9.4.6.2. Việc xác định biovar của Yersinia enterocolitica theo các phép thử trong Bảng D.1 (Phụ lục D) cần được thực hiện để khẳng định tính gây bệnh giả định (Tween-esteraza, aesculin, pyrazinamidaza, indol, xyloza, trehaloza), các Yersinia enterocolitica biovar 1B, 2, 3, 4 và 5 được biết là gây bệnh.

9.4.6.3. Các phép thử aesculin, pyrazinamidaza phải được xây dựng để xác định tính gây bệnh giả định. Chủng dương tính với aesculin và/hoặc pyrazinamidaza và âm tính phụ thuộc canxi ở 37 °C là loại không gây bệnh. Chủng âm tính với aesculin và pyrazinamidaza và dương tính phụ thuộc canxi ở 37 °C là gây bệnh. Các phép thử tính gây bệnh cần được thực hiện thường xuyên (xem [9]).

9.4.6.4. Đối với các mục đích về dịch tễ học, thì việc xác định các kháng nguyên thân của Yersinia enterocolitica cần được nghiên cứu. Các chủng gây bệnh giả định được kiểm tra kiểu huyết thanh bằng cách dùng kháng huyết thanh thích hợp thường là loại serovar O:3, O:8, O:9 và O:5,27.

10. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) nhiệt độ ủ đã sử dụng;

...

...

...

f) các kết quả thử nghiệm thu được hoặc nếu đáp ứng các yêu cầu về độ lặp lại thì nêu kết quả thu được;

Báo cáo thử nghiệm cũng phải nêu rõ nếu thực hiện các phép thử tiếp tại phòng thử nghiệm chuẩn và nếu có thì nêu kết quả thu được.

PHỤ LỤC A

(Quy định)

SƠ ĐỒ QUI TRÌNH

PHỤ LỤC B

...

...

...

THÀNH PHẨN VÀ CÁCH CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VÀ THUỐC THỬ

B.1. Canh thang pepton, sorbitol và muối mật (PSB)

B.1.1. Thành phần

Sản phẩm thủy phân casein bằng enzym

5,0 g

Sorbitol

10,0 g

Natri clorua

5,0 g

...

...

...

8,23 g

Natri dihydro phosphat ngậm một phân tử nước (Na₂HPO₄.H₂O)

1,2 g

Muối mật

1.5 g

Nước

1 000 ml

B.1.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần cơ bản hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần.

...

...

...

Phân phối môi trường vào các ống nghiệm hoặc bình cầu có dung tích thích hợp để thu được các lượng cần thiết cho phép thử (xem 9.1.2).

Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực (6.1) ở nhiệt độ 121 °C.

B.2. Canh thang Irgasan™, ticarcillin và kali clorat (ITC)

B.2.1. Môi trường cơ bản

B.2.1.1. Thành phần

Sản phẩm thủy phân casein bằng enzym

10,0 g

Chất chiết nấm men

1,0 g

...

...

...

60,0 g

Natri clorua (NaCI)

5,0 g

Xanh lục malachit, dung dịch 0,2 %

5,0 ml

Nước

1 000 ml

B.2.1.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần cơ bản hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần.

...

...

...

Phân phối môi trường cơ bản vào các bình cầu (6.7) có dung tích thích hợp để thu được các lượng cần thiết (ví dụ: 988 ml đối với 1 I môi trường hoàn chỉnh).

Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực (6.1) ở nhiệt độ 121 °C.

B.2.2. Dung dịch Ticarcillin (1 mg/ml)

B.2.2.1. Thành phần

Ticarcillin

10,0 mg

Nước

10 ml

B.2.2.2. Chuẩn bị

...

...

...

B.2.3. Dung dịch Irasan™ [5-clo-2-(2,4-diclorophenoxy)phenol] trong etanol (1 mg/ml)

B.2.3.1. Thành phần

Irgasan™

10,0 mg

Etanol, 95 % (thể tích)

10,0 ml

B.2.3.2. Chuẩn bị

Hòa tan Irgasan™ trong etanol khi cần dùng hoặc dung dịch này được bảo quản ở khoảng âm 20 °C trong không quá 4 tuần.

