5.3.1.2  Chuẩn bị

Hoà tan amoni clorua trong nước. Bổ sung các thành phần, hoặc môi trường hoàn chỉnh khô còn lại và hòa tan bằng cách đun nóng, nếu cần.

Để tăng thời gian bảo quản của môi trường khô, có thể bổ sung riêng natri glutamat.

Chỉnh pH, nếu cần, sao cho sau khi khử trùng, pH là 6,7 ± 0,1 ở 25 °C ± 1 °C.

Phân phối các lượng 10 ml môi trường nồng độ đơn vào các ống nghiệm hoặc chai có kích thước nhỏ nhất 16 mm x 160 mm (6.7) và môi trường nồng độ kép vào các ống nghiệm hoặc chai có kích thước nhỏ nhất 18 mm x 180 mm hoặc 20 mm x 200 mm (6.7). Nếu cần sử dụng các lượng môi trường lớn hơn thì có thể sử dụng các ống nghiệm hoặc chai có dung tích thích hợp.

Khử trùng 10 min ở 116 °C trong nồi hấp áp lực (6.1).

5.3.2  Thạch trypton-mật-glucuronid (môi trường tăng sinh chọn lọc thứ hai)

5.3.2.1  Thành phần

Sản phẩm thủy phân casein bằng enzym

...

...

...

Muối mật Số 3

1,5 g

Axit 5-bromo-4-clo-3-indolyl-β-D-glucuronid (BCIG)

144 µmol^a

Dimetyl sulfoxit (DMSO)^b,c

3 ml

Thạch

9 g đến 18 g ^d

Nước

...

...

...

^a Ví dụ: 0,075 g muối xyclohexylamoni.

^b Dimetyl sulfoxit rất độc khi hít hoặc tiếp xúc trực tiếp. Cần sử dụng tủ an toàn và trang bị bảo hộ cá nhân thích hợp khi xử lý.

^e Dimetyl sultoxit chỉ cần đến nếu chuẩn bị dung dịch gốc BCIG đầu tiên.

^d Tùy thuộc vào sức đông của thạch.

5.3.2.2  Chuẩn bị

Chỉnh pH, nếu cần, sao cho sau khi khử trùng, pH là 7,2 ± 0,2 ở 25 °C.

Khử trùng môi trường 15 min ở nhiệt độ 121 °C trong nồi hấp áp lực (6.1).

5.3.2.3  Chuẩn bị các đĩa thạch

Rót các lượng từ 18 ml đến 20 ml môi trường tan chảy vào các đĩa Petri vô trùng (6.10) và để cho đông đặc.

...

...

...

5.3.3  Phép thử hiệu năng về bảo đảm chất lượng môi trường nuôi cấy

Xem TCVN 8128 (ISO 11133) về phép thử hiệu năng (Bảng 1 và Bảng 2).

Bảng 1 - Phép thử hiệu năng của môi trường glutamat khoáng cải biến

Chức năng thử nghiệm

Ủ

Chủng kiểm chứng

Phương pháp kiểm chứng

Tiêu chí

Phản ứng đặc trưng

...

...

...

(37 ± 1)°C/ (24 ± 2) h

E. coli^b WDCM 00202 hoặc 00013

Định lượng

Sinh axit

Chuyển sang màu vàng

Độ chọn lọc

(37 ± 1)°C/ (24 ± 2) h

Enterococcus faecalis^b WDCM 00009 hoặc 00087

Định tính

...

...

...

-

^a Xem tư vấn về chủng đối chứng tại http://www.wfcc.info/ về thông tin số lượng chủng sưu tập và các chi tiết liên hệ.

^b Sử dụng tối thiểu một trong các chủng.

Bảng 2 - Phép thử hiệu năng của môi trường thạch trypton-mật-glucuronid (TBX)

Chức năng thử nghiệm

Ủ

Chủng kiểm chứng^a

Phương pháp kiểm chứng

Tiêu chí

...

...

...

Khả năng phát triển

(44 ± 1) °C/ (22 ± 2) h

E. coli WDCM 00202^b (β- glucuronidaza dương tính yếu) hoặc 00013^c

Định tính

Phát triển tốt

Khuẩn lạc có màu xanh lam đến xanh da trời

Độ đặc hiệu

Citrobacter freundii WDCM 00006 hoặc Pseudomonas aeruginosa WDCM 00025

...

...

...

