^a Hàm lượng ion sắt III tối thiểu là 15 % (theo khối lượng).

^b Tùy thuộc vào sức đông của thạch.

A.2.2  Chuẩn bị

Hòa tan amoni clorua vào nước. Thêm các thành phần khác và hòa tan bằng cách đun nóng, nếu cần.

Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 6,7 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần.

Chuyển các lượng 500 ml vào các bình chứa phù hợp, ví dụ: chai hoặc bình.

Tiệt trùng trong nồi hấp (6.1) ở 115 °C trong 10 min.

A.2.3  Chuẩn bị các đĩa thạch

Làm nguội môi trường đến khoảng từ 47 °C đến 50 °C trong nồi cách thủy (6.5), lắc đều và rót 12 ml đến 15 ml môi trường vào các đĩa petri vô trùng (6.11).

...

...

...

Bảo quản các đĩa thạch sao cho không để đĩa bị khô, ở 5 °C (6.6) tối đa bốn tuần trừ khi có kết quả xác nhận của phòng thử nghiệm là thời hạn sử dụng lâu hơn.

Ngay trước khi sử dụng, cẩn thận làm khô các đĩa thạch (tốt nhất là mở nắp và bề mặt thạch hướng xuống dưới) trong tủ (6.2) ở nhiệt độ từ 25 °C đến 50 °C cho đến khi bề mặt thạch khô, xem TCVN 8128 (ISO 11133).

A.3  Môi trường chọn lọc: thạch X-glucuronid trypton-mật (TBX)

A.3.1  Thành phần

Dịch thủy phân casein bằng enzym

20,0 g

Muối mật số 3

1,5 g

5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-β-D-axit glucuronic (BCIG), muối cyclohexylammoni monohydrat hoặc muối natri

...

...

...

144 µmol^a

Thạch

9 g đến 18 g^b

Nước

1 000 ml

^a Ví dụ, 0,075 g muối cyclohexylamoni

^b Tùy thuộc vào sức đông của thạch.

...

...

...

Hòa tan muối cyclohexylammoni BCIG vào 3 ml dung dịch gồm 2,5 ml dung dịch etanol 95 % (phần thể tích) và 0,5 ml dung dịch natri hydroxit 1 M. Cho dung dịch này vào môi trường. Cách khác, có thể cho trực tiếp muối natri của BCIG vào môi trường.

Hòa tan các thành phần trong nước và đun nóng cho đến khi hòa tan hoàn toàn.

Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng, pH là 7,2 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần.

Tiệt trùng môi trường 15 min trong nồi hấp áp lực (6.1) nhiệt độ ở 121 °C.

A.3.3  Chuẩn bị các đĩa thạch

Làm nguội môi trường đến khoảng từ 47 °C đến 50 °C trong nồi cách thủy (6.5), lắc đều và rót từ 18 ml đến 20 ml môi trường tan chảy vào các đĩa Petri vô trùng (6.11). Để môi trường đông đặc lại. Để bảo quản và làm khô các đĩa trước khi sử dụng, xem A.2.3.

A.4  Kiểm tra hiệu năng để đảm bảo chất lượng của môi trường nuôi cấy và màng

Cần thực hiện kiểm tra hiệu năng của môi trường thạch mô tả trong phụ lục này cùng với các màng đặt trên các đĩa. Nếu kết quả kiểm tra không đạt yêu cầu, thì thực hiện kiểm tra lại trên môi trường có và không có màng, để xác định nguyên nhân của hiệu năng kém.

Phải thực hiện kiểm tra đầy đủ để chứng minh rằng một lô màng đáp ứng các yêu cầu và màng có thể tạo ra các kết quả phù hợp cho việc phân tích cụ thể. Việc kiểm tra đạt được bằng cách chứng minh có sự phù hợp trong toàn hệ thống: màng cùng với môi trường nuôi cấy trong cả hai bước phục hồi và bước nuôi cấy trên môi trường chọn lọc.

...

...

...

Định nghĩa về độ chọn lọc và năng suất được quy định trong TCVN 8128 (ISO 11133). Phép thử hiệu năng môi trường nuôi cấy thực hiện theo các phương pháp và tiêu chí như mô tả trong TCVN 8128 (ISO 11133).