B.2.4. Dung dịch kali clorat (100 mg/ml)

...

...

...

Kali clorat (KClO₃)

10,0 g

Nước

100 ml

B.2.4.2. Chuẩn bị

Hòa tan kali clorat trong nước. Lọc để khử trùng.

B.2.5. Môi trường hoàn chỉnh

B.2.5.1. Thành phần

Môi trường cơ bản (B.2.1)

...

...

...

Dung dịch tircacillin (B.2.2)

1 ml

Dung dịch Irgasan (B.2.3)

1 ml

Dung dịch kali clorat (B.2.4)

10 ml

B.2.5.2. Chuẩn bị

Khi cần, cho tircacillin, Irgasan™ và dung dịch kali clorat một cách vô trùng vào môi trường cơ bản đã được làm nguội đến 47 °C và trộn.

Phân phối môi trường này một cách vô trùng vào các ống nghiệm với các lượng 10 ml hoặc 100 ml vào các bình cầu có dung tích thích hợp (xem 9.1.3), sao cho thu được tỷ lệ diện tích/thể tích là tối thiểu (kỵ khí tương đối).

...

...

...

B.3.1. Môi trường cơ bản

B.3.1.1. Thành phần

Sản phẩm thủy phân gelatin bằng enzym

17,0 g

Sản phẩm thủy phân casein và mô động vật

3,0 g

Chất chiết nấm men

2,0 g

Manitol

...

...

...

Natri pyruvat

2,0 g

Natri clorua

1,0 g

Magie sultat ngậm bảy phân tử nước (MgSO₄.7H₂O)

0,01 g

Natri desoxycolat

0,5 g

Đỏ trung tính

...

...

...

Tím tinh thể

0,001 g

Thạch

9 đến18 g1)

Nước

1 000 ml

B.3.1.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần cơ bản hoặc môi trường cơ bản khô trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần.

Chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng là 7,4 ± 0,2 ở 25 ^oC, nếu cần.

...

...

...

Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực (6.1) ở nhiệt độ 121 °C.

B.3.2. Dung dịch cefsulodin (15 mg/ml)

B.3.2.1. Thành phần

Cefsulodin

1,5g

Nước

100 ml

B.3.2.2. Chuẩn bị

Hòa tan cefsulodin trong nước. Lọc để khử trùng.

...

...

...

B.3.3.1. Thành phần

Irgasan™

0,4 g

Etanol, 95 % (thể tích)

100 ml

B.3.3.2. Chuẩn bị

Hòa tan Irgasan™ trong etanol khi cần dùng hoặc dung dịch này được bảo quản ở khoảng âm 20 °C trong không quá 4 tuần.

B.3.4. Dung dịch novobiocin (2,5 mg/ml)

B.3.4.1. Thành phần

...

...

...

0,25 g

Nước

100 ml

B.3.4.2. Chuẩn bị

Hòa tan novobiocin trong nước. Lọc để khử trùng.

B.3.5. Môi trường hoàn chỉnh

B.3.5.1. Thành phần

Môi trường cơ bản (B.3.1)

997 ml

...

...

...

1 ml

Dung dịch Irgasan (B.3.3)

1 ml

Dung dịch novobiocin (B.3.4)

1 ml

B.3.5.2. Chuẩn bị

Cho từng dung dịch kháng sinh này một cách vô trùng vào môi trường cơ bản đã được làm nguội đến 45°C và trộn đều.

B.3.5.3. Chuẩn bị các đĩa thạch CIN

Rót khoảng 15 ml môi trường hoàn chỉnh vào các đĩa Petri vô trùng (6.8). Để yên các đĩa.

...

...

...

B.4.1 Thành phần

Chất chiết nấm men

5,0 g

Chất chiết thịt

5,0 g

Sản phẩm thủy phân mô động vật bằng enzym

5,0 g

Lactoza

10,0 g

...

...

...