Phát triển tốt

Khuẩn lạc có màu xanh lam đến xanh da trời

Độ chọn lọc

(37 ± 1) °C/ (22 ± 2) h

E. faecalis^d WDCM 00009 hoặc 00087

Định tính

Ức chế hoàn toàn

-

^a Xem tư vấn về chủng đối chứng tại http://www.wfcc.info/ về thông tin số lượng chủng sưu tập và các chi tiết liên hệ.

...

...

...

^c Sử dụng tối thiểu một chủng.

^d Tùy chọn chủng; sử dụng tối thiểu một trong các chủng.

6  Thiết bị và dụng cụ thủy tinh

Sử dụng các thiết bị phòng thử nghiệm vi sinh thông thường và cụ thể như sau:

6.1  Thiết bị khử trùng khô (tủ sấy) hoặc khử trùng ướt (nồi hấp áp lực), như quy định trong TCVN 6404 (ISO 7218).

6.2  Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ 37 °C ± 1 °C và 44 °C ± 1 °C.

6.3  Tủ sấy hoặc tủ sấy thông gió, có thể duy trì nhiệt độ từ 25 °C ± 1 °C đến 50 °C ± 1 °C, hoặc tủ thổi không khí.

6.4  Tủ an toàn, để chuẩn bị môi trường.

6.5  Tủ lạnh (dùng để bảo quản môi trường đã chuẩn bị), có thể duy trì nhiệt độ ở 5 °C ± 3 °C.

...

...

...

6.7  Ống nghiệm hoặc chai, có kích thước nhỏ nhất là 16 mm x 125 mm (ví dụ: 16 mm x 160 mm, 18 mm x 180 mm hoặc 20 mm x 200 mm).

6.8  Pipet xả hết, có dung tích danh định 1 ml và 10 ml, được chia vạch 0,1 ml.

6.9  Que cấy vòng, bằng platin/iridi hoặc niken/crom, đường kính khoảng 3 mm, hoặc các que cấy vòng vô trùng sử dụng một lần dung tích 10 µl.

6.10  Đĩa Petri, đường kính khoảng 90 mm.

7  Lấy mẫu

Sử dụng các phần tương ứng của TCVN 6507 (ISO 6887) và theo tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm tương ứng. Nếu không có tiêu chuẩn cụ thể về lấy mẫu sản phẩm tương ứng thì các bên tự thoả thuận về vấn đề này.

Điều quan trọng là mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong quá trình vận chuyển và bảo quản.

8  Chuẩn bị mẫu thử

Chuẩn bị mẫu thử theo tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm tương ứng. Nếu không có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm thì các bên tự thoả thuận về vấn đề này.

...

...

...

9.1  Phương pháp phát hiện

9.1.1  Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dịch pha loãng

Xem các phần tương ứng của TCVN 6507 (ISO 6887) và tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm tương ứng.

9.1.2  Ủ môi trường tăng sinh chọn lọc

Ủ canh thang nồng độ đơn hoặc canh thang glutamat khoáng cải biến nồng độ kép (5.3.1.1) trong tủ ấm (6.2) cài đặt ở 37 °C ± 1 °C trong 24 h ± 2 h.

9.1.3  Cấy truyền

Từ mỗi ống đã ủ theo 9.1.2 cho thấy có axit, do chuyển sang màu vàng hoặc có sự đổi màu hoặc quan sát bên ngoài có sự thay đổi so với ống kiểm chứng âm tính thì cấy truyền một vòng cấy (6.9) vào đĩa thạch trypton-mật-glucuronid (TBX) (5.3.2) và ria cấy để thu được các khuẩn lạc mọc riêng rẽ.

9.1.4  Ủ lần hai

Ủ các đĩa đã cấy theo 9.1.3 từ 22 h ± 2 h trong tủ ấm (6.2) cài đặt ở 44 °C ± 1 °C. Không chồng cao quá sáu đĩa và cần để các chồng đĩa tách rời nhau trong tủ ấm và cách thành tủ ít nhất 25 mm. Có thể chấp nhận các chồng đĩa cao hơn và sát nhau nếu tủ ấm có hệ thống tuần hoàn không khí, trong trường hợp này cần kiểm tra sự phân bố nhiệt độ.

...

...

...

Sau thời gian ủ quy định (9.1.4), kiểm tra sự có mặt các khuẩn lạc có màu xanh lam đậm hoặc nhạt hoặc xanh da trời trên các đĩa cấy, điều này cho thấy có mặt Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza.

9.1.6  Diễn giải kết quả

Kết quả được coi là dương tính về sự có mặt của Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza nếu đĩa thu được trong 9.1.5 cho thấy có các khuẩn lạc màu xanh lam hoặc xanh da trời.

