Tiến hành kiểm tra với các dung dịch chuẩn và sữa kiểm chứng trong 5 lần theo quy trình mô tả trong Điều 9. Xác định độ nhạy của huyền phù vi sinh vật thử nghiệm đối với benzylpenicillin và oxytetracycline với ống A (5.2.5) và độ nhạy đối với sulfadiazine, neomycin và erythromycin với ống B (5.2.6). Tất cả các ống nghiệm trên phải thu được kết quả dương tính.

5.2. Môi trường nuôi cấy

Để tăng độ tái lập của phương pháp, nên sử dụng các thành phần cơ bản khô hoặc môi trường hoàn chỉnh khô khi chuẩn bị môi trường nuôi cấy. Tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

5.2.1. Môi trường cơ bản

5.2.1.1. Thành phần

Casein tryton

5,0 g

Chất chiết nấm men

2,5 g

...

...

...

1,0 g

Thạch

10 g đến 15 g

Nước

1 000 ml

CHÚ THÍCH: Môi trường cơ bản khô có bán sẵn, chẳng hạn Thạch Đếm Đĩa.

5.2.1.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong nước và đun nóng. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,0 ± 0,2.

Khử trùng trong nồi hấp áp lực ở nhiệt độ 120 ^oC ± 1^oC trong 15 min.

...

...

...

5.2.2. Dung dịch bromocrezol tía

5.2.2.1. Thành phần

Bromocrezol tía

250 g

Etanol, 96%

5 ml

Nước

100 ml

5.2.2.2. Chuẩn bị

...

...

...

Dung dịch bromocrezol tía có thể lưu giữ tối đa được 6 tháng khi được bảo quản nơi tối ở nhiệt độ từ 0 ^oC đến +5 ^oC.

5.2.3. Dung dịch chloramphenicol (CAP)

5.2.3.1. Thành phần

Chloramphenicol

20,0 mg

Metanol

5 ml

Nước

100 ml

...

...

...

Hòa tan chloramphenicol trong metanol. Thêm nước đến 100 ml.

Dung dịch chloramphenicol có thể lưu giữ tối đa được 1 tháng khi được bảo quản nơi tối ở nhiệt độ từ 0 ^oC đến +5 ^oC.

5.2.4. Dung dịch trimethoprim (TMP)

5.2.4.1. Thành phần

Trimethoprim

25,0 mg

Etanol, 96%

5 ml

Nước

...

...

...

5.2.4.2. Chuẩn bị

Hòa tan trimethoprim trong etanol. Thêm nước đến 1 000 ml.

Dung dịch TMP có thể lưu giữ tối đa được 1 tháng khi được bảo quản nơi tối ở nhiệt độ từ 0 ^oC đến +5 ^oC.

5.2.5. Ống nghiệm A (pH = 7)

Làm tan chảy môi trường cơ bản (5.2.1). Để nguội môi trường trên nồi cách thủy (6.3) tới nhiệt độ 63 ^oC ± 1^oC . Thêm 1,5 ml dung dịch CAP (5.2.3) và 2 ml dung dịch bromocrezol tía (5.2.2) vào 100 ml môi trường cơ bản đã gia nhiệt, đồng thời giữ môi trường này trên nồi cách thủy ở nhiệt độ 63 ^oC. Trộn kỹ môi trường.

Tiếp tục giữ môi trường trên nồi cách thủy ở nhiệt độ 63 ^oC, dùng dung dịch NaOH 1 mol/l hoặc HCl 1 mol/l để chỉnh pH (xem 6.5) đến 7,0 ± 0,1 ở nhiệt độ nói trên.

Sau đó, thêm một thể tích (khoảng 2 ml) huyền phù vi sinh vật thử nghiệm (5.1) vào mỗi 100 ml môi trường, sau khi ủ trên nồi cách thủy ở nhiệt độ 63 ^oC trong 4 h 15 min ± 30 min mà không đổi màu chứng tỏ không có chất kháng sinh.

Trộn và phân phối vào các ống nghiệm (6.4) mỗi ống 1 ml môi trường thử nghiệm và để cho môi trường đông đặc.

Các ống A có thể được bảo quản tối đa 3 ngày ở nhiệt độ từ từ 0 ^oC đến +5 ^oC, với điều kiện các ống được giữ kín để không làm bay hơi (ví dụ dùng parafilm).