8,5 g

Natri desoxycolat

10,0 g

Canxi clorua

1,0 g

Natri xitrat

10,0 g

Natri thiosulfat ngậm năm phân tử nước

8,5 g

...

...

...

1,0 g

Xanh brilliant

0,0003 g

Đỏ trung tính

0,025 g

Thạch

9 g đến 18 g ^a

Nước

1 000 ml

...

...

...

B.4.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần khô hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun sôi.

Chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng là 7,4 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần.

Không khử trùng

B.4.3. Chuẩn bị các đĩa thạch SSDC

Rót khoảng 20ml môi trường đã làm nguội đến khoảng 45 °C vào các đĩa Petri vô trùng (6.8). Để yên các đĩa.

Nếu môi trường đã được chuẩn bị trước thì các đĩa thạch chưa khô phải được để trong túi bằng chất dẻo ở nơi tối khoảng 1 tuần ở 8 °C ± 2°C vì sẽ hình thành kết tủa trong môi trường và sẽ giảm hiệu năng của môi trường.

B.5. Thạch dinh dưỡng

B.5.1. Thành phần

...

...

...

3,0 g

Pepton

5,0 g

Thạch

9 g đến 18 g ^a

Nước

1 000 ml

^a Tùy thuộc vào sức đông của thạch

B.5.2. Chuẩn bị

...

...

...

Chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng là 7,0 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần.

Phân phối môi trường vào các bình cầu (6.7) có dung tích thích hợp.

Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực (6.1) ở nhiệt độ 121 °C.

B.5.3. Chuẩn bị các đĩa thạch dinh dưỡng

Rót khoảng 15 ml môi trường đã làm nguội đến khoảng 45 °C vào các đĩa Petri vô trùng (6.8). Để yên các đĩa.

B.6. Môi trường ure indol

B.6.1. Thành phần

L-Tryptophan, không chứa indol

3,0 g

...

...

...

1,0 g

Dikali hydro phosphat (K₂HPO₄)

1,0 g

Natri clorua

5,0 g

Ure

20,0 g

Etanol 95^o (thể tích)

10 ml

...

...

...

0,025 g

Nước

1 000 ml

B.6.2. Chuẩn bị

Hòa tan L-Tryptophan trong nước ở 60 °C. Làm nguội rồi hòa tan các thành phần còn lại trong nước, bằng cách khuấy.

Cách khác, hòa tan môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách khuấy.

Chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng là 6,9 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần.

Lọc để khử trùng.

Phân phối môi trường này một cách vô trùng, với các lượng 0,5 ml vào các ống nghiệm vô trùng có kích thước 12 mm x 50 mm (6.6). Bảo quản môi trường này ở 3 °C ± 2 °C, nơi tối.

...

...

...

B.7.1 Thành phần

4-Dimetylaminobenzaldehyt

5,0 g

Axit clohydric, r = 1,18 g/ml đến 1,19 g/ml

25 ml

2-Metylbutan-2-ol

75 ml

B.7.2. Chuẩn bị

Hòa tan 4-Dimetylaminobenzaldehyt trong 2-Metylbutan-2-ol để trong nồi cách thủy ở 60 °C.

...

...

...

Bảo quản ở 3 °C ± 2 °C, trong chai màu nâu. Không sử dụng chai có nút đậy bằng cao su vì sẽ làm hỏng thuốc thử.

B.8. Thạch Kligler

B.8.1. Thành phần

Chất chiết thịt

3,0 g

Chất chiết nấm men

3,0 g

Pepton pancreatic casein

20,0 g

...

...

...

5,0 g

Lactoza

10,0 g

Glucoza

1.0 g

Sắt (II) sulfat

0,2 g

Natri thiosultat ngậm năm phân tử nước (Na₂S₂O₃.5H₂O)

0,3 g

...

...

...

0,025 g

Thạch

9 g đến 18 g ^a

Nước

1 000 ml

* Tùy thuộc vào sức đông của thạch.

B.8.2 Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun sôi.

Chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng là 7,4 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần.

