Nồng độ trong mẫu, µg/kg |
Thể tích chuẩn hỗn hợp SMD2, µl |
Thể tích nội chuẩn hỗn hợp ISMD2, µl |
|
Metyltestosteron /dietylstilbestrol |
Metyltestosteron-d3/ dietylstilbestrol-d6 |
||
0 |
2,0 |
0 |
100 |
0,5 |
2,0 |
25 |
100 |
1,0 |
2,0 |
50 |
100 |
1,5 |
2,0 |
75 |
100 |
2,0 |
2,0 |
100 |
100 |
Cân 5,0 g mẫu thử đã nghiền vào ống nghiệm nhựa 50 ml có nắp. Thêm chính xác 100 µl dung dịch hỗn hợp nội chuẩn ISMD2 (hàm lượng nội chuẩn trong mẫu là 2 µg/l), để yên 30 min.
Thêm 15 ml dung dịch đệm Tris 0,1 M (pH 9,5) chứa 5 mg subtilisin vào các ống nghiệm đã chuẩn bị ở 5.1.2, 5.1.3, 5.1.4. Lắc và trộn đều trong 2 min bằng máy lắc (vortex). Ủ hỗn hợp trong 2 h ở 52 0C trong tủ ủ. Sau đó làm lạnh hỗn hợp đến nhiệt độ phòng.
Thêm 10 ml TBME. Lắc và trộn đều trong 10 min bằng máy lắc. Ly tâm mẫu với tốc độ 3 000 r/min trong 5 min. Dùng pipet hút lớp TBME sang ống nghiệm 50 ml mới. Thêm 10 ml TBME vào cặn mẫu. Lắc và trộn đều trong 10 min bằng máy lắc. Ly tâm mẫu với tốc độ 3 000 r/min trong 5 min. Dùng pipet hút lớp TBME sang cùng ống nghiệm 50 ml chứa TBME trước đó. Thổi khô dung dịch TBME trong ống nghiệm dưới dòng khí nitơ ở 55 0C.
Thêm 4 ml hỗn hợp metanol : nước (tỷ lệ 4 : 1 theo thể tích) vào ống nghiệm, lắc đều.
Thêm 6 ml hexan. Lắc mạnh trong 30 s. Ly tâm trong 5 min với tốc độ 3 000 r/min. Loại bỏ lớp hexan.
Thêm 4 ml hexan. Lắc mạnh trong 30 s. Ly tâm trong 5 min với tốc độ 3 000 r/min. Loại bỏ lớp hexan.
Cô dung dịch trong ống nghiệm dưới dòng khí nitơ ở 55 oC đến khi còn khoảng 0,5 ml. Thêm 3 ml hỗn hợp metanol : nước (tỷ lệ 1 : 9 theo thể tích). Lắc đều.
Hoạt hóa cột Oasis HLB bằng 3 ml metanol và 3 ml nước. Hoạt hóa cột amino bằng 3 ml hỗn hợp axeton : metanol (tỷ lệ 80 : 20 theo thể tích).
Cho dung dịch mẫu qua cột Oasis HLB đã hoạt hóa. Rửa cột 3 lần, lần 1 dùng 3 ml metanol 5 % trong hỗn hợp ammoni 2 % trong nước (theo thể tích), lần 2 dùng 3 ml metanol 40 % trong hỗn hợp ammoni 2 % trong nước (theo thể tích), lần 3 dùng 3 ml nước. Giải hấp bằng 3 ml dung dịch giải hấp (hỗn hợp axeton : metanol, tỷ lệ 80 : 20 theo thể tích).
...
...
...
Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Tiêm 20 µl dung dịch vào hệ thống LC-MS/MS.
– Pha động A: nước HPLC
– Pha động B: metanol HPLC
– Thành phần pha động thay đổi theo thời gian (chế độ gradient) được mô tả ở Bảng 2.
Bảng 2 – Thành phần pha động theo thời gian
Thời gian, min
Pha động A, % thể tích
Pha động B, % thể tích
Tốc độ dòng, ml/min
...
...
...
Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
60
40
0,7
12
30
70
0,7
22
30
...
...
...
Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0,7
22,1
15
85
0,7
23,1
15
85
0,7
...
...
...
Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
60
40
0,7
28
60
40
0,7
– thể tích tiêm: 20 µl
– tốc độ dòng: 0,7 ml/min
...
...
...
Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
– nhiệt độ cột: 35 oC
5.3.2 Thông số cài đặt cho đầu dò khối phổ-khối phổ
Thông số cài đặt cho đầu dò khối phổ-khối phổ để xác định metyltestosteron
– nguồn ion hóa: ESI (+)
– điện thế mao quản: 1 kV
– điện thế bộ tách chiết: 2,0 V
– điện thế RF: 0,0 V
– nhiệt độ nguồn: 120 oC
– nhiệt độ khử dung môi: 400 oC
...