...

...

...

Làm tan chảy môi trường cơ bản (5.2.1). Để nguội môi trường trên nồi cách thủy (6.3) tới nhiệt độ 63 ^oC ± 1^oC . Thêm 0,6 ml dung dịch TMP (5.2.4) và 2 ml dung dịch bromocrezol tía (5.2.2) vào 100 ml môi trường cơ bản đã gia nhiệt trước, đồng thời giữ môi trường này trên nồi cách thủy ở nhiệt độ 63 ^oC. Trộn kỹ môi trường.

Tiếp tục giữ môi trường trên nồi cách thủy ở nhiệt độ 63 ^oC, dùng dung dịch NaOH 1 mol/l hoặc HCl 1 mol/l để chỉnh pH (xem 6.5) đến 8,00 ± 0,02 ở nhiệt độ nói trên. Trong khi chỉnh, chú ý không để pH của môi trường vượt quá 8,05.

Sau đó, thêm một thể tích (khoảng 2 ml) huyền phù vi sinh vật thử nghiệm (5.1) vào mỗi 100 ml môi trường, sau khi ủ trên nồi cách thủy ở nhiệt độ 63 ^oC trong 4 h 15 min ±  30 min mà không đổi màu chứng tỏ không có chất kháng sinh.

Trộn và phân phối vào các ống nghiệm (6.4) mỗi ống 1 ml môi trường thử nghiệm và để cho môi trường đông đặc.

Các ống B có thể được bảo quản tối đa 3 ngày ở nhiệt độ từ 0 ^oC đến +5 ^oC, với điều kiện các ống được giữ kín để tránh bị bay hơi (ví dụ dùng parafilm).

5.3. Dung dịch chuẩn và mẫu kiểm chứng

Chỉnh các khối lượng cân sao để có độ tinh khiết và hàm lượng muối phù hợp với ISO 13969.

Để chuẩn bị các dung dịch chuẩn và mẫu kiểm chứng, giả sử 1 ml dung dịch tương đương với 1 g dung dịch.

5.3.1. Dung dịch chuẩn và mẫu kiểm chứng benzylpenicillin

...

...

...

5.3.1.1. Dung dịch gốc chuẩn benzylpenicillin

Hòa tan 20,0 mg ± 0,1 mg benzylpenixillin trong 1 000 ml nước và trộn. Dung dịch gốc chuẩn này chứa benzylpenixillin 20 mg/l.

Dung dịch gốc chuẩn benzylpenixillin có thể lưu giữ tối đa 2 ngày khi được bảo quản ở nhiệt độ từ 0 ^oC đến +5 ^oC.

5.3.1.2. Dung dịch làm việc chuẩn benzylpenicillin

Pha loãng 10 ml dung dịch gốc chuẩn benzylpenixillin (5.3.1.1) bằng nước đến 1 000 ml và trộn. Dung dịch gốc làm việc này chứa benzylpenixillin 200 µg/l.

5.3.1.3. Mẫu sữa kiểm chứng Benzylpenicillin

Pha loãng 1 ml dung dịch làm việc chuẩn benzylpenixillin (5.3.1.2) bằng mẫu sữa âm tính với chất kháng sinh (5.4) đến 100 ml và trộn. Mẫu sữa kiểm chứng này chứa benzylpenixillin 2 µg/l.

Mẫu sữa kiểm chứng benzylpenicillin có thể lưu giữ tối đa được 2 tháng khi được bảo quản trong các ống nghiệm (6.4) ở nhiệt độ dưới -18 ^oC.

CHÚ THÍCH: 1 mg muối kali penixillin-G tinh khiết tương đương với 1 595 UI (đơn vị quốc tế) penixillin G. 1 mg muối natri penixillin-G tinh khiết tương đương với 1 670 UI penixillin G.

...

...

...

5.3.2.1. Dung dịch gốc chuẩn oxytetracycline

Hòa tan 5,0 mg ± 0,1 mg oxytetracycline trong 10 ml dung dịch HCl 0,1 mol/l. Pha loãng bằng nước đến 100 ml và trộn. Dung dịch gốc chuẩn này chứa oxytetracycline 50 mg/l.