...

...

...

Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực (6.1) ở nhiệt độ 121 °C.

Để các ống thạch ở tư thế nghiêng, sao cho thu được cột thạch có chiều sâu 3 cm và đoạn nghiêng dài 5 cm.

B.9. Thuốc thử phát hiện oxidaza

B.9.1. Thành phần

N,N,N'N' -Tetrametyl-r-phenylendiamin dihydroclorua

1,0 g^a

Nước

100 ml

^a Có thể dùng oxalat để thay thế cho dihydroclorua nhưng hạn sử dụng của dung dịch sẽ ngắn hơn.

...

...

...

Hòa tan thành phần trên trong nước ngay trước khi sử dụng.

Khi được bảo quản ở 3 °C ± 2 °C và nơi tối, dung dịch bền không quá một tuần.

B.10. Môi trường lyzin decarboxylaza (LDC)

B.10.1. Thành phần

L-lyzin monohydroclorua

5,0 g

Chất chiết nấm men

3,0 g

Glucoza

...

...

...

Bromocresol tía

0,015 g

Nước

1 000 ml

B.10.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần.

Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 6,8 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần.

Phân phối môi trường này với các lượng 5 ml vào các ống nghiệm có kích thước 9 mm x 180 mm (6.6).

Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực (6.1) ở nhiệt độ 121 °C.

...

...

...

B.11.1. Thành phần

L-Ornithin monohydroclorua

5,0 g

Chất chiết nấm men

3,0 g

Glucoza

1,0 g

Bromocresol tía

0,015 g

...

...

...

1 000 ml

B.11.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần.

Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 6,8 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần.

Phân phối môi trường này với các lượng 5 ml vào các ống có kích thước 9 mm x 180 mm (6.6).

Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực (6.1) ở nhiệt độ 121 °C.

B.12. Môi trường lên men cacbohydrat (nước pepton với đỏ phenol, rhamnoza hoặc sacaroza hoặc trehaloza hoặc xyloza)

B.12.1. Môi trường cơ bản

B.12.1.1. Thành phần

...

...

...

10,0 g

Natri clorua

5,0 g

Đỏ phenol

0,02 g

Nước

1 000 ml

B.12.1.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên hoặc môi trường cơ bản khô trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần.

...

...

...

Phân phối môi trường cơ bản này vào các bình cầu (6.7) có dung tích thích hợp.

Khử trùng 10 min trong nồi hấp áp lực (6.1) ở nhiệt độ 121 °C.

B.12.2 Dung dịch cacbohydrat (rhamnoza, sacaroza, trehaloza hoặc xyloza 100 mg/ml)

B.12.2.1 Thành phần

Cacbohydrat (rhamnoza, sacaroza, trehaloza hoặc xyloza)

10,0 g

Nước

100 ml

B.12.2.2. Chuẩn bị

...

...

...

Lọc để khử trùng.

B.12.3. Môi trường hoàn chỉnh

B.12.3.1. Thành phần

Môi trường cơ bản (B.12.1)

900 ml

Dung dịch cacbohydrat (B.12.2)

100 ml

B.12.3.2. Chuẩn bị

Đối với từng cacbon hydrat, thêm một cách vô trùng dung dịch cacbohydrat vào môi trường cơ bản đã làm nguội đến khoảng 45 °C và trộn.

...

...

...

B.13. Môi trường Simmon xitrat

B.13.1. Thành phần

Natri xitrat

2,0 g

Natri clorua

5,0 g

Dikali hydro phosphat (K₂HPO₄)

1,0 g

Xanh bromothymol

...

...

...

Amoni dihydro phosphat (NH₄H₂PO₄)

1,0 g

Magie sulfat

0,2 g

Thạch

9 g đến 18 g ^a

Nước

1 000 ml

^a Tùy thuộc vào sức đông của thạch.

...

...

...

Hòa tan các thành phần trên hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun sôi.

Chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng là 6,8 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần.

