5. Cách tiến hành

5.1. Chuẩn bị mẫu thử

5.1.1. Trứng dạng lỏng

Cân 11 g nguyên liệu trứng cho vào chai có nắp vặn hoặc bình có miệng rộng có nắp đậy bằng thủy tinh vô trùng, trộn kỹ phần mẫu thử bằng thìa hoặc dao vô trùng và chuẩn bị dịch pha loãng 1:10. Thêm 99 ml dịch pha loãng Repton-Tween 80 (3.1) và một thìa đầy các viên bi thủy tinh (4.10) vô trùng. Khuấy mạnh dịch pha loãng 1:10 để đảm bảo trứng được hòa tan hoàn toàn hoặc phân bố đều trong dịch pha loãng bằng cách lắc bình chứa 25 lần, mỗi lần lắc chuyển động lên xuống khoảng 30cm và thời gian không quá 7 s. Cho bọt thoát ra hết. Khi cần chuẩn bị các dãy dịch pha loãng hơn thì chuyển phần mẫu đại diện của dung dịch pha loãng 1:10. Khi cần xử lý bằng enzym (xem Bảng 1), thì trộn 5 ml của dung dịch pha loãng 1:10 với 1 ml dung dịch gốc của enzym (3.9). Ủ ấm trên nồi cách thủy ở 35 ⁰C đến 37 ⁰C khoảng từ 20 min đến 30 min. Chỉnh hệ số pha loãng bổ sung bằng cách lọc 1,2 ml phần mẫu thử đã xử lý bằng enzym.

5.1.2. Mẫu thử dạng lỏng khác

Trộn kỹ mẫu phòng thử nghiệm đựng trong chai. Để chuẩn bị dịch pha loãng 1:10, chuyển 10 ml phần mẫu thử vào 90 m dịch pha loãng Pepton-Tween 80 một cách vô trùng (3.1). Trộn kỹ bằng cách lắc bình chứa 25 lần, mỗi lần lắc chuyển động lên xuống khoảng 30 cm và thời gian không quá 7 s. Cho bọt khí thoát ra hết. Khi cần chuẩn bị các dãy dịch pha loãng hơn thì chuyển phần mẫu đại diện từ dịch pha loãng 1:10. Khi cần xử lý bằng enzym (xem Bảng 1), thì trộn 5 ml của dịch pha loãng 1:10 với 1 ml dung dịch gốc của enzym (3.9). Ủ ấm trên nồi cách thủy ở 35 ⁰C đến 37 ⁰C khoảng từ 20 min đến 30 min. Chỉnh hệ số pha loãng bổ sung bằng cách lọc 1,2 ml phần mẫu thử đã xử lý bằng enzym.

5.1.3. Bột từ trứng nguyên quả

Cân 11 g bột trứng cho vào chai có nắp vặn hoặc bình có miệng rộng có nắp đậy bằng thủy tinh vô trùng, trộn kỹ mẫu thử bằng thìa hoặc dao vô trùng và chuẩn bị pha loãng 1:10. Thêm 99 ml dịch pha loãng Pepton-Tween 80 (3.1) và một thìa đầy các viên bi thủy tinh (4.10) vô trùng. Lắc mạnh dịch pha loãng 1:10 để đảm bảo trứng được hòa tan hoàn toàn hoặc phân bố đều trong dịch pha loãng bằng cách lắc mỗi bình chứa 25 lần, mỗi lần lắc chuyển động lên xuống khoảng 30 cm và thời gian không quá 7s. Cho bọt khí thoát ra hết. Khi cần kiểm tra dịch pha loãng 1:10, thì chuẩn bị dịch pha loãng 1:100 và trộn 10 ml dung dịch pha loãng 1:10. Khi cần kiểm tra dịch pha loãng 1:10, thì chuẩn bị dịch pha loãng 1:100 và trộn 10 ml dung dịch pha loãng 1:10 với 1 ml dung dịch gốc trypxin (3.9). Ủ ấm trên nồi cách thủy ở 35 ⁰C đến 37 ⁰C trong khoảng từ 20 min đến 30 min. Lọc toàn bộ thể tích 11 ml này để kiểm tra dịch pha loãng 1:10.

5.1.4. Các loại thực phẩm khác

...

...

...

5.2. Phương pháp xác định

5.2.1. Chuẩn bị thử

Chọn dịch pha loãng thích hợp cho phép phân tích, tùy thuộc vào phạm vi đếm mong muốn. Thông thường, độ pha loãng 1:100 là thích hợp, cho phạm vi đếm từ 100/g hoặc 100/ml đến 500 000/g hoặc 500 000/ml. Sử dụng dịch pha loãng 1:10 nếu dự đoán số đếm thấp.

Bật nguồn chân không (xem Hình 1 và Hình 2). Đặt bộ lọc vô trùng trên bình quân chân không. Mở kẹp A. Quay phễu C về phía sau. Đặt HGMF vô trùng trên bề mặt đế D một cách vô trùng. Quay phễu về phía trước. Đóng kẹp bằng cách trượt miệng L của kẹp bằng thép không gỉ trên toàn bộ chiều dài gờ B từ hai phía của phễu C và đáy D và quay cánh tay K theo phương thẳng đứng (khóa).

Hình 1 - Bộ lọc

Hình 2 - Kẹp để giữ bộ lọc

Thêm khoảng 15 ml đến 20 ml vô trùng vào phễu một cách vô trùng. Dùng pipet lấy một lượng yêu cầu của dịch pha loãng cho vào phễu. Nối đầu cuối ống chân không E vào lỗ hút F để lấy dịch lỏng qua bộ lọc sơ bộ G.Thêm tiếp từ 10 ml đến 15 ml nước vô trùng vào phễu và cho chảy qua bộ lọc sơ bộ như trên một cách vô trùng. Khóa hẹp A để tạo chân không trực tiếp vào đáy bộ lọc và hút chất lỏng qua HGMF.

...

...

...

5.2.2. Sữa nguyên liệu, sữa thanh trùng, cream và bột trứng

Ủ ấm mẫu đã chuẩn bị ở 32 ⁰C trong 48 h ± 3h. Các khuẩn lạc có màu xanh khác nhau. Đếm tất cả các ô vuông có một hoặc nhiều khuẩn lạc (các ô dương tính) trừ khi có một khuẩn lạc mọc lan sát ngay các ô, thì được đếm như một ô dương tính. Quy đổi số đếm các ô dương tính sang MPN bằng công thức sau đây:

MPN = {N log_e [N/(N - x)]}

trong đó

N là tổng số các ô vuông;

x là số ô vuông dương tính

Nhân với số nghịch đảo của hệ số pha loãng và ghi lại MPN của tổng số vi khuẩn trên gam hoặc trên mililit sản phẩm.

5.2.3. Trứng dạng lỏng

Ủ ở 32 ⁰C trong ba ngày (72 h ± 3 h) và tiến hành như 5.2.2.

...

...

...

Ủ ở 35 ⁰C trong 48 giờ ± 3h và tiến hành như 5.2.2.

6. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

- mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

- phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

- phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này;

- mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, cùng với các chi tiết bất thường khác có thể ảnh hưởng tới kết quả.

- các kết quả thử nghiệm thu được.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 7923:2008 về Thực phẩm - Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí - Phương pháp sử dụng bộ lọc màng kẻ ô vuông kỵ nước