Dung dịch gốc chuẩn oxytetracycline có thể lưu giữ tối đa được 1 tuần khi được bảo quản nơi tối ở nhiệt độ từ 0 ^oC đến +5 ^oC.

5.3.2.2. Dung dịch làm việc chuẩn oxytetracycline

Pha loãng 10 ml dung dịch gốc chuẩn oxytetracycline (5.3.2.1) bằng nước đến 100 ml và trộn. Dung dịch gốc làm việc này chứa oxytetracycline 5 000 µg/l.

5.3.2.3. Mẫu sữa kiểm chứng oxytetracycline

Pha loãng 2 ml dung dịch làm việc chuẩn oxytetracycline (5.3.2.2) với mẫu sữa âm tính (5.4) đến 100 ml và trộn. Mẫu sữa kiểm chứng này chứa oxytetracycline 100 µg/l.

Mẫu sữa kiểm chứng oxytetracycline có thể lưu giữ tối đa được 3 tháng khi được bảo quản trong các ống nghiệm (6.4) ở nhiệt độ dưới -18 ^oC.

5.3.3. Dung dịch chuẩn sulfadiazine và mẫu kiểm chứng sulfadiazine

...

...

...

Hòa tan 15,0 mg ± 0,1 mg sulfadiazine trong 100 ml nước và trộn. Dung dịch gốc chuẩn này chứa sulfadiazine 150 mg/l.

Dung dịch gốc chuẩn sulfadiazine có thể lưu giữ tối đa được 2 tuần khi được bảo quản ở nhiệt độ từ 0 ^oC đến +5 ^oC.

5.3.3.2. Dung dịch làm việc chuẩn sulfadiazine

Pha loãng 10 ml dung dịch gốc chuẩn sulfadiazine (5.3.3.1) bằng nước đến 100 ml nước và trộn. Dung dịch gốc làm việc này chứa sulfadiazine 15 000 µg/l.

5.3.3.3. Mẫu sữa kiểm chứng sulfadiazine

Pha loãng 1 ml dung dịch làm việc chuẩn sulfadiazine (5.3.3.2) bằng mẫu sữa âm tính (5.4) đến 100 ml và trộn. Mẫu sữa kiểm chứng này chứa sulfadiazine 150 µg/l.

Mẫu sữa kiểm chứng sulfadiazine có thể lưu giữ tối đa được 2 tháng khi được bảo quản trong các ống nghiệm (6.4) ở nhiệt độ dưới -18 ^oC.

5.3.4. Dung dịch chuẩn neomycin và mẫu kiểm chứng neomycin

5.3.4.1. Dung dịch gốc chuẩn neomycin

...

...

...

Dung dịch gốc chuẩn neomycin có thể lưu giữ tối đa được 2 tuần khi được bảo quản ở nhiệt độ từ 0 ^oC đến +5 ^oC.

5.3.4.2. Dung dịch làm việc chuẩn neomycin

Pha loãng 10 ml dung dịch gốc chuẩn neomycin (5.3.4.1) bằng nước đến 100 ml nước và trộn. Dung dịch gốc làm việc này chứa neomycin 3 000 µg/l.

5.3.4.3. Mẫu sữa kiểm chứng neomycin

Pha loãng 1 ml dung dịch làm việc chuẩn neomycin (5.3.4.2) bằng sữa âm tính (5.4) đến 100 ml và trộn. Mẫu sữa kiểm chứng này chứa neomycin 30 µg/l.

Mẫu sữa kiểm chứng neomycin có thể lưu giữ tối đa được 2 tháng khi được bảo quản trong các ống nghiệm (6.4) ở nhiệt độ dưới -18 ^oC.

5.3.5. Dung dịch chuẩn erythromycin và mẫu kiểm chứng erythromycin

5.3.5.1. Dung dịch gốc chuẩn erythromycin

Hòa tan 20,0 mg ± 0,1 mg erythromycin trong 5 ml metanol. Pha loãng bằng nước đến 1 000 ml và trộn. Dung dịch gốc chuẩn này chứa erythromycin 20 mg/l.

...

...

...

5.3.5.2. Dung dịch làm việc chuẩn erythromycin

Pha loãng 5 ml dung dịch gốc chuẩn erythromycin (5.3.5.1) bằng nước đến 100 ml và trộn. Dung dịch gốc làm việc này chứa erythromycin 1 000 µg/l.