Phân phối môi trường với các lượng 10 ml vào các ống nghiệm mới (6.6) có dung tích thích hợp. Nếu không có sẵn các ống nghiệm mới thì trước khi sử dụng phải làm sạch các ống nghiệm để các ống nghiệm này không chứa các chất gây nhiễu đến phép thử.

Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực (6.1) ở nhiệt độ 121 °C.

Để ống nghiệm ở tư thế nghiêng sao cho thu được mặt nghiêng có chiều sâu 2,5 cm.

B.14. Mổi trường thử Tween-esteaza

B.14.1. Môi trường cơ bản

B.14.1.1. Thành phần

Dịch thủy phân peptic của thịt

...

...

...

Natri clorua (NaCl)

5,0 g

Canxi clorua (CaCl₂)

0,1 g

Thạch

9 g đến 18 g ^a

Nước

1 000 ml

^a Tùy thuộc vào sức đông của thạch.

...

...

...

Hòa tan các thành phần trên trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần.

Chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng là 7,4 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần.

Khử trùng 30 min trong nồi hấp áp lực (6.1) ở nhiệt độ 121 °C.

B.14.2 Môi trường hoàn chỉnh

B.14.2.1. Thành phần

Môi trường cơ bản (B.14.1)

990 ml

Tween 80™ (sorbitol mono-oleat)

10 ml

...

...

...

Cho dung dịch Tween 80™ vào môi trường lỏng cơ bản và đồng hóa.

Khử trùng 30 min ở nhiệt độ 110 °C.

Phân phối môi trường hoàn chỉnh này với các lượng 2,5 ml vào các ống nghiệm (6.6) có dung tích thích hợp.

Để các ống nghiệm ở tư thế gần như nằm ngang sao cho mặt nghiêng dài nhất có đáy nhỏ nhất.

B.15. Thạch mật và aesculin

B.15.1. Thành phần

Chất chiết thịt

3,0 g

Pepton thịt

...

...

...

Aesculin

1,0 g

Muối mật

40,0 g

Sắt (III) xitrat

0,5 g

Thạch

9 g đến 18 g ^a

Nước

...

...

...

^a Tùy thuộc vào sức đông của thạch.

B.15.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun sôi nhẹ.

Chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng là 6,6 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần.

Phân phối môi trường với các lượng 10 ml vào các ống nghiệm (6.6) có dung tích thích hợp.

Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực (6.1) ở nhiệt độ 121 °C.

Để ống nghiệm ở tư thế nghiêng sao cho thu được mặt nghiêng có chiều sâu 2,5 cm.

B.16. Thạch casein đậu tương

B.16.1. Thành phần

...

...

...

15,0 g

Pepton đậu tương

5,0 g

Natri clorua

5,0 g

Thạch

9 g đến 18 g ^a

Nước

1 000 ml

...

...

...

B.16.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun sôi.

Chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng là 7,3 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần.

Phân phối môi trường vào các bình cầu (6.7) có dung tích thích hợp và với các lượng 830 ml (xem B.19.5.1). Môi trường này cần để sử dụng trong B. 19.5.1.

Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực (6.1) ở nhiệt độ 121 °C.

B.17. Thạch casein đậu tương để phát hiện pyrazinamidaza

B.17.1. Thành phần

Sản phẩm thủy phân casein bằng enzym

15,0 g

...

...

...

5,0 g

Pyrazincarboxamid (C₅H₅N₃O)

1,0 g

Natri clorua

5,0 g

Thạch

9 g đến 18 g ^a

Dung dịch đệm tris-maleat (0,2 mol/l, pH 6)

1 000 ml

...

...

...

B.17.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần cơ bản hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun sôi.

Chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng là 7,3 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần.

Phân phối môi trường với các lượng 10 ml vào các bình cầu (6.7) có dung tích thích hợp.

Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực (6.1) ở nhiệt độ 121 °C.

Sau khi khử trùng, để ở tư thế nghiêng sao cho thu được mặt nghiêng dài.

B.18. Dung dịch amoni sắt (III) sulfat để phát hiện pyrazinamidaza

B.18.1. Thành phần

Amoni sắt (II) sulfat

...