9.2  Phương pháp định lượng

9.2.1  Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dịch pha loãng

Xem các phần tương ứng của TCVN 6507 (ISO 6887) hoặc tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm cần xác định, cần chuẩn bị một lượng đủ các dịch pha loãng để thu được độ pha loãng cuối cùng của tất cả các ống cho kết quả âm tính.

9.2.2  Ủ môi trường tăng sinh chọn lọc

9.2.2.1  Yêu cầu chung

Giống như trường hợp chung, quy trình sau đây quy định dãy ba ống cho một độ pha loãng. Đối với nhuyễn thể hai mảnh vỏ tươi sống hoặc các sản phẩm đặc thù khác và/hoặc khi yêu cầu độ chụm cao hơn, cần nuôi cấy một dãy năm ống cho một độ pha loãng.

...

...

...

9.2.2.2  Lấy ba hoặc năm ống canh thang glutamat khoáng cải biến nồng độ kép [5.3.1.1a)]. Sử dụng pipet vô trùng (6.8), chuyển sang mỗi ống 10 ml dung dịch mẫu thử nếu sản phẩm dạng lỏng hoặc 10 ml huyền phù ban đầu nếu sản phẩm ở dạng khác. Trộn kỹ dịch cấy với môi trường.

9.2.2.3  Lấy ba hoặc năm ống canh thang glutamat khoáng cải biến nồng độ đơn [5.3.1.1 a)]. Sử dụng pipet vô trùng mới (6.8) chuyển vào mỗi ống 1 ml mẫu thử nếu sản phẩm dạng lỏng hoặc 1 ml huyền phù ban đầu nếu sản phẩm dạng khác. Trộn kỹ dịch cấy với môi trường.

9.2.2.4  Lấy ba hoặc năm ống canh thang glutamat khoáng cải biến nồng độ đơn đối với từng độ pha loãng tiếp theo được chuẩn bị từ mẫu thử của sản phẩm dạng lỏng hoặc từ huyền phù ban đầu nếu sản phẩm dạng khác (nghĩa là 10^-1, 10^-2, 10^-3, v.v...). Sử dụng pipet vô trùng mới (6.8) cho mỗi độ pha loãng, chuyển vào mỗi ống 1 ml. Trộn kỹ dịch cấy với môi trường.

9.2.3  Ủ

Ủ các ống môi trường chọn lọc nồng độ kép đã cấy trong 9.2.2.2 hoặc các ống môi trường chọn lọc nồng độ đơn đã cấy trong 9.2.2.3 và 9.2.2.4 trong tủ ấm (6.2) ở ủ ở 37 °C ± 1 °C trong 24 h ± 2 h.

9.2.4  Cấy truyền

Từ mỗi ống đã ủ theo 9.2.3 cho thấy có axit, do chuyển sang màu vàng hoặc quan sát bên ngoài có sự thay đổi so với ống kiểm chứng âm tính thì cấy truyền một vòng cấy (6.9) vào đĩa thạch trypton-mật- glucuronid (TBX) (5.3.2) và ria cấy để thu được các khuẩn lạc mọc riêng rẽ.

9.2.5  Ủ lần hai

Ủ các đĩa đã cấy theo 9.1.3 từ 22 h ± 2 h trong tủ ấm (6.2) ở 44 °C ± 1 °C. Không chồng cao quá ba đĩa và cần để các chồng đĩa tách rời nhau trong tủ ấm và cách thành tủ ít nhất 25 mm. Có thể chấp nhận các chồng đĩa cao hơn và sát nhau nếu tủ ấm có hệ thống tuần hoàn không khí, trong trường hợp này cần kiểm tra sự phân bố nhiệt độ.

...

...

...

Sau thời gian ủ quy định (9.2.5), kiểm tra sự có mặt các khuẩn lạc có màu xanh lam hoặc xanh da trời trên các đĩa cấy, điều này cho thấy có mặt Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza.

9.2.7  Diễn giải kết quả

Từng ống môi trường tăng sinh chọn lọc nồng độ đơn hoặc nồng độ kép được ủ theo 9.2.3 được coi là dương tính nếu sau khi cấy truyền theo 9.2.4 và ủ theo 9.2.5 cho thấy có mặt các khuẩn lạc màu xanh lam hoặc xanh da trời trên đĩa thạch trypton-mật-glucuronid (TBX) (5.3.2).

Đếm số ống môi trường dương tính đối với từng độ pha loãng.

10  Biểu thị kết quả

10.1  Phương pháp phát hiện

Theo các kết quả diễn giải (xem 9.1.6), chỉ rõ sự có mặt hay không có mặt Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza.

