5.2.1.2. Chuẩn bị

Hòa tan amoni clorua trong nước. Bổ sung các thành phần, hoặc môi trường hoàn chỉnh khô còn lại, đun nóng nếu cần.

Để tăng thời gian bảo quản của môi trường khô, có thể thêm natri glutamat một cách riêng rẽ.

Nếu cần, chỉnh pH để sau khi khử trùng pH phải là 6,7 ± 0,1 ở 25ºC.

Phân phối môi trường này theo từng lượng 10 ml vào các ống nghiệm có kích thước 16 mm x 160 mm (6.6) trong trường hợp môi trường nồng độ đơn và phân phối vào các ống nghiệm có kích thước 18 mm x 180 mm hoặc 20 mm x 200 mm (6.6) trong trường hợp môi trường nồng độ kép.

Khử trùng 10 min ở nhiệt độ 116ºC trong nồi hấp áp lực (6.1). Cách khác có thể đun nóng ở 100ºC trong 30 min trong ba ngày liên tiếp.

5.2.2. Thạch trypton-mật-glucuronid (môi trường chọn lọc thứ hai)

5.2.2.1. Thành phần

Sản phẩm thủy phân casein bằng enzym

...

...

...

Axit-5-bromo-4-clo-3-indolyl-β-D-glucuronid (BCIG)

Dimetyl sulfoxit (DMSO)^b

Thạch

Nước

20,0 g

1,5 g

114 µmol^a

3 ml

9 g tới 18 g ^c

...

...

...

^a Ví dụ: 0,075 g muối xyclohexylamoni

^b Dimetyl sulfoxit là rất độc khi hít hoặc tiếp xúc phải. Cần sử dụng trong tủ hút khói. Vì độc tính đó nên nhà sản xuất khuyến cáo dùng dung dịch pha loãng.

^c Tùy thuộc vào sức đông của thạch.

5.2.2.2. Chuẩn bị

Hòa tan BCIG trong dimetyl sulfoxit. Hòa tan tất cả các thành phần trên trong nước và đun đến sôi.

Chỉnh pH để sau khi khử trùng pH phải là 7,2 ± 0,2 ở 25ºC, nếu cần.

Khử trùng môi trường 15 min ở nhiệt độ 121ºC trong nồi hấp áp lực (6.1).

5.2.2.3. Chuẩn bị các đĩa thạch

Rót các lượng từ 12 ml đến 15 ml môi trường tan chảy vào các đĩa Petri vô trùng (6.9) và để cho đông đặc.

...

...

...

Các đĩa thạch cần phải đủ khô để hơi nước không xuất hiện trong 15 min khi dàn dịch cấy.

5.2.3. Kiểm tra hiệu quả của việc đảm bảo chất lượng môi trường nuôi cấy.

Về định nghĩa tính chọn lọc và hiệu năng, xem ISO/TS 11133-1 và ISO/TS 11133-2. Đối với các phép thử về hiệu quả môi trường glutamate khoáng cải biến và thạch trypton mật glucuronid, xem Bảng 1 và Bảng 2.

Bảng 1 – Kiểm tra hiệu năng của môi trường glutamat khoáng cải biến

Chức năng

Ủ

Chủng kiểm chứng

Phương pháp kiểm chứng

Tiêu chí

...

...

...

Khả năng phát triển

37ºC/24h

E.Coli ATCC

25922 hoặc 8739

Bán định lượng

Sinh axit

Chuyển sang màu vàng

Tính chọn lọc

37ºC/24h

...

...

...

Định lượng

Không phát triển

-

Bảng 2 – Kiểm tra hiệu năng của môi trường thạch trypton mật glucuronid

Chức năng

Ủ

Chủng kiểm chứng

Phương pháp kiểm chứng

Tiêu chí

...

...

...

Khả năng phát triển

44ºC/20h đến 24h

E.Coli ATCC

25922 hoặc 8739

Định lượng

Phát triển tốt (2)

Các khuẩn lạc có màu xanh đến xanh da trời

...

...

...

13216 (dương tính yếu β-glucuronidaza)

Định lượng

Phát triển tốt (2)

Các khuẩn lạc có màu xanh đến xanh da trời

Tính chọn lọc

37ºC/24h

E.faecalis ATCC 29212 hoặc 19433

Định lượng

Không phát triển

...

...

...

6. Thiết bị và dụng cụ thủy tinh

Có thể dùng dụng cụ sử dụng một lần để thay thế cho dụng cụ sử dụng nhiều lần nếu có các yêu cầu tương tự.