5.3.5.3. Mẫu sữa kiểm chứng erythromycin

Pha loãng 1 ml dung dịch làm việc chuẩn erythromycin (5.3.5.2) bằng sữa âm tính (5.4) đến 100 ml và trộn. Mẫu sữa kiểm chứng này chứa erythromycin 10 µg/l.

Mẫu sữa kiểm chứng Sulfadiazine có thể lưu giữ tối đa được 2 tháng khi được bảo quản trong các ống nghiệm (6.4) ở nhiệt độ dưới -18 ^oC.

5.4. Mẫu sữa âm tính (sữa không chứa chất kháng sinh)

Xem phương pháp thu được sữa kiểm chứng trong ISO 13969, hoặc sử dụng sữa nguyên chất tiệt trùng UHT không chứa các chất ức chế vi sinh vật.

6. Thiết bị và dụng cụ thủy tinh

Có thể dùng dụng cụ thủy tinh sử dụng một lần thay cho dụng cụ thủy tinh sử dụng nhiều lần nếu đáp ứng được các yêu cầu quy định.

...

...

...

6.1. Thiết bị hấp áp lực, dùng để khử trùng ẩm

Xem TCVN 6404 (ISO 7218).

6.2. Micropipet, dung tích 1 000 µl.

6.3. Nồi cách thủy, có nắp kín, được khống chế nhiệt ổn định, có thể tuần hoàn nước và duy trì nhiệt độ ổn định ở 63 ^oC ± 1 ^oC, 70 ^oC ± 1 ^oC và 80 ^oC ± 1 ^oC.

6.4. Ống nghiệm, đường kính khoảng 16 mm và dài khoảng 80 cm.

6.5. Máy đo pH, có độ chính xác ± 0,01 đơn vị pH, được trang bị bộ điều chỉnh nhiệt độ tự động và điện cực thích hợp cho các phép đo trong chất lỏng ở 63 ^oC (ví dụ điện cực Ag/AgCl).

6.6. Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg và có thể đọc đến 0,01 mg.

6.7. Giá đựng ống nghiệm, thích hợp để giữ ống nghiệm (6.4).

7. Lấy mẫu

...

...

...

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 6400 (ISO 707).

8. Chuẩn bị mẫu thử

Điều quan trọng là mẫu thử sữa dạng lỏng cần được thử nghiệm ngay. Hoàn nguyên mẫu sữa bột với nước cất trước khi thử nghiệm.

9. Cách tiến hành

9.1. Mẫu kiểm chứng

Trên mỗi giá đựng ống nghiệm (6.7) đặt các ống nghiệm sau đây và thêm vào mỗi ống 0,3 ml sữa kiểm chứng dương tính hoặc mẫu sữa âm tính:

a) ống A (5.2.5) chứa mẫu sữa kiểm chứng benzylpenicillin (5.3.1.3);

b) ống A (5.2.5) chứa mẫu sữa kiểm chứng oxytetracycline (5.3.2.3);

c) ống A (5.2.5) chứa mẫu sữa âm tính (5.4);

...

...

...

e) ống B (5.2.6) chứa mẫu sữa kiểm chứng sulfadiazine (5.3.3.3);

f) ống B (5.2.6) chứa mẫu sữa âm tính (5.4).

Khi thử nghiệm một lượng lớn mẫu thử cho thấy phần lớn số mẫu thử không chứa chất kháng sinh thì cấc mẫu thử này được coi là mẫu âm tính.

9.2. Chuẩn bị ống nghiệm

9.2.1. Dùng pipet lấy 10 ml mẫu thử vào ống nghiệm thủy tinh. Gia nhiệt trên nồi cách thủy (6.3), giữ ở nhiệt độ 80 ^oC  trong 10 min để bất hoạt các chất ức chế tự nhiên không bền nhiệt. Làm nguội nhanh về nhiệt độ phòng.

9.2.2. Dùng pipet lấy 0,3 ml phần mẫu thử (9.2.1) cho vào các ống A và B tương ứng (5.2.5) đã dán nhãn.

9.2.3. Giữ các ống A và B trên giá (6.7) ở nhiệt độ phòng trong 1 h để sữa được khuếch tán.

9.2.4. Rót một lớp sữa lên trên thạch. Bọc các ống bằng giấy nhôm hoặc đậy nắp để tránh làm bay hơi nước.

Sau khi phân tán, đặt các ống vào nồi cách thủy (6.3) ở 70 ^oC  trong 10 min để hoạt hóa các bào tử bằng sốc nhiệt.

