8.5.2 Tính độ hấp thụ

Tính độ hấp thụ A, của từng cuvet được dùng để tính hàm lượng axit xitric (9.1), theo công thức (1):

A= A₀ - A₁₀ (1)

Trong đó:

 A₀ là độ hấp thụ đo được trước khi thêm dung dịch lyaza xitrat;

 A₁₀ là độ hấp thụ đo được sau khi thêm dung dịch lyaza và ủ trong 10 min.

8.5.3 Kiểm tra xác nhận

Nếu độ hấp thụ, A, vượt quá 0,800, thì lặp lại qui trình qui định trong 8.5.1 và 8.5.2, sử dụng dung dịch lỏng thích hợp của dịch lọc từ cả phần mẫu thử (8.2) lẫn mẫu thử trắng (8.3).

9. Tính và biểu thị kết quả

...

...

...

Tính hàm lượng axit xitric, w, bằng phần trăm khối lượng axit xitric khan, theo công thức (2):

  (2)

Trong đó:

 A_s là độ hấp thụ đo được của phần mẫu thử hoặc của phép thử kiểm tra;

 A_r là giá trị trung bình của độ hấp thụ đo được đối với phép thử trắng;

 M_r là khối lượng phân tử của axit xitric (đối với axit xitric khan, M_r = 192,1);

 K là hệ số hấp thụ phân tử tương đối của NADH ở 340 nm (nghĩa là K = 6,3 x 10⁶ cm²/mol);

 l là chiều dài đường quang của cuvet đo phổ, tính bằng centimet (l = 1 cm);

 m là khối lượng phần mẫu thử (8.3), tính bằng gam (g);

...

...

...

 V₂ là thể tích của dịch lọc (8.4.5) trong cuvet đo phổ , tính bằng mililit (V₂ = 2,0 ml);

 V₃ là thể tích của dịch lọc đã khử protein (8.4.3), sau khi đã chỉnh pH đến 8, đã được pha loãng (8.4.4), tính bằng mililit (ml) (V₃ = 100 ml);

 V₄ là thể tích của dịch lọc đã khử protein (8.4.3) được lấy để chỉnh pH đến 8 (8.4.4), tính bằng mililit (ml) (V₄= 25 ml);

 V₅ là thể tích của dung dịch trong 8.1.2, tính bằng mililit (ml) (V₅ = 100 ml);

 V₆ là thể tích của dịch lọc (8.4.5) được lấy pha loãng (8.5.4) tính bằng mililit (ml), nếu thích hợp, còn nếu không thì (V₆ = 1 ml);

 V₇ là thể tích của dịch lọc (8.5.3) đã được pha loãng, tính bằng mililit (ml), nếu thích hợp, còn nếu không thì (V₇ = 1 ml).

9.2. Biểu thị kết quả

Báo cáo kết quả ba chữ thập phân.

10. Độ chụm

...

...

...

Các giá trị về độ lặp và độ tái lập thu được từ phép thử liên phòng thí nghiệm này không hoàn toàn đáp ứng được yêu cầu của ISO 54253, do đó độ tin cậy của các kết quả này không chắc chắn.

CHÚ THÍCH: Các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm này sẽ được công bố trong tạp chí sữa của Hiệp hội Sữa Quốc tế.

10.2. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử độc lập, đơn lẻ thu được khi sử dụng cùng phương pháp trên vật liệu thử giống hệt nhau trong cùng một phòng thử nghiệm, do một người thực hện, sử dụng cùng thiết bị, thực hiện một khoảng thời gian ngắn, không quá 5 % các trường hợp vượt quá 5 % (tương đối) của trung bình các kết quả.

10.3. Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử đơn lẻ, thu được khi sử dụng cùng phương pháp trên vật liệu thử giống hệt nhau trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do những người khác nhau thực hiện, sử dụng các thiết bị khác nhau, không quá 5 % các trường hợp vượt quá 8 % (tương đối) của trung bình các kết quả.

11. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

...

...

...

c) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi chi tiết thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này hoặc những điều được coi là tùy ý cũng như các sự cố bất kỳ mà có thể ảnh hưởng đến kết quả thử;

e) kết quả thử nghiệm thu được; nếu thõa mãn yêu cầu về độ lặp lại nêu kết quả cuối cùng thu được theo 10.1.

Phụ lục A

(Qui định)

Các nguyên tắc Thực hành Phòng thử nghiệm tốt (GLP) đối với việc thực hiện phân tích bằng enzym

A.1. Giới thiệu

Các nguyên tắc Thực hành Phòng thí nghiệm tốt (GLP) đối với việc phân tích bằng enzym thường ít được biết đến hơn so với các phép phân tích hóa học khác.

