,1 g/mol);

F          là hệ số pha loãng dung dịch mẫu thử;

V₂         là thể tích của dung dịch mẫu thử, tính bằng mililit (ml);

d           là chiều dài đường quang của cuvet, tính bằng centimet (cm);

ε           là hệ số hấp thụ của NADH

tại bước sóng 340 nm, ε = 6,3 [l × mmol^{– 1} × cm^{– 1}];

...

...

...

tại bước sóng 334 nm, ε = 6,18 [l × mmol^{– 1} × cm^{– 1}].

Nếu không thay đổi các thể tích trong 7.2.3 và 7.2.4 thì tính hàm lượng axit L-lactic và axit D-lactic bằng miligam trên lít (mg/l) theo công thức sau:

– Đối với hàm lượng axit L-lactic:

                       (8)

– Đối với hàm lượng axit D-lactic:

                       (9)

Khi sử dụng bộ kit thử phức hợp có bán sẵn trên thị trường, thì các hệ số 2 469 và 2 496 trong các công thức (8) và (9) nêu trên có thể thay đổi.

Trong phần tính kết quả, cần tính đến hệ số pha loãng và mối tương quan giữa giá trị với thể tích hoặc khối lượng. Nếu sản phẩm cô đặc đã được pha loãng đến nồng độ đơn thì ghi lại tỉ trọng tương đối của mẫu nồng độ đơn.

Tính hàm lượng axit lactic theo miligam trên lít đến số nguyên hoặc theo miligam trên kilogam, phụ thuộc vào việc chuẩn bị mẫu (7.1).

...

...

...

Chi tiết về phép thử liên phòng thử nghiệm về độ chụm của phương pháp được đưa ra trong Phụ lục A. Các giá trị thu được từ phép thử liên phòng này có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ và chất nền khác với dải nồng độ và chất nền nêu trong Phụ lục A.

9.1. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử riêng rẽ thu được khi sử dụng cùng phương pháp, tiến hành trên vật liệu thử giống hệt nhau, do một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn, không được quá 5 % các trường hợp vượt quá giá trị độ lặp lại r.

Giá trị độ lặp lại:

r = 11 % đối với cả axit D-lactic và axit L-lactic.

9.2. Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử riêng rẽ thu được khi sử dụng cùng phương pháp, tiến hành thử trên vật liệu giống thử hệt nhau, trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do những người khác nhau thực hiện, sử dụng các thiết bị khác nhau, không được quá 5 % các trường hợp vượt quá giá trị độ tái lập R.

Giá trị độ tái lập:

R = 32 % đối với cả axit D-lactic và axit L-lactic.

...

...

...

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

– mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử (loại mẫu, nguồn gốc của mẫu, tên gọi);

– viện dẫn tiêu chuẩn này;

– ngày và phương pháp lấy mẫu, nếu biết;

– ngày nhận mẫu;

– ngày thử nghiệm;

– kết quả thử và đơn vị biểu thị kết quả;

– độ lặp lại, nếu được kiểm tra;

- bất kỳ điểm ngoại lệ nào quan sát được trong khi thực hiện phép thử;

...

...

...

PHỤ LỤC A

(Tham khảo)

Kết quả thống kê phép thử liên phòng thử nghiệm

Theo ISO 5725:1986*, các thông số sau đây đã được xác định trong một phép thử liên phòng thử nghiệm (xem Thư mục tài liệu tham khảo). Phép thử được tiến hành bởi Intermational Federal of Fruit Juice Producers (IFU), Paris, Pháp.

Năm tiến hành thử nghiệm:

1991

1990 (nước cà chua)

Số lượng phòng thử nghiệm tham gia:

...

...

...

21

Số lượng mẫu thử:

3

1

Tên mẫu:

A – nước cam, B – nước táo,

C – nectar anh đào,

...

...

...

Bảng A.1 – Axit L-lactic

Mẫu

A

B

C

D

Số lượng phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ

...

...

...

Số lượng kết quả được chấp nhận

17

2

69

17

2

68

18

1

...

...

...

19

2

92

Giá trị trung bình () (mg/l)

182

141

268

149

Độ lệch chuẩn lặp lại (s_r) (mg/l)

...

...

...

9,24

5,1

5,10

3,6

12,80

4,8

4,52

3,0

Giới hạn lặp lại (r) (mg/l)

...

...

...

14

36

13

Độ lệch chuẩn tái lập (s_R) (mg/l)

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập (RSDR) (%)

18,91

10,4

18,20

12,9

...

...

...

13,5

12,63

8,5

Giới hạn tái lập (R) (mg/l)

59

51

101

35

Bảng A.2 – Axit D-lactic

...

...

...

A

B

C

D

Số lượng phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ

Số lượng ngoại lệ (phòng thử nghiệm)

Số lượng kết quả được chấp nhận

19

–

...

...

...

19

–

75

19

–

76

21

–

108

...

...

...

179

136

233

91

Độ lệch chuẩn lặp lại (s_r) (mg/l)

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại (RSD_r) (%)

6,97

3,9

4,91

...

...

...

7,80

3,3

4,18

4,6

Giới hạn lặp lại (r) (mg/l)

20

14

22

12

...

...

...

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập (RSD_R) (%)

20,02

11,2

16,58

12,2

30,50

13,1

9,50

10,4

...

...

...

56

46

85

27

PHỤ LỤC B

(Tham khảo)

Thông tin về cách xử lí các phản ứng "phụ"

Các phản ứng "phụ" nói chung do tác dụng phụ của enzym, sự có mặt của các enzym khác trong chất nền mẫu thử, hoặc do tương tác của một hoặc một số thành phần của chất nền với thuốc thử của phản ứng enzym.

...

...

...

Nếu phản ứng "phụ" xuất hiện, độ hấp thụ của dung dịch phải được đo trong các khoảng thời gian cách đều (2 min đến 5 min) sau thời gian cần thiết để dung dịch đạt độ hấp thụ cuối cùng. Khi độ hấp thụ tăng theo tỉ lệ không đổi (dA/dt = hằng số), đọc từ 5 lần đến 6 lần và sau đó ngoại suy, dùng biểu đồ hoặc dùng phép tính, để thu được độ hấp thụ của dung dịch tại thời điểm cuối cùng mà enzym được thêm vào (T_o). Chênh lệch của độ hấp thụ đã được ngoại suy tại thời điểm này (A_f – A_i) được sử dụng để tính nồng độ chất nền.

Hình B.1 – Phản ứng phụ

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] ISO 5725:1986 Precision of test methods – Determination of repeatability and reproducibility for a standard test method by inter-laboratory tests (Độ chụm của phương pháp thử – Xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp thử bằng thử nghiệm liên phòng).

[2] Determination of lactic acid: Enzymatic method: No. 53,1983. In: Analyses [Collection]/International Federation of Fruit Juice Producers. Loose-leaf edition, as of 1995. Zug: Swiss Fruit Union.

[3] Determination of L-lactic acid/D-lactic acid: Enzymatic method. In: Methods of biochemical analysis and food analysis, using single reagents. Boehringer Mannheim.

* ISO 5725:1986 hiện nay đã hủy, được thay bằng ISO 5725 (gồm có 6 phần) và đã được biên soạn thành bộ TCVN 6910 (gồm có 6 phần).

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8904:2011 (EN 12631:1999) về Nước rau quả - Xác định hàm lượng axit D- và L-lactic (lactat) bằng enzym - Phương pháp đo phổ NAD