...

...

Nước

100 ml

B.18.2. Chuẩn bị

Ngay trước khi sử dụng, hòa tan amoni sắt (II) sulfat trong nước.

B.19. Thạch casein đậu tương có magie và oxalat

B.19.1. Môi trường cơ bản (xem B.16)

B.19.2. Dung dịch magie clorua

B.19.2.1. Thành phần

Magie clorua ngậm sáu phân tử nước (MgCI₂.6H₂O) (0,25 mol/l)

...

...

...

Nước

100 ml

B.19.2.2. Chuẩn bị

Hòa tan magie clorua trong nước. Lọc để khử trùng.

B.19.3. Dung dịch natri oxalat

B.19.3.1. Thành phần

Natri oxalat

3,35 g

Nước

...

...

...

B.19.3.2. Chuẩn bị

Hòa tan natri oxalat trong nước. Lọc để khử trùng.

B.19.4. Dung dịch glucoza

B.19.4.1. Thành phần

Glucoza

18,0 g

Nước

100 ml

B.19.4.2. Chuẩn bị

...

...

...

B.19.5. Môi trường hoàn chỉnh

B.19.5.1. Thành phần

Môi trường cơ bản (B.16)

830 ml

Dung dịch magie clorua (B.19.2)

80 ml

Dung dịch natri oxalat (B.19.3)

80 ml

Dung dịch glucoza (B.19.4)

...

...

...

B.19.5.2. Chuẩn bị

Bổ sung một cách vô trùng các dung dịch magie clorua, natri oxalat và glucoza vào môi trường cơ bản đã được làm nguội đến 47 °C và trộn.

B.19.5.3. Chuẩn bị các đĩa thạch

Rót các lượng khoảng 15 ml môi trường hoàn chỉnh vào các đĩa Petri vô trùng (6.8). Để yên các đĩa này cho môi trường lắng xuống.

B.20. Dung dịch muối

B.20.1. Thành phần

Natri clorua

5,0 g

Nước

...

...

...

B.20.2. Chuẩn bị

Hòa tan natri clorua trong nước.

Phân phối dung dịch vào các bình cầu (6.7) có dung tích thích hợp.

Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực (6.1) ở nhiệt độ 121 °C.

B.21. Kali hydroxit trong dung dịch muối

B.21.1. Thành phần

Kali hydroxit (KOH)

0,5 g

Dung dịch muối (B.20)

...

...

...

B.21.2. Chuẩn bị

Hòa tan kali hydroxit trong dung dịch muối.

Phân phối dung dịch vào các bình cầu (6.7) có dung tích thích hợp.

Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực (6.1) ở nhiệt độ 121 °C.

CHÚ THÍCH Dung dịch gốc kali hydroxit 40 % có thể được chuẩn bị và bảo quản ở 3 °C ± 2 °C. Pha loãng dung dịch này bằng dung dịch NaCl 0,5 % với tỷ lệ 1 : 80 để có được dung dịch KOH 0,5 %.

B.22. Canh thang thịt bê pha loãng

B.22.1. Thành phần

Chất chiết từ thịt bê (dạng khô)

5,0 g

...

...

...

10 g

Natri clorua

5g

Nước cất

1 000 ml

B.22.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun sôi.

Chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng là 7,4 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần.

Phân phối môi trường với các lượng 10 ml vào các ống nghiệm (6.6) và đậy nắp.

...

...

...

B.23. Glyxerol vô trùng

Phân phối glyxerol với các lượng 100 ml vào các bình cầu hoặc chai và khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực (6.1) ở nhiệt độ 121 °C.

PHỤ LỤC C

(Tham khảo)

CÁC ĐẶC TRƯNG HÓA SINH CỦA YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS, YERSINIA ENTEROCOLITICA VÀ CÁC LOÀI CÓ HÓA SINH LIÊN QUAN

Bảng C.1 - Các đặc trưng hóa sinh của Yersinia

Phép thử

Yersinia pseudotuberculosis

...