...

...

...

Do đó, trước khi phân tích cần đọc kỹ các nguyên tắc GLP dưới đây.

A.2. Thuốc thử

A.2.1 Chỉ sử dụng các enzym thuộc loại qui định (hoạt độ cụ thể, nồng độ, các chất nhiễm bẩn các hoạt độ của enzym, dung môi).

A.2.2 Chỉ sử dụng các coenzym thuộc loại qui định (cấp loại tinh khiết, dạng muối hoặc axit, các chất nhiễm bẩn).

A.2.3 Tất cả các thuốc thử không phải enzym và coenzym phải là loại phân tích.

A.2.4 Nước để chuẩn bị các dung dịch enzym và các loại thuốc thử khác phải là nước được cắt hai lần dụng cụ thủy tinh.

A.2.5 Nước để chuẩn bị các dung dịch mẫu thử phải là nước cất bằng thủy tinh hoặc nước đã loại ion.

A.2.6 Bảo quản các thuốc thử và dung dịch/huyền phù enzym theo hướng dẫn (thường từ 2 ⁰C đến 8 ⁰C).

A.2.7 Không làm đông lạnh các huyền phù enzym.

...

...

...

A.2.9 Các dung dịch đệm được lấy ra khỏi tủ lạnh phải được làm ấm đến nhiệt độ phòng trước khi bổ sung vào hỗn hợp phân tích.

A.3 Cuvet đo phổ và cuvet đo quang

A.3.1 sử dụng các cuvet bằng thủy tinh hoặc bằng chất dẻo có chiều dài đường quang 1 cm.

CHÚ THÍCH: Các cuvet bằng chất dẻo có các ưu điểm hơn cuvet thủy tinh như sau:

- Giá rẻ (dùng một lần);

- Có khả năng phân tích với các lượng lớn hơn;

- Trong một mẻ, thì các cuvet bằng chất dẻo có độ hấp thụ tốt hơn.

A.3.2 Khi một mẻ các cuvet mới được đưa vào sử dụng, thì kiểm tra chiều dài đường quang của các cuvet dựa vào cuvet chính xác (ví dụ: cuvet thạch anh), như sau:

Làm đầy cuvet chính xác và cuvet bằng chất dẻo bằng nước và độ hấp thụ (A₁) của từng cuvet dựa vào không khí. Sau khi tráng rửa, làm đầy các cuvet bằng dung dịch NADH (khoảng 0,15 mg/ml) và đo lại độ hấp thụ (A₂) dựa vào không khí.

...

...

...

A.3.3 Luôn sử dụng các cuvet không bị xước và sạch. Chỉ làm sạch hoặc làm khô các mặt của cuvet quang học bằng khăn mềm.

A.3.4 Không đo độ hấp thụ của cuvet mẫu thử dựa vào cuvet thử mẫu trắng, vì sẽ không thu được thông tin về mức cường độ hấp thụ của chính phép thử trắng. Cần đo độ hấp thụ của hai cuvet mẫu thử và cuvet mẫu thử trắng dựa vào không khí và tính chênh lệch.

A.3.5 Không đo độ hấp thụ của cuvet đựng mẫu hoặc cuvet mẫu trắng dựa vào cuvet trống (bởi vì tán xạ ánh sáng).

A.3.6 Trộn lượng chứa trong cuvet bằng cách trộn chất dẻo hoặc bằng cách dùng parafin làm kín cuvet rồi xoay nhẹ cuvet.

A.3.7 Loại hết bọt khí trên thành cuvet bằng cánh trộn. Tránh làm xước mặt trong cuvet.

A.3.8 Luôn sử dụng cùng một lại cuvet để đo mẫu thử và đo mẫu trắng.

A.3.9 Luôn đặt cuvet ở cùng một vị trí và cùng hướng trong giá đựng cuvet. Chú ý đánh dấu một mặt của cuvet.

A.4. Đo quang và đo phổ

A.4.1. Yêu cầu chung

...

...

...

CHÚ THÍCH: Các hệ số hấp thụ phân tử NADH và NADPH được đo ở 334 nm, 340 nm và 365 nm như sau:

NADH và NADPH ở bước sóng 334 nm (Hg):

6,18 x 10⁶ cm²/mol

NADH và NADPH ở bước sóng 340 nm:

6,3 x 10⁶ cm²/mol

NADPH ở bước sóng 365 nm (Hg):

3,5 x 10⁶ cm²/mol

NADH ở bước sóng 365 nm (Hg):

3,4 x 10⁶ cm²/mol

...

...

...

