4.2. Axit axetic băng - nước, tỷ lệ 1 : 29

Cho 30 ml axit axetic băng vào 870 ml nước đã khử ion, lọc qua màng lọc cỡ lỗ 0,45 mm

4.3. Dung dịch natri bicacbonat nước, 3 %

Cho 30 g natri bicacbonat vào 1 000 ml nước đã khử ion.

4.4. Dinatri hydro phosphat khan, loại tinh khiết phân tích dùng cho sắc ký lỏng

4.5. Kali dihydro phosphat, loại tinh khiết phân tích dùng cho sắc ký lỏng

4.6. Dung dịch PBS, pH 7.0

Cho 0.20 g kali dihydro phosphat, 1,10 g dinatri hydro phosphat khan, 8,00 g NaCI và 0,20 g KCI vào 1 000 ml nước đã khử ion và đồng hóa. Cách khác, dùng các viên PBS có bán sẵn, ví dụ như Oxoid Code BR14 (pH 7,3) hoặc loại tương đương.

4.7. Metanol, loại tinh khiết phân tích dùng cho sắc ký lỏng

...

...

...

4.9. Axit axetic băng, loại tinh khiết phân tích dùng cho sắc ký lỏng.

4.10. Dung dịch metanol-natri bicacbonat nước 3 % (tỷ lệ 1 : 1 phần thể tích)

Cho 500 ml dung dịch natri bicacbonat 3 % (4.3) vào 500 ml metanol.

4.11. Toluen - axit axetic, tỷ lệ 99 : 1

Cho 1 ml axil axetic băng (4.9) vào 99 ml toluen.

4.12. Nitơ, có độ tinh khiết 99,9 %

4.13. Heli, khí nén đã tinh sạch hoặc hệ thống khử khi khác.

4.14. Pha động LC

Kết hợp axetonitril, metanol và axit axetic băng-nước (4.2) để có được axetonitril-metanol-nước- axit axetic băng (theo tỷ lệ 35 : 35 : 29 : 1). Pha động cần được khử khí bằng siêu lọc hoặc hệ thống khử khí khác và bằng cách sục khí heli vào pha động trong quá trình bơm.

...

...

...

5. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể sau

5.1. Cột ái lực miễn nhiễm, chứa các kháng thể OTA. Cột có công suất ³ 100 ng OTA và khả năng thu hồi ³ 85 % OTA khi 100 ml dung dịch chuẩn chứa 5 ng độc tố trong dung dịch metanol-natri bicacbonat 3 % (4.10) (tỳ ]ệ 50 : 50)/dung dịch PBS (tỷ lệ 4 : 96) đi qua cột. Các cột ái lực miễn dịch cần được đưa về nhiệt độ phòng trước khi sử dụng.

5.2. Máy đồng hóa/máy trộn, tốc độ của môtơ từ 0 r/min đến 16 000 r/min, được trang bị các lọ thủy tinh dung tích 946 ml.

5.3. Thiết bị siêu âm

5.4. Giấy lọc nhanh, đường kính 24 cm, được gấp nếp, ví dụ: Giấy Whatman số 4 hoặc loại tương đương.

5.5. Màng lọc bằng sợi thủy tinh, đường kính 5,5 cm, cỡ lỗ 1 mm, ví dụ: Whatman GF/B hoặc loại tương đương

5.6. Bộ lọc màng, có cỡ lỗ khoảng 0,45 mm làm bằng xenluloza hoặc xenluloza nitrat, dùng cho dung môi hữu cơ lỏng.

5.7. Bình định mức đã hiệu chuẩn, dung tích 50 ml, 100 ml, 1 000 ml và 2 000 ml

...

...

...

5.9. Cân, có thể đọc được đến 0,01 g.

5.10. Xyranh dùng một lần, dung tích 60 ml và 10 ml được dùng như bình chứa, có ống nối thích hợp.

5.11. Nồi cách thủy, có khả năng duy trì nhiệt độ trong khoảng từ 40 °C đến 45 °C.

5.12. Hệ thống chân không, có phễu lọc màng phía trên đỉnh, giá đỡ phễu lọc màng, bàn kẹp bằng nhôm, nắp đậy và bình cầu có tay cầm bên, kiểu Millipore hoặc loại tương đương.

