CHÚ THÍCH Các phản ứng nêu trong Bảng 1 là để hướng dẫn nhận dạng các loài đã liệt kê. Các phép thử kiểu hình bổ sung là cần thiết để phân biệt đầy đủ giữa loài này với loài khác và giữa các loài của Vibrio không gây bệnh với các vi sinh vật âm tính Gram lên men khác như Aeromonas spp.

9.5.4.10 Khẳng định từng bước (nếu cần)

Thực hiện các phép thử để kiểm tra sự phát triển trong dung dịch nước muối pepton 10 % (5.11). Tiếp tục bằng việc khẳng định (các phép thử khác) trên các khuẩn lạc cho thấy không phát triển trong dung dịch nước muối pepton.

CHÚ THÍCH Nên cấy truyền vào dung dịch nước muối pepton 2 % hoặc cấy truyền vào thạch muối dinh dưỡng tại cùng một thời điểm để chắc chắn rằng vi khuẩn "không phát triển" trong dung dịch nước muối pepton 10 % không phải vì dịch cấy đã hỏng.

9.5.5 Khẳng định việc nhận dạng bằng sinh hóa

Việc nhận dạng bằng sinh hóa của Vibrio là rất khó, tốt nhất để khẳng định chính xác các chủng Vibrio có khả năng gây bệnh đường ruột bằng cách gửi đến phòng thử nghiệm chuẩn/chuyên dụng.

Để vận chuyển chúng, cấy vào bề mặt nghiêng của thạch dinh dưỡng muối (5.3).

10 Biểu thị kết quả

Theo diễn giải các kết quả, ghi lại sự có mặt hay không có mặt Vibrio, có khả năng gây bệnh đường ruột có trong xg hoặc xml sản phẩm [xem TCVN 6404 (ISO 7218)], nêu rõ tên loài vi khuẩn có liên quan.

...

...

...

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

- mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

- phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

- mọi sai lệch liên quan đến môi trường tăng sinh hoặc điều kiện ủ đã sử dụng;

- mọi chi tiết thao tác không qui định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy ý lựa chọn, cùng với các chi tiết bất thường khác có thể ảnh hưởng tới kết quả;

- các kết quả thử nghiệm thu được;

Báo cáo thử nghiệm cũng phải nêu rõ kết quả dương tính có thu được hay không khi sử dụng chỉ một môi trường phân lập (5.2) không được quy định trong tiêu chuẩn này.

Phụ lục A

...

...

...

Sơ đồ cách tiến hành

Phụ lục B

(qui định)

Thành phần và cách chuẩn bị môi trường nuôi cấy và thuốc thử

B.1 Dung dịch nước pepton muối kiềm (ASPW)

B.1.1 Thành phần

Pepton

...

...

...

Natri clorua (NaCl)

20,0 g

Nước

1 000 ml

B.1.2 Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần. Chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng là 8,6 ± 0,2 ở 25 ⁰C, nếu cần.

Phân phối môi trường với các lượng cần thiết cho phép thử vào các bình cầu hoặc ống có dung tích thích hợp (9.1 và 9.3.1). Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực có nhiệt độ 121 ⁰C.

B.2 Thạch sacaroza, mật xitrat thiosulfat (TCBS)

B.2.1 Thành phần

...

...

...

10,0 g

Dịch chiết nấm men

5,0 g

Natri xitrat

10,0 g

Natri thiosulfat

10,0 g

Sắt (III) xitrat

1,0 g

...

...

...

10,0 g

Mật bò khô

8,0 g

Sacaroza

20,0 g

Bromothymol xanh

0,04 g

Thymol xanh

0,04 g

...

...

...

Từ 8,0 g đến 18,0 g ^a

Nước

1 000 ml

^a Tùy thuộc vào sức đông của thạch.

B.2.2 Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước, đun đến sôi.

Chỉnh pH, đạt 8,6 ± 0,2 ở 25 ⁰C, nếu cần. Không hấp áp lực.

B.2.3 Chuẩn bị các đĩa thạch

Phân phối các lượng từ 15 ml đến 20 ml môi trường vừa mới chuẩn bị và làm nguội đến khoảng 50 ⁰C, vào các đĩa Petri và để yên cho đông đặc.

...

...

...