...
...
Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
– bộ phân tích
+ độ phân giải vùng khối lượng thấp LM1: 15,0
+ độ phân giải vùng khối lượng cao HM1: 15,0
+ năng lượng ion hoá 1: 0,5 eV
+ điện thế cửa vào: –1 V
+ điện thế cửa ra: 1 V
+ độ phân giải vùng khối lượng thấp LM2: 15,0
+ độ phân giải vùng khối lượng cao HM2: 15,0
+ năng lượng ion hoá 2 : 3
...
...
...
Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
+ áp suất chân không: 4,5 x 10-3 mbar
+ chế độ vận hành: chuẩn
Thông số cài đặt cho đầu dò khối phổ-khối phổ để xác định dietylstilbestrol
– nguồn ion hóa: ESI (-)
– điện thế mao quản: 2 kV
– điện thế bộ tách chiết: 2,0 V
– điện thế RF: 0,0 V
– nhiệt độ nguồn: 120 oC
– nhiệt độ khử dung môi: 400 oC
...
...
...
Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
– bộ phân tích
+ độ phân giải vùng khối lượng thấp LM1: 15,0
+ độ phân giải vùng khối lượng cao HM1: 15,0
+ năng lượng ion hoá 1: 1 eV
+ điện thế cửa vào: –1 V
+ điện thế cửa ra: 1 V
+ độ phân giải vùng khối lượng thấp LM2: 15,0
+ độ phân giải vùng khối lượng cao HM2: 15,0
+ năng lượng ion hoá 2: 1,5
...
...
...
Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
+ áp suất chân không: 4,5 x 10-3 mbar
+ chế độ vận hành: chuẩn
– các điều kiện phân ly MS/MS:
Bảng 3 – Các điều kiện phân ly MS/MS
Tên chất
Ion sơ cấp, m/z
Ion thứ cấp, m/z
Thời gian Dwell, s
Điện thế cone, V
...
...
...
Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Metyltestosteron
303
96,5 a)
108,6
0,1
0,1
35
35
...
...
...
Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
26
Dietylstilbestrol
267,2
237,0 a)
222,5
0,1
0,1
45
...
...
...
Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
31
41
Metyltestosteron-d3
306
96,5
0,1
35
26
Dietylstilbestrol-d6
...
...
...
Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
225,5
0,1
45
41
a) Phân ly 303 > 96,5 và 267,2 > 237,0 có cường độ cao, được sử dụng trong tính kết quả.
5.3.3 Thứ tự tiêm mẫu
– tiêm các dịch mẫu xây dựng đường chuẩn.
– tiêm dịch mẫu trắng.
– tiêm các dịch mẫu thử nghiệm. Tính hàm lượng metyltestosteron và dietylstilbestrol trong mẫu thử nghiệm.
...
...
...
Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Xây dựng đồ thị hệ số tín hiệu RF của dịch mẫu xây dựng đường chuẩn (trục tung) với nồng độ chất chuẩn metyltestosteron/ dietylstilbestrol bổ sung (trục hoành) theo phương pháp hồi quy tuyến tính:
RF = ax + b
Trong đó:
b là tung độ góc của đường chuẩn;
a là hệ số góc của đường chuẩn;
x là nồng độ chất chuẩn metyltestosteron bổ sung trong mẫu (µg/kg);
RF là hệ số tín hiệu, được tính theo:
Trong đó:
...
...
...
Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
SpIS là diện tích píc của ion thứ cấp của metyltestosteron-d3 (306 > 96,5)/ dietylstilbestrol-d6 (273,2 > 225,5).
Hàm lượng metyltestosteron và dietylstilbestrol có trong mẫu, C, được biểu thị bằng microgam trên kilogam (µg/kg) theo công thức sau:
C = (RF – b) / a
Trong đó:
RF là hệ số tín hiệu của mẫu thử;
a, b xem 5.4.
Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:
- mọi thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử;
...
...
...
Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
- phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này;
- mọi thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc những điều được coi là tự chọn, và bất kỳ chi tiết nào có ảnh hưởng đến kết quả;
- kết quả thử nghiệm thu được.
(Tham khảo)
A.1 Các sắc ký đồ tiêu biểu trong xác định metyltestosteron
A.1.1 Sắc ký đồ của mẫu trắng
...
...
...
Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Metyltestosteron-d3: thời gian lưu 11,86 min, 306 > 96,5
Metyltestosteron: thời gian lưu 11,86 min, 303 > 108,6, 303 > 96,5
A.1.2 Sắc ký đồ của mẫu gây nhiễm metyltestosteron tại nồng độ 2,5 µg/kg
Metyltestosteron-d3: thời gian lưu 11,88 min, 306 > 96,5
Metyltestosteron: thời gian lưu 11,90 min, 303 > 108,6, 303 > 96,5
A.1.3 Sắc ký đồ của mẫu gây nhiễm metyltestosteron tại giới hạn phát hiện (0,5 µg/kg)
Metyltestosteron-d3: thời gian lưu 11,78 min, 306 > 96,5
...