5.13. Pipet định mức đã hiệu chuẩn, dung tích 4 ml và 25 ml.

5.14. Máy trộn Vortex.

5.15. Máy đo quang phổ, có cuvet thạch anh, có thể đo ở bước sóng từ 200 nm đến 400 nm.

5.16. Hệ thống sắc ký lỏng, gồm có hệ thống van tiêm cỡ vòng 20 ml hoặc loại tương đương, bơm pha động có thể bơm với tốc độ 1 ml/min, có detector huỳnh quang, bước sóng kích thích l = 332 nm và bước sóng phát xạ l = 476 nm, có hệ thống máy tính xử lý dữ liệu, cột pha đảo (C18) kích thước 250 mm x 4.6 mm, cỡ hạt 5 mm và bộ phận khử khí.

5.17. Ống hút chân không

...

...

...

5.20. Pipet dạng pittông đã hiệu chuẩn, dung tích từ 100 m1 đến 1000 ml, từ 20 ml đến 200 ml và từ 500 ml đến 5000 ml, với các đầu pipet thích hợp.

5.21. Bình cầu thủy tinh màu nâu, dung tích 2 ml, 5 ml và 10 ml.

6. Cách tiến hành

6.1. Yêu cầu chung

Toàn bộ qui trình phân tích cần được thực hiện trong ngày.

6.2. Chuẩn bị mẫu thử

Dùng máy nghiền phòng thử nghiệm (5.1) để nghiền mẫu thử và trộn kỹ cho đến khi lọt hết qua sàng 1 mm (5.1) hoặc dùng máy trộn để trộn kỹ.

6.3. Chiết Ochratoxin A ra khỏi mẫu

Dùng cân (5.9) cân lấy 25 g, chính xác đến 0,1 g của phần mẫu thử cho vào bình định mức 500 ml (5.7). Thêm 200 ml dung dịch metanol - natri bicacbonat 3 % (tỷ lệ 1:1). Trộn bằng máy trộn (5.2) trong 5 min với tốc độ 8 000 r/min. Lọc hỗn hợp qua giấy lọc nhanh (5.4) Ngay sau khi lọc, thu lấy phần dịch lọc rồi lọc lại qua màng lọc sợi thủy tinh (5.5). Sử dụng hệ thống chân không. Ngay sau khi lọc lần thứ hai chuyển 4 ml phần dịch lọc thu được cho vào ống đong. Pha loãng bằng dung dịch PBS (4.6) đến 100 ml và đồng hóa.

...

...

...

Để cho cột ái lực miễn nhiễm (5.1) đạt đến nhiệt độ phòng, rồi nối với ống hút chân không (5.17) và gắn xyranh dung tích 60 ml (5.10). Sử dụng 2 phần, mỗi phần khoảng 50 ml, của dịch chiết mẫu đã pha loãng thu được trong 6.3 cho vào bình chứa dung tích 60 ml và cho đi qua cột ái lực miễn dịch với tốc độ từ 2 ml/min đến 3 ml/min. Nếu cần, dùng đũa ấn xuống hoặc sử dụng chân không nhẹ. Không để tốc độ dòng vượt quá 3 ml/min và không để cột chảy đến khô. Rửa cột bằng 10 ml nước đã khử ion với tốc độ 3 ml/min. Làm khô cột bằng cách sử dụng chân không nhẹ trong 30 s hoặc dùng đũa ấn nhẹ xuống. Tháo cột ái lực miễn dịch ra và thay bình chứa 60 ml bằng xyranh thủy tinh 10 ml.