B.2.4 Kiểm chứng môi trường

Xem ISO/TS 11133 về các hướng dẫn.

Thực hiện ước tính hiệu quả của thạch đổ đĩa đối với mỗi mẻ TCBS sử dụng thạch dinh dưỡng muối (SNA) làm môi trường so sánh và các chủng sau đây:

- V. parahaemolyticus: NCTC 10885;

- V. furnissii: NCTC 11218;

- Escherichia coli: ATCC 25922, 8739 hoặc 11775.

Hiệu quả thạch ổ đĩa được tính bằng công thức sau đây:

trong đó N là số lượng khuẩn lạc đếm được.

...

...

...

B.3 Thạch natri dodexyl sulfat B polymixin sacaroza (SDS)

B.3.1 Môi trường cơ bản

B.3.1.1 Thành phần

Pepton proteoza

10,0 g

Dịch chiết thịt bò

5,0 g

Sacaroza

15,0 g

...

...

...

20,0 g

Natri dodexyl sulfat

1,0 g

Xanh bromothymol

0,04 g

Đỏ cresol

0,04 g

Thạch

15,00 g ^a

...

...

...

1 000 ml

^a Tùy thuộc vào sức đông của thạch.

B.3.1.2 Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong nước. Chỉnh pH, đến 7,6 ± 0,2 ở 25 ⁰C, nếu cần. Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực ở nhiệt độ 121 ⁰C.

B.3.2 Dung dịch polymixin B

B.3.2.1 Thành phần

Polymixin B sulfat

100 000 đơn vị

Nước

...

...

...

B.3.2.2 Chuẩn bị

Hòa tan thành phần trên trong nước. Lọc để khử trùng.

B.3.3 Chuẩn bị môi trường hoàn chỉnh

Làm nguội môi trường cơ bản đến khoảng 50 ⁰C và thêm 5 ml dung dịch polymixin B vô trùng. Trộn kỹ.

B.3.4 Chuẩn bị các đĩa thạch

Phân phối các lượng từ 15 ml đến 20 ml môi trường vào các đĩa Petri. Để cho bề mặt thạch khô trước khi sử dụng.

B.3.5 Kiểm chứng môi trường

Xem ISO/TS 11133 về các hướng dẫn.

Thực hiện ước tính hiệu quả của thạch đổ đĩa đối với mỗi mẻ SDS sử dụng thạch dinh dưỡng muối (SNA) làm môi trường so sánh và các chủng sau đây:

...

...

...

- V. cholerae không phải O1/không phải O139: NCTC 8042 (ATCC 14733);

- Escherichia coli: ATCC 25922, 8739 hoặc 11775.

Hiệu quả thạch đổ đĩa được tính bằng công thức sau đây:

trong đó N là số lượng khuẩn lạc đếm được.

Hiệu quả thạch đổ đĩa phải ít nhất là 50 % đối với chủng Vibrio và nhỏ hơn 1 % đối với E. coli. Các khuẩn lạc V. vulnificus NCTC 11067 phải là màu xanh/tía có quầng mờ đục bao quanh, trong khi đó các khuẩn lạc V. cholerae NCTC 8042 phải là màu vàng có quầng mờ đục bao quanh.

B.4 Thạch colistin polymyxin xellobioza (CPC)

B.4.1 Dung dịch 1

B.4.1.1 Thành phần

...

...

...

10,0 g

Dịch chiết thịt bò

5,0 g

Sắt xitrat

0,10 g

Natri clorua (NaCl)

20,0 g

Xanh bromothymol

0,04 g

...

...

...

0,04 g

Thạch

15,0 g

Nước cất

900 ml

B.4.1.2 Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên trong nước. Chỉnh pH đến 7,6 ± 0,2.

Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực ở nhiệt độ 121 ⁰C. Để nguội đến 50 ⁰C.

B.4.2 Dung dịch 2

...

...

...

Xellobioza

15,0 g

Colistin

1360 000 đơn vị

Polymixin B

100 000 đơn vị

Nước cất

100 ml

B.4.2.2 Chuẩn bị

...

...

...

B.4.3 Môi trường hoàn chỉnh

Cho (100 ml) dung dịch 2 vào (900 ml) dung dịch 1 và trộn.