...
...
Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
A.2 Các sắc ký đồ tiêu biểu trong xác định dietylstilbestrol
A.2.1 Sắc ký đồ của mẫu trắng
A.2.2 Sắc ký đồ của mẫu gây nhiễm dietylstilbestrol tại nồng độ 2,5 µg/kg
A.2.3 Sắc ký đồ của mẫu gây nhiễm dietylstilbestrol tại giới hạn phát hiện (0,5 µg/kg)
Dietylstilbestrol: thời gian lưu 8,90 min, 267,2 > 237, 267,2 > 222,5
...
...
...
Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
(Tham khảo)
B.1 Dữ liệu về độ chụm của phương pháp xác định metytestosteron
STT
Loại mẫu
Số lượng mẫu
Nồng độ chuẩn trong mẫu,
µg/kg
Kết quả phân tích
...
...
...
Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
µg/kg
Độ thu hồi,
%
Độ lặp lại,
%
1
Cá cảnh
15
0,5
...
...
...
Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
98
6
15
1,0
1,06
106
5
15
1,5
...
...
...
Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
107
5
2
Cá tra
15
0,5
0,47
94
7
...
...
...
Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
1,0
0,98
98
6
15
1,5
1,56
104
6
...
...
...
Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Cá basa
15
0,5
0,48
96
8
15
1,0
0,98
...
...
...
Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
6
15
1,5
1,48
99
5
B.2 Dữ liệu về độ chụm của phương pháp xác định metytestosteron
STT
Loại mẫu
...
...
...
Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Nồng độ chuẩn trong mẫu,
µg/kg
Kết quả phân tích
Kết quả trung bình,
µg/kg
Độ thu hồi,
%
Độ lặp lại,
%
...
...
...
Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
Tôm các loại
15
0,5
0,48
96
6
15
1,0
1,02
...
...
...
Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
5
15
1,5
1,59
106
6
2
Cá tra
15
...
...
...
Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
0,46
92
7
15
1,0
0,99
99
7
15
...
...
...
Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
1,47
98
6
3
Cá basa
15
0,5
0,45
90
...
...
...
Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
15
1,0
0,95
95
5
15
1,5
1,46
97
...
...
...
Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] George Kaklamanos, Georgios Theodoridis, Themistoklis Dabalis, Journal of Chromatography A, (2009)
[2] A. Onal, Food Chem. 103 (2007) 1475
[3] N. Innocente, M. Biasutti, M. Padovese, S. Moret, Food Chem. 101 (2007) 1285
[4] G. mo Dugo, F. Vilasi, G.L. La Torre, T.M. Pellicano, Food Chem. 95 (2006) 672
[5] Y.I. Yashin, A.Y. Yashin, J. Anal. Chem. 59 (2004) 1121
[6] A.L. Cinquina, A. Cali, F. Longoa, L. De Santis, A. Severoni, F. Abballe, J. Chromatogr. A 1032 (2004) 73
[7] S. Cortacero-Ramırez, D. Arraez-Roman, A. Segura-Carreteo, A. Fernandez-Gutierrez, Food Chem. 100 (2007) 383
...
...
...
Mọi chi tiết xin liên hệ: ĐT: (028) 3930 3279 DĐ: 0906 22 99 66
[9] G. Saccani, E. Tanzi, P. Pastore, S. Cavalli, M. Rey, J. Chromatogr. A 1082 (2005) 43
[10] F. Calbiani, M. Careri, L. Eviri, A. Mangia, L. Ristara, I. Zagnoni, J. Agric. Food Chem. 53 (2005) 3779
[11] F. Gosetti, E. Mazzucco, V. Gianotti, S. Polati, M.C. Gennaro, J. Chromatogr A 1149 (2007) 151.
Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8375:2010 về thủy sản và sản phẩm thủy sản - Xác định hàm lượng metyltestosteron và dietylstilbestrol bằng phương pháp sắc kí lỏng - khối phổ - khối phổ (LC-MS/MS)
Số hiệu: | TCVN8375:2010 |
---|---|
Loại văn bản: | Tiêu chuẩn Việt Nam |
Nơi ban hành: | *** |
Người ký: | *** |
Ngày ban hành: | 01/01/2010 |
Ngày hiệu lực: | Đã biết |
Tình trạng: | Đã biết |
Văn bản đang xem
Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8375:2010 về thủy sản và sản phẩm thủy sản - Xác định hàm lượng metyltestosteron và dietylstilbestrol bằng phương pháp sắc kí lỏng - khối phổ - khối phổ (LC-MS/MS)
Chưa có Video