Bảng A.1 cho thấy các tiêu chí về hiệu năng của MMGA được kiểm tra cùng với màng để chuyển lên môi trường thạch TBX. Các tiêu chí này phải được sử dụng để thử hiệu năng của MMGA cũng như của màng để chuyển lên môi trường thạch TBX. Mỗi lô màng phải được kiểm tra về tính phù hợp đối với phép thử theo quy định trong A.4, đặc biệt là do việc sử dụng màng lọc của các hãng khác nhau có thể dẫn đến sự khác nhau về độ thu hồi và sự hiện màu khác nhau sau khi ủ trên TBX.

Bảng A.2 cho thấy các tiêu chí về hiệu năng của TBX.

Bảng A.1 - Phép thử hiệu năng của thạch glutamat khoáng cải biến (MMGA) và màng để chuyển

Chức năng

Ủ

Các chủng kiểm tra

Số WDCM^a

Môi trường chuẩn

...

...

...

Tiêu chí^e

Phản ứng đặc trưng

Năng suất

(37 ± 1) °C/ (4h ± 0,25 h) trên MMGA, sau đó (44 ±1) °C/ 20 h đến 24 h trên TBX

Escherichia coli^c,d

00012

00013

TSA (không có màng)

Định lượng bằng màng chuyển từ MMGA sang TBX

...

...

...

Khuẩn lạc xanh da trời trên TBX

Escherichia coli^c

00202^b

Tính chọn lọc

Enterococcus faecalis^d

00009

00087

-

Định tính bằng màng để chuyển từ MMGA sang TBX

...

...

...

-

Tính đặc hiệu

Citrobacter freundii Pseudomonas aeruginosa

00006^b

00025

-

Định tính bằng màng để chuyển từ MMGA sang TBX

-

Các khuẩn lạc màu trắng đến màu xanh be trên TBX

...

...

...

^b Các chủng tối thiểu được sử dụng.

^c Escherichia coli WDCM 00013 là chủng sản sinh β-D-glucuronidase mạnh và WDCM 00202 là một chủng sinh β-D-glucuronidase yếu.

^d Chủng không được chọn; một trong những chủng tối thiểu được sử dụng.

^e Phân loại mức phát triển là: 0: không phát triển, 1: phát triển yếu (ức chế một phần) và 2: phát triển tốt. P_R = tỷ lệ hiệu suất [xem TCVN 8128 (ISO 11133)].

Bảng A.2 - Phép thử hiệu năng của thạch trypton-mật-glucuronid (TBX)

Chức năng

Ủ

Các chủng kiểm tra

...

...

...

Môi trường tham chiếu

Phương pháp kiểm tra

Tiêu chí^e

Đặc tính phản ứng

Năng suất

(44 ± 1) °C/ (20 h đến 24 h)

Escherichia coli^c,d

00012

00013

...

...

...

Định lượng

P_R ≥ 0,5

Khuẩn lạc xanh da trời

Escherichia coli^c

00202^b

Tính chọn lọc

Enterococcus faecalis^d

00009

00087

...

...

...

Định tính

Không phát triển (0)

-

Tính đặc hiệu

Citrobacter freundii Pseudomonas aeruginosa

00006^b

00025

-

Định tính

...

...

...

Các khuẩn lạc màu trắng đến màu xanh be

^a Tham khảo danh mục chủng chuẩn tại http://www.wfcc.info để biết thông tin về số lượng chủng của bộ sưu tập vi sinh vật và thông tin liên hệ; WDCM: Trung tâm dữ liệu thế giới về vi sinh vật.

^b Các chủng tối thiểu được sử dụng.

^c Escherichia coli WDCM 00013 là chủng sản sinh β-D-glucuronidase mạnh và WDCM 00202 là một chủng sinh β-D-glucuronidase yếu.

^d Chủng không được chọn; một trong những chủng tối thiểu được sử dụng.

^e Phân loại mức phát triển là: 0: không phát triển, 1: phát triển yếu (ức chế một phần) và 2: phát triển tốt. Pr = tỷ lệ hiệu suất [xem TCVN 8128 (ISO 11133)].