6.5. Rửa giải OTA

Dùng xyranh 10 ml (5.10) lấy 4 ml metanol và đợi 3 min để cho dung môi thấm vào gel trước khi rửa giải. Rửa giải độc tố ra khỏi cột vào bình nón 5 ml hoặc 10 ml (5.18) với tốc độ dòng từ 2 ml/min đến 3 ml/min, dùng áp suất dương. Cho bay hơi dịch rửa giải đến khô bằng cách sử dụng dòng nitơ (4.12) nhẹ trên nồi cách thủy (5.11). Hòa tan lượng cặn thu được với 200 ml pha động LC và đồng hóa trong máy trộn Vortex (5.14) và/hoặc thiết bi siêu âm (5.3).

6.6. Xác định OTA

6.6.1. Điều kiện vận hành máy sắc ký lỏng

Thể tích dung dịch chuẩn và thể tích dung dịch mẫu được bơm lá 20 ml. Thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất thiết bị về nhiệt độ của bộ bơm và nhiệt độ cột LC, nghĩa là nhiệt độ phòng, tốc độ rửa giải 0,8 ml/min, pha động, xem 4.14.

6.6.2. Đánh giá cột

Độ phân dải của đường nền pic OTA được tách ra khỏi các pic khác, có thời gian lưu của OTA khoảng 10 min có thể đạt được khi sử dụng cột pha đảo (C18) kích thước 250 mm x 4,6 mm, với cỡ hạt 5 mm và pha động axit axetonitril-metanol-nước-băng axetic (35 + 35 + 29 + 1) (4.14).

6.6.3. Đường chuẩn

...

...

...

6.6.4. Xác định OTA trong dung dịch mẫu thử

Bơm một lượng 20 ml dung dịch mẫu thử cho vào hệ thống LC, sử dụng các điều kiện tương tự như đã được dùng trong khi dựng đường chuẩn. Nhận biết Ochratoxin A bằng cách so sánh thời gian lưu của mẫu với thời gian lưu của dung dịch chuẩn. Nếu diện tích pic OTA trong sắc đồ mẫu lớn hơn diện tích pic của dung dịch chuẩn có nồng độ cao nhất, thì pha loãng dịch chiết mẫu và bơm lại.

7. Tinh toán và biểu thị kết quả

Từ đường chuẩn, xác định phần khối lượng của OTA, bằng nanogam trong dung dịch mẫu thử được bơm vào hệ thống sắc ký lỏng.

Tính phần khối lượng W_OTA của Ochratoxin A bằng nanogam trên gam, sử dụng công thức (1):

                      (1)

Trong đó

M là khối lượng của OTA trong phần dịch chiết mẫu (20 ml) được bơm vào hệ thống LC, tính bằng nanogam (ng);

W là khối lượng phần mẫu thử được bơm vào hệ thống LC, tính bằng gam (g). (trong trường hợp này là 0,05 g);

...

...

...

V₁, là thể tích dung môi chiết, tính bằng mililit (ml), (ở đây = 200 ml);

V₂ là thể tích dịch lọc được đưa vào cột ái lực miễn dịch, tính bằng mililit-(ml), (trong trường hợp này là 4 ml);

V₃ là thể tích pha động được dùng để lấy được cặn khô, tinh bằng microlit (ml), (trong trường hợp này là 200 ml);

V₄ là thể tích dịch chiết được bơm vào hệ thống LC, tính bằng microlit (ml), (trong trường hợp này là 20 ml).

8. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin dưới đây:

- mọi thông tin cần thiết để nhận biết mẫu thử;

- viện dẫn tiêu chuẩn này hoặc phương pháp đã sử dụng;

- kết quả và đơn vị biểu thị kết quả;

...

...

...

- ngày tháng nhận mẫu thử nghiệm;

- ngày tháng thử nghiệm;

- các điểm quan sát được trong quá trình thử nghiệm;

- mọi thao tác không qui định trong tiêu chuẩn này, hoặc các phương án lựa chọn mà có thể ảnh hưởng đến kết quả.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8426:2010 về Cà phê nhân - Xác định ochratoxin A bằng phương pháp sắc ký lỏng có làm sạch bằng cột ái lực miễn nhiễm