B.4.4 Chuẩn bị các đĩa thạch

Phân phối các lượng 20 ml môi trường vào các đĩa Petri. Để cho bề mặt thạch khô trước khi sử dụng.

B.4.5 Kiểm chứng môi trường

Thực hiện ước tính hiệu quả của thạch đổ đĩa đối với mỗi mẻ CPC sử dụng thạch dinh dưỡng muối (SNA) làm môi trường so sánh và các chủng sau đây:

- Vibrio vulnificus: NCTC 11067 (ATCC 29307);

- Vibrio cholerae không phải O1/không phải O139: NCTC 8042 (ATCC 14733);

- Escherichia coli: ATCC 25922, 8739 hoặc 11775.

...

...

...

trong đó N là số lượng khuẩn lạc đếm được.

Hiệu quả thạch đổ đĩa phải ít nhất là 50 % đối với mỗi chủng Vibrio và nhỏ hơn 1 % đối với E. coli. Các khuẩn lạc V. vulnificus NCTC 11067 phải là màu vàng có quầng màu vàng bao quanh trong môi trường, trong khi đó các khuẩn lạc V. cholerae NCTC 8042 phải là màu đỏ tía có quầng đỏ tía bao quanh trong môi trường.

B.5 Thạch colistin polymyxin xellobioza cải biến (mCPC)

B.5.1 Dung dịch nhuộm gốc 1000 X

B.5.1.1 Thành phần

Xanh bromothymol

4,0 g

Đỏ cresol

...

...

...

Etanol, 95 %

100 ml

B.5.1.2 Chuẩn bị

Hòa tan các thuốc nhuộm vào etanol để cho dung dịch gốc 4 % (khối lượng bằng thể tích).

Cho 1 ml dung dịch này vào 1 l thạch mCPC để thu được nồng độ cuối cùng là 40 mg xanh bromothymol và 40 mg đỏ cresol trên lít.

B.5.2 Dung dịch 1

B.5.2.1 Thành phần

Pepton

10 g

...

...

...

5 g

Natri clorua (NaCl)

20 g

Dung dịch thuốc nhuộm gốc 1000 X

1 ml

Thạch

15 g

Nước cất

900 ml

...

...

...

Trộn các thành phần trên và chỉnh pH đến 7,6. Đun sôi để hòa tan thạch. Làm nguội đến khoảng 50 ⁰C.

B.5.3 Dung dịch 2

B.5.3.1 Thành phần

Xellobioza

10 g

Colistin

400 000 đơn vị

Polymixin B

100 000 đơn vị

...

...

...

100 ml

B.5.3.2 Chuẩn bị

Hòa tan xellobioza trong nước cất bằng cách đun nóng nhẹ. Để nguội đến khoảng 50 ⁰C.

Bổ sung các chất kháng sinh và trộn.

B.5.4 Môi trường hoàn chỉnh

B.5.4.1 Thành phần

Dung dịch thuốc nhuộm gốc 1 000 X

1 ml

Dung dịch 1

...

...

...

Dung dịch 2

100 ml

B.5.4.2 Chuẩn bị

Cho dung dịch 2 vào dung dịch 1 và trộn.

Cho 1 ml dung dịch này vào 1 l thạch mCPC để thu được nồng độ cuối cùng là 40 mg xanh bromothymol và 40 mg đỏ cresol trên lít.

B.5.5 Chuẩn bị các đĩa thạch

Phân phối các lượng 20 ml môi trường vào các đĩa Petri. Để cho bề mặt thạch khô trước khi sử dụng.

B.5.6 Kiểm chứng môi trường

Thực hiện ước tính hiệu quả của thạch đổ đĩa đối với mỗi mẻ CPC sử dụng thạch dinh dưỡng muối (SNA) làm môi trường so sánh và các chủng sau đây:

...

...

...

- V. cholerae không phải O1/không phải O139: NCTC 8042 (ATCC 14733);

- Escherichia coli: ATCC 25922, 8739 hoặc 11775.

Hiệu quả thạch ổ đĩa được tính bằng công thức sau đây:

trong đó N là số lượng khuẩn lạc đếm được.