10.2  Phương pháp định lượng

Theo các kết quả diễn giải (xem 9.2.7), tính số có xác suất lớn nhất (MPN) trên gam hoặc trên mililit từ số ống dương tính với mỗi độ pha loãng theo TCVN 6404 (ISO 7218).

...

...

...

Thực nghiệm cho thấy rằng khi sử dụng kỹ thuật MPN kết quả có thể xảy ra sai số lớn khi sử dụng dãy ba ống cho mỗi độ pha loãng. Do đó, phải thận trọng khi sử dụng các kết quả thu được bằng phương pháp này. Khi sử dụng dãy năm ống thì cần ghi nhận rằng độ chụm thu được bằng phương pháp này có thể so sánh được với kết quả thu được bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc. Các giới hạn tin cậy được nêu trong TCVN 6404 (ISO 7218).

VÍ DỤ 1: Sử dụng ba ống cho mỗi độ pha loãng, trong 95 % các trường hợp có các giới hạn tin cậy dao động từ 5,6 đến 100 Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza trên gam đối với MPN có 24 Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza trên gam.

VÍ DỤ 2: Sử dụng năm ống cho mỗi độ pha loãng, trong 95 % các trường hợp có các giới hạn tin cậy dao động từ 7,79 đến 74 Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza trên gam đối với MPN có 24 Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza trên gam.

12  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải nêu rõ:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng;

c) mọi chi tiết về điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được xem là tùy ý, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả;

d) kết quả thử nghiệm thu được.

...

...

...

[1]  TCVN 6846 (ISO 7251), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp phát hiện và định lượng Escherichia coli giả định - Kỹ thuật đếm số có xác suất lớn nhất

[2]  Blazko N. Evaluation of the β-glucuronidase substrate 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide in a 24 hour direct plating method for Escherichia coli. J.Food Protection, 51, 1,988, p. 402

[3]  Damare J.M., Campbell D.F. and Johnson R.W.. Simplified direct plating method for enhanced recovery of Escherichia coli in food. J Food Sci., 50, 1985, pp. 1736-1737,1746

[4]  Delisle G.L. and LEY A. Rapid detection of Escherichia coli in urine samples by a new chromogenic β-glucuronidase assay. J.CIin.MIcrobiol., 27, 1989, pp. 778-779

[5]  DONOVAN T.J., Gallacher S., Andrews N.J., Greenwood M.H., Graham j., Russell J.E., Roberts D. and LEE R. Modification of the standard method used In the United Kingdom for counting Escherichia coli in live bivalve molluscs. Comm Dis & Public Health, 1,1998, pp. 188-196

[6]  Kilian M. and BULOW P. Rapid identification of Enterobacteriaceae. Use of a β-glucuronidase detecting agar (PGUA) for the identification of Escherichia coli in primary cultures of urine samples. Acta Pathol Microbiol Scand., Sect B, 87, 1979, pp. 271-276

[7]  Kilian M. and Bulow P. Rapid identification of Enterobacteriaceae. Detection of bacterial glycosidases. Acta pathol Microbiol Scand., Sect. B, 84, 1976, pp. 245-251

[8] Ley A.N., Bowers R.J. and Wolfe S. Indoxyl-β-D-glucuronide, a novel chromogenic reagent for the specific detection and enumeration of Escherichia coli in environmental samples. Canadian J Microbiol., 34, 1988, pp. 690-693

[9]  Manafi M. and Kneifel W. a combined chromogenic-fluorogenic medium for the simultaneous detection of total conforms and E. coli in water. Zentralbl. Hyg., 189,1989, pp. 225-234

...

...

...

[11]  RestainoL., Frampton E.W. and LYON R.H. Use of chromogenic substrate 5-bromo-4-chloro-3- indolyl-β-D-glucuronide (X-GLUC) for enumeration of Escherichia coli in 24 hours from ground beef. J.Food Protection, 53 (6) 1990, pp. 508-510

[12]  WatkinsW.D., RippeyS.C, ClavetC.R., Kelly-Reitz D.J. and BurkhartW. Novel compound for identifying Escherichia coli. Appl. Envir. Microbiol., 54, 1988, pp. 1874-1875

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 7924-3:2017 (ISO 16649-3:2015) về Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm - Phương pháp định lượng Escherichia coli dương tính B-glucuronidaza - Phần 3: Phát hiện và kỹ thuật tính số có xác suất lớn nhất sử dụng 5-bromo-4-clo-3-indolyl B-D-glucuronid