...

...

...

Đặt các ống nghiệm (9.2.4) vào nồi cách thủy (6.3) ở nhiệt độ 63 ^oC. Ủ nhiệt độ này trong 4 h 15 min ± 30 min cho đến khi màu của các ống nghiệm liên quan (A hoặc B) với sữa âm tính chuyển hoàn toàn từ màu đỏ tía sang màu vàng.

Màu của các ống nghiệm liên quan (A hoặc B) với các mẫu sữa kiểm chứng ít nhất phải giữ được màu đỏ tươi khi lấy các ống nghiệm ra ngoài. Ngay sau đó, lấy tất cả các ống nghiệm (A hoặc B) ra khỏi nồi cách thủy và để nhiệt độ giảm xuống nhiệt độ phòng trong 10 min.

9.4. Diễn giải

Quan sát và ghi nhận lại màu của các ống chứa các mẫu thử và mẫu kiểm chứng như sau:

a) Toàn bộ hoặc một phần môi trường thử nghiệm rắn có màu đỏ tía trong bất kỳ ống nghiệm nào chứa mẫu thử hoặc mẫu kiểm chứng chứng tỏ có mặt của các chất ức chế vi sinh vật thử nghiệm và chứng tỏ phép thử là dương tính.

b) Toàn bộ môi trường thử nghiệm rắn có màu vàng trong bất kỳ ống nghiệm nào chứa mẫu thử hoặc mẫu kiểm chứng chứng tỏ không phát hiện có các chất ức chế vi sinh vật thử nghiệm và chứng tỏ phép thử là âm tính

Màu của các ống nghiệm chứa mẫu sữa âm tính phải là màu vàng, trong khi các ống nghiệm chứa mẫu sữa kiểm chứng phải giữ màu đỏ tía. Nếu không thì phải lặp lại phép thử nghiệm. Nếu các mẫu sữa kiểm chứng và/hoặc sữa âm tính phát triển màu khác nhau trong các lần lặp lại thì phải tìm ra nguyên nhân.

10. Khẳng định (tùy chọn)

10.1. Yêu cầu chung

...

...

...

CHÚ THÍCH: Sự có mặt của các chất kháng sinh lẫn chất ức chế trong mẫu thử có thể gây khó khăn trong việc khẳng định này.

10.2. Khẳng định beta-lactam

Có thể dùng beta-lactam để kiểm tra sự có mặt của dư lượng penixillin và cephalosporin trong các mẫu thử dương tính với ống A (5.2.5) và ống B (5.2.6). Nếu hoạt tính ức chế trong mẫu xử lý với beta-lactamaza bị mất tác dụng thì có thể coi như có mặt dư lượng beta-lactam.

Có thể phân biệt hai dạng enzym beta-lactamaza:

- penixillinaxa (hoạt tính beta I), hoạt động mạnh hơn trong sự suy giảm penixillin, và

- cephalosporinaza (hoạt tính beta II), hoạt động mạnh hơn trong sự suy giảm cephalosporin.

VÍ DỤ: Sau đây là quy trình thử nghiệm sử dụng penixillinaza. Thêm 2 ml penaza đậm đặc chứa 10 000 000 UI penaza/ml (có sẵn của hãng Becton, Dickinson and Company2) vào 100 ml môi trường thử nghiệm trong ống A (5.2.5) trước khi chỉnh pH. Trộn và phân phối vào mỗi ống 1 ml môi trường thử nghiệm và để cho môi trường đông đặc lại. Sau đó thực hiện quy trình thử nghiệm theo mô tả trong Điều 9.

Một số loại beta-lactam (ví dụ cephalexin) ít nhạy hơn với beta-lactamaza. Đối với các trường hợp này, nên xử lý trước mẫu sữa (dùng 0,3 ml penaza đậm đặc cho 1ml mẫu thử ở nhiệt độ 37 ^oC trong 2 h).

10.3. Khẳng định sulfonamide

...

...

...