Sử dụng các thiết bị phòng thử nghiệm vi sinh thông thường và cụ thể là:

6.1. Thiết bị khử trùng khô (tủ) hoặc khử trùng ướt (nồi hấp áp lực).

Xem TCVN 6404 (ISO 7218)

6.2. Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ 37ºC ± 1ºC và 44ºC ± 1ºC

6.3. Tủ sấy hoặc buồng sấy thông gió, có thể duy trì nhiệt độ từ 25ºC ± 1ºC đến 50ºC ± 1ºC, hoặc tủ thổi không khí.

6.4. Tủ lạnh (dùng để bảo quản môi trường đã chuẩn bị), có thể duy trì nhiệt độ ở 5ºC ± 3ºC.

6.5. Máy đo pH, có độ phân giải 0,01 đơn vị pH, có độ chính xác đến ± 0,1 đơn vị pH ở 25ºC.

...

...

...

6.6. Ống nghiệm, có kích thước khoảng 16 mm x 160 mm và 18 mm x 180 mm hoặc 20 mm x 200 mm.

6.7. Pipet xả hết, có dung tích danh định 1 ml và 10 ml, được chia vạch 0,1 ml.

6.8. Vòng lấy mẫu, bằng platin/iridi hoặc niken/crom, đường kính khoảng 3 mm, hoặc các vòng lấy mẫu vô trùng sử dụng một lần dung tích 10 µl.

6.9. Đĩa Petri, đường kính khoảng 90 mm.

7. Lấy mẫu

Điều quan trọng là mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc thay đổi thành phần trong quá trình vận chuyển và bảo quản.

Việc lấy mẫu không qui định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm. Nếu không có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm thì các bên tự thỏa thuận về vấn đề này.

8. Chuẩn bị mẫu thử

Chuẩn bị mẫu thử theo tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm. Nếu không có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm thì các bên tự thỏa thuận về vấn đề này.

...

...

...

9.1. Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng

Xem các phần tương ứng của TCVN 6507 (ISO 6887) hoặc tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm cần xác định.

Pha đủ số lượng các độ pha loãng để đảm bảo rằng tất cả các ống nghiệm ứng với độ pha loãng cuối cùng cho kết quả âm tính.

9.2. Cấy môi trường tăng sinh chọn lọc

9.2.1. Về nguyên tắc chung, theo quy trình cần ba ống cho mỗi độ pha loãng. Đối với động vật nhuyễn thể có vỏ tươi sống hoặc các sản phẩm đặc biệt khác và/hoặc khi yêu cầu độ chính xác cao hơn của kết quả thì cần cấy năm ống cho mỗi độ pha loãng.

9.2.2. Lấy ba ống nghiệm đựng môi trường tăng sinh chọn lọc nồng độ kép [5.2.1.1 a)]. Dùng pipet vô trùng (6.7) cho vào mỗi ống 10 ml mẫu thử ở dạng lỏng, hoặc 10 ml huyền phù ban đầu trong trường hợp mẫu thử ở dạng khác.

9.2.3. Lấy ba ống nghiệm đựng môi trường tăng sinh chọn lọc nồng độ hơn [5.2.1.1 b)]. Dùng một pipet vô trùng mới (6.7) cho vào mỗi ống 1 ml mẫu thử ở dạng lỏng, hoặc 1 ml huyền phù ban đầu (dung dịch pha loãng đầu tiên) khi mẫu thử ở dạng khác.

9.2.4. Đối với mỗi một dung dịch pha loãng tiếp theo (10^-1 hoặc 10^-2 tùy theo mẫu thử), thì tiến hành theo 9.2.3. Sử dụng một pipet vô trùng mới cho mỗi độ pha loãng. Trộn kỹ dịch cấy với môi trường.

9.3. Nuôi ấm

...

...

...

9.4. Cấy truyền

Từ mỗi ống đã ủ theo 9.3 cho thấy có axit, có màu vàng, thì cấy truyền một vòng cấy (6.8) vào đĩa thạch trypton mật glucuronid (5.2.2) và ria cấy để thu được các khuẩn lạc tách biệt rõ.

9.5. Ủ lần hai

Ủ các đĩa đã cấy theo 9.4 từ 20 h đến 24 h trong tủ ấm (6.2) ở 44ºC. Không chồng cao quá ba đĩa.

9.6. Kiểm tra các đĩa

Sau thời gian ủ quy định (9.5), kiểm tra các đĩa về sự có mặt các khuẩn lạc có màu tối hoặc màu xanh nhạt hoặc màu xanh da trời, điều này chứng tỏ rằng có mặt Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza.