Hiệu quả thạch đổ đĩa phải ít nhất là 50 % đối với mỗi chủng Vibrio và nhỏ hơn 1 % đối với E. coli. Các khuẩn lạc V. vulnificus NCTC 11067 phải là màu vàng có quầng màu vàng bao quanh trong môi trường, trong khi đó các khuẩn lạc V. cholerae NCTC 8042 phải là màu đỏ tía có quầng đỏ tía bao quanh trong môi trường.

B.6 Thạch dinh dưỡng muối (SNA)

B.6.1 Thành phần

Dịch chiết thịt

...

...

...

Pepton

3,0 g

Natri clorua (NaCl)

10,0 g

Thạch

Từ 8 g đến 18 g ^a

Nước

1 000 ml

^a Tùy thuộc vào sức đông của thạch.

...

...

...

Hòa tan các thành phần khô hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước, bằng cách đun nóng, nếu cần. Chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng là 7,2 ± 0,2 ở 25 ⁰C, nếu cần.

Chuyển môi trường này vào các vật chứa có dung tích thích hợp. Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực ở nhiệt độ 121 ⁰C.

B.6.3 Chuẩn bị các đĩa thạch của môi trường thạch dinh dưỡng muối

Phân phối các lượng từ 15 ml đến 20 ml môi trường, làm nguội đến khoảng 50 ⁰C, vào các đĩa Petri và để yên cho đông đặc.

Ngay trước khi sử dụng, làm khô cẩn thận các đĩa thạch (tốt nhất là mở nắp và lật úp đĩa) cho đến khi mặt thạch khô.

B.6.4 Chuẩn bị các ống thạch nghiêng

Phân phối khoảng 10 ml môi trường đã làm nguội đến khoảng 50 ⁰C vào các ống có dung tích thích hợp.

Để nghiêng ống cho đông đặc.

B.7 Thuốc thử phát hiện oxidaza

...

...

...

N, N, N'N' - Tetrametyl-p-phenylendiamin dihydroclorua

1,0 g

Nước

100 ml

B.7.2 Chuẩn bị

Hòa tan thành phần trên trong nước lạnh ngay trước khi sử dụng.

B.8 Thạch, sắt, ba đường và muối (TSI)

B.8.1 Môi trường cơ bản

B.8.1.1 Thành phần

...

...

...

20,0 g

Dịch chiết thịt

3,0 g

Dịch chiết nấm men

3,0 g

Natri clorua (NaCl)

10,0 g

Lactoza

10,0 g

...

...

...

10,0 g

Glucoza

1,0 g

Sắt (III) xitrat

0,3 g

Đỏ phenol

0,024 g

Thạch

Từ 8,0 g đến 18 g ^a

...

...

...

1 000 ml

^a Tùy thuộc vào sức đông của thạch.

B.8.1.2 Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước, bằng cách đun nóng, nếu cần. Chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng là 7,4 ± 0,2 ở 25 ⁰C, nếu cần.

Chuyển môi trường này với các lượng 10 ml vào các ống có dung tích thích hợp. Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực ở nhiệt độ 121 ⁰C.

Để yên ở tư thế nghiêng cho đông đặc, sao để thu được khoảng 2,5 cm chiều sâu ống.

Nếu sau khi chuẩn bị, môi trường được sử dụng sau 8 ngày, thì phục hồi môi trường này bằng cách làm tan chảy trên nồi cách thủy hoặc bằng thổi hơi nước tự do trong 10 min. Để cho đông đặc như mô tả ở trên.

B.9 Môi trường muối để phát hiện Ornithin decarboxylaza (ODC)

B.9.1 Thành phần

...

...

...

5,0 g

Dịch chiết nấm men

3,0 g

Glucoza

1,0 g

Bromocresol tía

0,015 g

Natri clorua (NaCl)

10,0 g

...

...

...

1 000 ml

B.9.2 Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 6,8 ± 0,2 ở 25 ⁰C, nếu cần.

Phân phối môi trường này với các lượng từ 2 ml đến 5 ml vào các ống hẹp. Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực ở nhiệt độ 121 ⁰C.

B.10 Môi trường muối để phát hiện lysin decarboxylaza (LDC)

B.10.1 Thành phần

L-lysin monohydroclorua

5,0 g

Dịch chiết nấm men

...

...

...

Glucoza

1,0 g

Bromocresol tía

0,015 g

Natri clorua (NaCl)

10,0 g

Nước

1 000 ml

B.10.2 Chuẩn bị

...