...

...

Các loài có liên quan

Glucoza

+ ^a

+

+

Sinh khí từ glucoza

-

- (hoặc một số bọt khí)

- (hoặc một số bọt khí)

...

...

...

-

-

-

ONPG

+

+/-

+/-

Adonitol

-

...

...

...

-

Cellobioza

-

+

D

Dulcitol

-

-

-

...

...

...

+

+

+

Melibioza

+/-

-

D

Rhamnoza

+

...

...

...

D

Sacaroza

-

+

D

Sorbitol

-

+/-

D

...

...

...

+

+/-

+

Xyloza

+

D

+

Aesculin

+

...

...

...

D

Salicin

+

D

D

Ure

+

+

+

...

...

...

-

D

D

Voges Proskauer

-

+*/-

D

Hydro sulfua

-

...

...

...

-

Deaminaza (APP)

-

-

-

Lysin

-

-

-

...

...

...

-

+/-

+

Xitrat (Simmons)

-

-

D

Lipaza (Tween 80)

-

...

...

...

D

Mucat

-

D

^a + dương tính; - âm tính; +/- phần lớn các chủng dương tính; D các kiểu hóa sinh khác nhau.

* Các chủng thường âm tính ở 37 ^oC.

PHỤ LỤC D

...

...

...

BIOVAR (BIOTYPE) CỦA YERSINIA ENTEROCOLITICA

Biovar

Tween-esteraza

Aesculin

Pyrazinamidasa

Indol

Xyloza

Trehaloza

1A^a

...

...

...

+

+

+

+

+

1B

+

-

-

...

...

...

+

+

2

-

-

-

(+)^b

+

+

...

...

...

-

-

-

-

+

+

4

-

-

...

...

...

-

-

+

5

-

-

-

-

D^b

...

...

...

^a Không gây bệnh

^b Thường yếu và phát triển chậm.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Wauters. G., Goossens. V., Janssens. M. and Vanoepitte, J. New enrichment method for isolation of pathogenic Yersinia enlerocolitica serogroup O:3 from pork. Appl. Environ. Microbiol., 54. 1988. pp. 851-854

[2] DE Boer. E. Isolation of Yersinia enlerocolitica from foods, Int. J. Food Microbiol., 17, 1992, pp. 75-84

[3] De Zutter. L. Le Mort. L, Janssens. M. and Wauters. G. Short-comings of irgasan ticarcillin chlorate broth for the enrichment of Yersinia enlerocolitica biovar 2, serovar 9 from meat. Int. J. Food. Microbiol., 23, 1994. pp. 231-237

[4] Schiemann, D.A. Synthesis of selective agar medium for Yersinia enterocolitica. Can. J Microbiol., 25. 1979, pp. 1298-1304

[5] Aulisio. C.C.G., Mehlman, I.J. and Sanders. A.C. Alkali method for rapid recovery of Yersinia enlerocolitica and Yersinia pseudotuberculosis from foods. Appl. Environ. Microbiol., 39. 1980. pp. 135-140

...

...

...

[7] Sharma. N.K.. Doyle, P.W., GERBasi, S.A. and Jessop. J.H. Identification of Yersinia species by the API 20E. J. Clin. Microbiol., 28.1990, pp. 1443-1444

[8] Farmer III, J.J.. Carter, G.P., Miller, V.L., Falkow, S. and Wachsmuth, I.K. Pyrazinamidase, CR-MOX Agar. Salicin Fermentation - Esculin Hydrolysis, and D-Xylose fermentation for identifying pathogenic serotypes of Yersinia enterocolitica. J. Clin. Microbiol., 30. 1992. pp. 2589-2594

[9] Food and Drug Administration. Protocol in FDA. Yersinia enlerocolitica and Yersinia pseudotuberculosis. In: Bacteriological Analytical Manual, 8^th edn., Washington, DC, 1998.

1) Tùy thuộc vào sức đông của thạch.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8127:2009 (ISO 10273 : 2003) về Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp phát hiện Yersinia enterocolitica gây bệnh giả định