Mối quan hệ tuyến tính đến độ hấp thụ 2,0 phải tồn tại giữa độ hấp thụ và nồng độ của NADH hoặc NADPH. Kiểm tra như sau:

a) Dùng pipet lấy 2,0 ml nước cất cho vào cuvet. Đo độ hấp thụ A₀ dựa vào không khí;

b) Dùng pipet 0,10 ml dung dịch NADH (0,5 mg/ml) cho vào cuvet và trộn. Đo độ hấp thụ A₁.

Tính độ hấp thụ giảm, A_r1, theo công thức sau:

A_r1 = (A₁ - A₀) x

Trong đó

A₁ độ hấp thụ thu được của dung dịch NADH [xem b)];

A₀ độ hấp thụ thu được của nước [ xem a)].

c) Lặp lại qui trình mô tả trong b) ỏ trên thêm 14 lần. Sau mỗi cặp phép đo, tính độ hấp thụ giảm A_M, theo công thức sau:

...

...

...

Trong đó

A₁ độ hấp thụ thu được trong phép đo thử n;

A₀ là thể tích lượng chứa trong cuvet tạp phép đo thử n.

d) Đối với mỗi phép đo, vẽ đồ thị của thể tích dung dịch NADH có mặt trong cuvet dựa theo các độ hấp thụ giảm. Phải thu được đường thẳng nối từ các điểm giao nhau thu được.

A.5. Pipet tự động và các bộ phân phối khác

A.5.1. Sử dụng các pipet tự động và các bộ phân phối khác theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

A.5.2. Sử dụng các đầu tip thích hợp cho từng pipet.

A.5.3. Kiểm tra định kỳ các qui định về thể tích, độ lặp lại của pipet tự động và các bộ phân phối khác (ví dụ: hàng tháng), như sau:

a) cân cốc thủy tinh có mỏ với nước ở thời điểm t;

...

...

...

c) lặp lại qui trình hút bằng pipet hoặc bộ phân phối như ở b) 9 lần

d) cân cốc có mỏ không có pipet hoặc bộ phân phối ở thời điểm t + 11 min, t + 12 min, t + 13 min, t + 14 min và t + 15 min; tính khối lượng hao hụt hơi sau mỗi phút.

e) tính thể tích và độ lặp lại của pipet hoặc bộ phân phối, có tính đến hao hụt nước do bay hơi.

A.5.4. Thể tích của một số pipet tự động có thể bị ảnh hưởng bởi nhiệt truyền từ lòng bàn tay trong quá trình sử dụng bị kéo dài.

Kiểm tra hiện tượng này bằng qui định trong A.5.3 và tránh sử dụng các pipet này.

A.5.6. Dùng pipet lấy nước, dung dịch đệm, enzym, coenzym và dung dịch mẫu (cho đầu tip pipet càng thấp càng tốt) trong các góc khác nhau của cuvet.

Có thể dùng pipet để lấy các lượng nhỏ dung dịch/huyền phù enzym (10 ml đến 50 ml) cho vào cánh trộn để đưa vào cuvet và dùng cánh trộn để trộn với lượng chứa trong cuvet.

A.5.7. Tránh nhiễm bẩn

A.6. Thông tin bổ sung

...

...

...

A.6.2. Sử dụng dung dịch để kiểm tra phản ứng enzym. Chất chuẩn này phải được coi là dung dịch chuẩn làm việc.

CHÚ THÍCH: Các chất chuẩn có độ tinh khiết đã được xác nhận có thể thu được các tổ chức như là Viện Tiêu chuẩn và Công nghệ Quốc gia hoặc Trung tâm chuẩn của Châu Âu (BCR).

A.6.3. Tiến hành phép thử độ thu hồi có mặt dung dịch thử. Lượng chất phân tích được thêm vào phải giống như lượng có mặt trong mẫu thử.

A.6.4. Sử dụng một cánh trộn bằng chất dẻo cho mỗi cuvet hoặc mỗi cánh trộn chỉ được sử dụng một lần.

CHÚ THÍCH: Lượng chất lỏng dính lại trên cánh trộn phải không đáng kể.

TIÊU CHUẨN TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] TCVN 6400 (ISO 707), Sữa và sản phẩm sữa - Hướng dẫn lấy mẫu.

[2] TCVN 6910-1 : 2001 (ISO 5725-1 : 1994), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 1: Các định nghĩa và nguyên tắc chung.

...

...

...

[4] Giới thiệu danh pháp Enzym (1984) của Ủy ban danh pháp của Hiệp hội hóa sinh quốc tế Academic Press, New York, 1984.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8178:2009 (ISO/TS 2963 : 2006) về Phomat và sản phẩm phomat chế biến - Xác định hàm lượng axit xitric - Phương pháp enzym