VÍ DỤ: Thêm 2 ml dung dịch p-amino axit benzoic (5 g/kg nước) vào 100 ml môi trường thử nghiệm trong ống B (5.2.6) sau khi đã bổ sung vi sinh vật thử nghiệm và trước khi chỉnh pH. Trộn và phân phối vào các ống mỗi ống 1 ml môi trường thử nghiệm và để cho môi trường đông đặc lại. Sau đó thực hiện quy trình thử nghiệm theo mô tả trong Điều 9.

10.4. Khẳng định đối với các chất ức chế khác

Nếu các chất ức chế khác không nhận dạng được như beta-lactam và sulfonamide thì cần tiếp tục nhận diện bằng các phép thử nghiệm khác, như hệ thống thử nghiệm vi sinh vật nhiều đĩa, thử nghiệm miễn dịch hay các phương pháp hóa học (HPLC, LC-MS) (xem ISO 18330).

11. Biểu thị kết quả

Biểu thị kết quả bằng cách chỉ ra sự có mặt hay không có mặt của các chất kháng sinh.

12. Độ chụm

Xem Phụ lục A về giới hạn phát hiện của một số chất kháng sinh có trong sữa đối với phương pháp phân tán trong ống nghiệm.

13. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

...

...

...

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng;

c) phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng tới kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Dữ liệu thu được từ các nghiên cứu cộng tác

Giới hạn phát hiện đối với phương pháp hai ống nghiệm, ống A (pH = 7) và ống B (pH = 8), tính bằng microgam trong một kilôgam sữa, thu được từ một số nghiên cứu cộng tác^[3]với sự tham gia của ba phòng thử nghiệm có kinh nghiệm của Hà Lan. Kết quả được đưa ra trong các Bảng A.1 đến A.5

...

...

...

Beta-lactam

Ống nghiệm A

mg/kg

Ống nghiệm B

mg/kg

Benzylpenicillin

2

3

Amoxycillin

...

...

...

3

Cloxacillin

20

Ceftiofur

50

Cephalexin

...

...

...

Bảng A.2 - Macrolide

Macrolide

Ống nghiệm A

mg/kg

Ống nghiệm B

mg/kg

Erythromycin

10

...

...

...

200

Tylosin

20

Bảng A.3 - Aminoglycoside

Aminoglycoside

Ống nghiệm A

mg/kg

...

...

...

mg/kg

Dihydrostreptomycin

70

Neomycin

30

Kanamycin

...

...

...

Getamicin

20

Bảng A.4 - Tetacycline 

Tetracycline

Ống nghiệm A

mg/kg

Ống nghiệm B

mg/kg

...

...

...

100

400

Tetracycline

100

300

Doxycycline

100

Clotetracycline

...

...

...

>800

Bảng A.5 - Sulfonamide

Sulfonamide

Ống nghiệm A

mg/kg

Ống nghiệm B

mg/kg

Dapsone

...

...

...

Sulphamethazine

400

Sulfadiazine

150

Phụ lục B

(Tham khảo)

...

...

...

B.1. Vi sinh vật thử nghiệm

Thu lấy chủng Geobacillus stearothermophilus ATCC 10149 (tương tự chủng C953 của NIZO), ví dụ từ ATCC (http://www.atcc.org/)³) hoặc từ các nguồn khác.

B.2. Chủng gốc

B.2.1. Thạch nghiêng

B.2.1.1. Thành phần

Chất chiết nấm men

2 g

Pepton

5 g

...

...

...

1 g

Natri clorua (NaCl)

5 g

Mangan sulfat (MnSO₄.H₂O)

35 mg

Thạch

15 g

Nước cất

1 000 ml

...

...

...

B.2.1.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần vào nước bằng cách đun nóng. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,4 ± 0,1. Khử trùng môi trường bằng hấp áp lực 15 min ở nhiệt độ 121 ^oC ± 1 ^oC.

Trước khi đông đặc, chuyển môi trường vào các ống nghiệm thủy tinh vô trùng và có nắp đậy (dung tích khoảng 10 ml) và để cho thạch đông đặc theo tư thế nằm nghiêng.