9.7. Diễn giải kết quả

Các ống chứa môi trường tăng sinh nồng độ đơn hoặc nồng độ kép được ủ theo 9.3, sau khi cấy truyền (9.4) và ủ lần hai (9.5) cho thấy có các khuẩn lạc màu xanh hoặc màu xanh da trời trên môi trường thạch chọn lọc được coi là ống dương tính.

Đếm số ống dương tính đối với mỗi độ pha loãng.

...

...

...

Tính số có xác suất lớn nhất từ số ống dương tính với mỗi độ pha loãng.

Xem TCVN 6404 (ISO 7218)

11. Độ chụm

Thực nghiệm cho thấy rằng khi sử dụng kỹ thuật MPN kết quả có thể xảy ra sai số lớn khi sử dụng dãy ba ống cho mỗi độ pha loãng. Do đó, phải thận trọng khi sử dụng các kết quả thu được bằng phương pháp này. Khi sử dụng dãy năm ống thì cần ghi nhận rằng độ chụm thu được có thể so sánh được với kết quả thu được bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc. Các giới hạn tin cậy được đưa ra trong TCVN 6404 (ISO 7218).

VÍ DỤ: Đối với mẫu dạng rắn, thì trong 95% các trường hợp, các giới hạn tin cậy dao động từ 13 đến 200 Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza trên gam đối với MPN 7,4 x 10 ¹ Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza trên gam, và từ 4 đến 99 Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza trên gam đối với MPN 2,4 x 10¹ Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza trên gam.

12. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải nêu rõ:

a) mọi thông tin cần thiết về nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

...

...

...

d) tất cả các chi tiết về điều kiện thao tác không qui định trong tiêu chuẩn này, hoặc được xem là tùy ý, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được, hoặc nếu đáp ứng được yêu cầu về độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] BLAZKO N. Evaluation of the β-glucuronidase substrate 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide in a 24 hour direct plating method for Escherichia coli. J.Food Protection, 51, 1,988, p. 402.

[2] DAMARE J.M., CAMPBELL D.F. and JOHNSON R.W.. Simplified direct plating method for enhanced recovery of Escherichia coli in food. J Food Sci., 50, 1985, pp. 1736-1737,1746.

[3] DELISLE G.L. and LEY A. Rapid detection of Escherichia coli in urine samples by a new chromogenic β-glucuronidase assay. J.Clin.Microbiol., 27, 1989, pp. 778-779

[4] DONOVAN T.J., GALLACHER S., ANDREWS N.J., GREENWOOD M.H., GRAHAM J., RUSSELL J.E., ROBERTS D. and LEE R. Modification of the standard method used in the United Kingdom for counting Escherichia coli in live bivalve molluscs. Comm Dis & Public Health, 1, 1998, pp. 188-196

[5] KILIAN M. and BULOW P. Rapid identification of Enterobacteriaceae. Use of a β-glucuronidase , detecting agar (PGUA) for the identification of Escherichia coli in primary cultures of urine samples. Acta Pathol Microbiol Scand., Sect B, 87, 1979, pp. 271-276

...

...

...

[7] LEY A.N., BOWERS R.J and WOLFE S. Indoxyl-β-D-glucuronide, a novel chromogenic reagent for the specific detection and enumeration of Escherichia coli in environmental samples. Canadian J Microbiol., 34, 1988, pp. 690-693

[8] MANAFI M. and KNEIFEL W. A combined chromogenic-fluorogenic medium for the simultaneous detection of total conforms and E.coli in water. Zentralbl. Hyg., 189, 1989, pp. 225-234

[9] OGDENI.D. and WATT A.J. An evaluation of fluorogenic and chromogenic assays for the direct enumeration of Escherichia coli. Letters in Applied Microbiology, 13, 1991, pp. 212-215

[10] RESTAINOL., FRAMPTON E.W. and LYON R.H. Use of chromogenic substrate 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide (X-GLUC) for enumeration of Escherichia coli in 24 hours from ground beef. J.Food Protection, 53 (6) 1990, pp. 508-510

[11] WATKINSW.D., RIPPEYS.C, CLAVETC.R., KELLY-REITZ D.J and BURKHARTW. Novel compound for identifying Escherichia coli. Appl. Envir. Microbiol., 54, 1988, pp. 1874-1875

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 7924-3:2008 (ISO/TS 16649-3 : 2005) về Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp định lượng Escherichia coli dương tính beta-glucuronidaza - Phần 3: Kỹ thuật tính số có xác xuất lớn nhất sử dụng 5-bromo-4-clo-3-indolyl beta-D-glucuronid