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] TCVN 6400 (ISO 707) Sữa và sản phẩm sữa - Hướng dẫn lấy mẫu

...

...

...

[3] TCVN 7924-2 (ISO 16649-2) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp định lượng Escherichia coli dương tính b-glucuronidaza - Phần 2: Kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 44 °C sử dụng 5-bromo-4-clo-3-indolyl β-D-glucuronid

[4] TCVN 7924-3 (ISO 16649-3) Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm - Phương pháp định lượng Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza - Phần 3: Kỹ thuật tính số có xác suất lớn nhất sử dụng 5-bromo-4-clo-3-indolyl β-D-glucuronid

[5] TCVN 11922 (ISO 17468) Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm - Yêu cầu và hướng dẫn kỹ thuật để xây dựng hoặc soát xét phương pháp chuẩn

[6] TCVN 7925 (ISO 17604) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp lấy mẫu thân thịt tươi để phân tích vi sinh vật

[7] TCVN 11923 (ISO/TS 17728) Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm - Kỹ thuật lấy mẫu để phân tích vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi

[8] TCVN 8129 (ISO 18593) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp lấy mẫu bề mặt sử dụng đĩa tiếp xúc và lau bề mặt

[9] DELISLE G.L. & Ley A. Rapid detection of Escherichia coli in urine samples by a new chromogenic β-glucuronidase assay. J. Clin. Microbiol. 1989, 27 pp. 778-779

[10] FRAMPTON E.W., RESTAINO L, BLAZKO N. Evaluation of the β-glucuronidase substrate 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide (X-GLUC) in a 24-hour direct plating method for Escherichia coli. J. Food Prot. 1988, 51 pp. 402-404

[11] FENG P., LAMPEL K.A., KARCH H., WHITTAM T.S. Genotypic and phenotypic changes in the emergence of Escherichia coli 0157:H7. J. Infect. Dis. 177, pp. 1750-1753

...

...

...

[13] HOLBROOK R., ANDERSON J.M, BIRD-PARKER A.C. Modified direct plating method for counting Escherichia coli in foods. Food Technol. Aust. 1980, 32 pp. 78-83

[14] HOLBROOK R. & ANDERSON J.M. The rapid enumeration of Escherichia coli in foods by using a direct plating method. In CORRY J.E.L., ROBERTS D., SKINNER FA. (eds). Isolation and Identification Methods for Food Poisoning Organisms. London: Academic Press, 1982, pp. 239-254

[15] KILIAN M. & BULOW P. Rapid diagnosis of Enterobacteriaceae. Detection of bacterial glycosidases. Acta Pathol Microbiol. Scand. Sect. B. 1976, 84 pp. 245-251

[16] LE MINOR L, BUISSIERE J., NOVEL G., NOVEL M. Relation entre le serotype et I'activité β-glucuronidasique chez les Salmonella. Ann Microbiol (Paris). 1978, Aug-Sep; 129B (2) pp.155-165

[17] LEY A.N., BOWERS R.J., WOLFE S. Indoxyl-B-D-glucuronide, a novel chromogenic reagent for the specific detection and enumeration of Escherichia coli in environmental samples. Can. J. Microbiol. 1988, 34 (5) pp. 690-693

[18] OGDEN I.D. & WATT A.J. An evaluation of fluorogenic and chromogenic assays for the direct enumeration of Escherichia coli. Lett. Appl. Microbiol. 1991, 13 pp. 212-215

[19] RESTAINO L, FRAMPTON E.W., LYON R.H. Use of the chromogenic substrate 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide (X-GLUC) for enumerating Escherichia coli in 24 h from ground beef. J. Food Prot. 1990, 53(6) pp. 508-510

[20] WATKINS W.D., RIPPEY S.C., CLAVET C.R., KELLY-REITZ D.J., BURKHARDT W. Novel compound for identifying Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 1988, 54 pp. 1874-1875

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 7924-1:2019 (ISO 16649-1:2018) về Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm - Phương pháp định lượng Escherichia coli dương tính ß-glucuronidase - Phần 1: Kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 44 ºC sử dụng màng lọc và 5-bromo-4-clo-3-indolyl ß -D-glucuronid