B.2.2. Duy trì chủng thử nghiệm

Ủ ống thạch nghiêng (B.2.1), dùng vòng cấy để cấy vạch chủng cấy thử nghiệm ATCC và để 48 h trong tủ ấm ở nhiệt độ 63 ^oC ± 1 ^oC. Sau khi ủ, hơ đầu ống nghiệm trên ngọn lửa rồi mở một đường nhỏ vào trong ống nghiệm và đậy bằng nút cao su vô trùng. Ống nghiệm chứa chủng gốc thu được như vậy có thể giữ trong vài tháng trong tủ lạnh ở nhiệt độ 5 ^oC hoặc có thể được giữ như huyền phù vi sinh vật thử nghiệm trong tủ lạnh đông sau ở nhiệt độ dưới -20 ^oC.

B.3. Nhân chủng vi sinh vật thử nghiệm

B.3.1. Chuyển nhanh 20 ml thạch nghiêng (B.2.1) đã tan chảy vào một đĩa Petri vô trùng đường kính 140 mm và làm nguội đến nhiệt độ phòng.

B.3.2. Dùng pipet vô trùng lấy 5 ml nước cất cho vào ống nghiệm chứa chủng gốc (B.2.2). Chuẩn bị huyền phù vi sinh vật thử nghiệm bằng cách dùng vòng cấy nhúng nhẹ vào chủng cấy từ thạch nghiêng và cấy vào ống chủng gốc.

B.3.3. Dùng piper vô trùng để lấy 0,5 ml huyền phù vi sinh vật thử nghiệm (B.3.2) cho vào các đĩa Petri chứa thạch đã đông đặc (B.3.1). Cấy đầu lên khắp bề mặt thạch bằng que cấy thủy tinh.

...

...

...

B.3.5. Dùng pipet vô trùng lấy dung dịch nước muối sinh lí/pepton vô trùng (8,5 g NaCl và 1,0 g pepton/kg nước) vào đĩa Petri đã cấy (B.3.4). Dàn đều lên khắp bề mặt bằng que cấy thủy tinh. Thu lấy huyền phù vi sinh vật thử nghiệm vào chai vô trùng. Đậy nút chai và lắc kỹ.

B.3.6. Làm sạch huyền phù vi sinh vật thử nghiệm bằng cách ly tâm với gia tốc 2 000 g trong 5 min. Gạn phần nổi phía trên và hòa lại các tế bào này vào dung dịch nước muối sinh lý/pepton vô trùng. Thực hiện bước này hai lần.

B.3.7. Hòa các tế bào này vào dung dịch nước muối sinh lý/pepton vô trùng. Đun nóng trong 10 min ở nhiệt độ 80 ^oC để thúc đẩy sự hình thành các bào tử.

B.4. Chỉnh nồng độ vi sinh vật thử nghiệm

Chỉnh nồng độ của huyền phù vi sinh vật thử nghiệm sao cho đạt khoảng 5 000 000 đơn vị hình thành khuẩn lạc trong một mililit, xác định được trên thạch đếm đĩa khi ủ ở nhiệt độ 63 ^oC trong khoảng từ 18 h đến 24 h [Xem TCVN 4884 (ISO 4833)].

B.5. Bảo quản huyền phù vi sinh vật thử nghiệm

Chia thành từng lượng nhỏ và bảo quản ở nhiệt độ dưới - 20 ^oC trong tối đa 1 năm.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

...

...

...

[2] Nouws, J.F.M L_OEFFEN; G. SCHOUTEN.J.,VAN EGMOND, H., KEUKENS, H. and STEGEMAN, H. Improvement of the tube diffusion test with respect to detection of antibiotic residues and sulphonamides in raw milk. Archiv ful Lebensmittelhygiene, 46, 1995, pp.140-141

[3] Instruction manual for the testing of herd bulk milk samples. Netherlands Milk Control Station (MCS Nederland), Zutphen, 2003 (in Dutch)

[4] Detection and confirmation of inhibitors in milk and milk products. IDF Bulletin, 258, 1991

[5] SUHREN, G. and BEUKERS, R. Delvotest S.P for the detection of cloxacillin and sulfamathoxazole in milk. IDF interlaboratory study, J. AOAC Int. 81, 1998, pp. 978-990.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8106:2009 (ISO/TS 26844 : 2006) về Sữa và sản phẩm sữa - Xác định dư lượng kháng sinh - Phép thử phân tán trong ống nghiệm