...

...

Phân phối môi trường này với các lượng từ 2 ml đến 5 ml vào các ống hẹp. Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực ở nhiệt độ 121 ⁰C.

B.11 Môi trường muối để phát hiện Arginin dihydroxylaza (ADH)

B.11.1 Thành phần

Arginin monohydro clorua

5,0 g

Dịch chiết nấm men

3,0 g

Glucoza

1,0 g

...

...

...

0,015 g

Natri clorua

10,0 g

Nước

1 000 ml

B.11.2 Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 6,8 ± 0,2 ở 25 ⁰C, nếu cần.

Phân phối môi trường này với các lượng từ 2 ml đến 5 ml môi trường này vào các ống hẹp. Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực ở nhiệt độ 121 ⁰C.

B.12 Thuốc thử phát hiện β-galactoxidaza

...

...

...

B.12.1.1 Thành phần

2-orto-Nitrophenyl-β-D galactopyranosit (ONPG)

0,08 g

Nước

15 ml

B.12.1.2 Chuẩn bị

Hòa tan ONPG trong nước ở khoảng 50 ⁰C. Làm nguội dung dịch.

B.12.2 Dung dịch đệm

B.12.2.1 Thành phần

...

...

...

6,9 g

Natri hydroxit (NaOH) (dung dịch 0,1 mol/l)

Xấp xỉ 3 ml

Nước, lượng đủ cho thể tích cuối cùng là

50 ml

B.12.2.2 Chuẩn bị

Hòa tan natri dihydro phosphat trong khoảng 45 ml nước trong bình định mức.

Chỉnh pH đến 7,0 ± 0,2 ở 25 ⁰C bằng dung dịch natri hydroxit 0,1 mol/l. Thêm nước đến 50 ml.

B.12.3 Thuốc thử hoàn chỉnh

...

...

...

Dung dịch đệm (B.12.2)

5 ml

Dung dịch ONPG (B.12.1)

15 ml

B.12.3.2 Chuẩn bị

Cho dung dịch đệm vào dung dịch ONPG. Bảo quản dung dịch này ở nhiệt độ từ 0 ⁰C đến 5 ⁰C.

B.13 Môi trường muối để phát hiện indol

B.13.1 Môi trường muối tryptophan

B.13.1.1 Thành phần

...

...

...

10,0 g

DL- Tryptophan

1,0 g

Natri clorua (NaCl)

10,0 g

Nước

1000 ml

B.13.1.2 Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần và lọc. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 7,0 ± 0,2 ở 25 ⁰C, nếu cần.

...

...

...

B.13.2 Thuốc thử Kovacs

B.13.2.1 Thành phần

4-Dimetylaminobenzaldehyt

5 g

Axit clohydric, p = 1,18 g/ml đến 1,19 g/ml

25 ml

2-Metylbutan-2-ol

75 ml

B.13.2.2 Chuẩn bị

...

...

...

B.14 Dung dịch nước pepton muối

B.14.1 Thành phần

Pepton

10 g

Natri clorua (NaCl)

0 g, 20 g, 60 g, 80 g hoặc 100 g

Nước

1000 ml

B.14.2 Chuẩn bị

...

...

...

Phân phối môi trường này vào các ống có dung tích thích hợp. Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực ở nhiệt độ 121 ⁰C.

B.15 Dung dịch natri clorua

B.15.1 Thành phần

Natri clorua (NaCl)

10,0 g

Nước

1000 ml

B.15.2 Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 7,5 ± 0,2 ở 25 ⁰C, nếu cần.

...

...

...

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] ISO/TS 11133-1, Microbiology of food and animal feeding stuffs - Guidelines on preparation and production of culture media - Part 1: General guidelines on quality assurance for the preparation of culture media in the laboratory

[2] ISO/TS 11133-2, Microbiology of food and animal feeding stuffs - Guidelines on preparation and production of culture media - Part 2: Practical guidelines on performance testing of culture media.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 7905-2:2008 (ISO/TS 21872-2 : 2007) về Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp phát hiện Vibrio spp. có khả năng gây bệnh đường ruột - Phần 2: Phát hiện các loài không phải là Vibrio parahaemolyticus và Vibrio cholerae