5.1.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên trong nước, bằng cách đun nóng.

Chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng pH là 7,6 ± 0,2 ở 25 ⁰C, nếu cần.

Rót môi trường với các lượng 250 ml vào các bình cầu 500 ml.

Nếu tiến hành việc định lượng sử dụng các ống nghiệm (6.5) thì rót 20 ml hoặc 25 ml môi trường vào các ống nghiệm. Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực ở 121 ⁰C.

Trước khi sử dụng, đuổi khí môi trường.

5.2. Dung dịch pha loãng muối pepton

Xem 5.2.1 của TCVN 6507-1 (ISO 6887-1:1999).

6. Thiết bị và dụng cụ thủy tinh

...

...

...

6.1. Dụng cụ đồng hóa, dùng cho các mẫu thực phẩm dạng rắn [xem TCVN 6404 (ISO 7218)].

6.2. Nồi cách thủy, có khả năng duy trì nhiệt độ ở khoảng từ 44 ⁰C đến 47 ⁰C.

6.3. Bình kỵ khí, có bộ phận tạo môi trường kỵ khí và có cả hệ thống kiểm tra các điều kiện kỵ khí.

6.4. Tủ ấm, có khả năng duy trì nhiệt độ ở 37 ⁰C ± 1 ⁰C và ở 50 ⁰C ± 1 ⁰C, nếu cần.

6.5. Ống nghiệm, kích thước 16 mm x 160 mm và bình cầu hoặc chai có dung tích 500 ml.

7. Lấy mẫu

Điều quan trọng là mẫu gửi đến phòng thử nghiệm đúng là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Xem tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm. Nếu không có tiêu chuẩn riêng liên quan đến việc lấy mẫu sản phẩm thì các bên liên quan nên thỏa thuận với nhau về vấn đề này.

8. Chuẩn bị mẫu thử

...

...

...

9. Cách tiến hành

9.1. Yêu cầu chung

Sơ đồ cách tiến hành được nêu trong Phụ lục A.

9.2. Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu và dung dịch pha loãng

Xem TCVN 6507-1 (ISO 6887-1), TCVN 6263 (ISO 8261) hoặc tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm. Có thể cần xử lý nhiệt dung dịch huyền phù ban đầu để loại các dạng sinh dưỡng của vi khuẩn sinh bào tử và/hoặc không sinh bào tử. Nhiệt độ và thời gian gia nhiệt thay đổi tùy thuộc vào nhu cầu thực tế, từ những hợp chất tạo ra hiệu quả thanh trùng rõ rệt khi hiệu quả hoạt hóa nhiệt vừa phải (ví dụ 75 ⁰C trong 20 min), đến sôi trong vài phút. Trong trường hợp này, kết quả có thể được ghi là số bào tử vi khuẩn khử sulfit phát triển dưới điều kiện kỵ khí.

9.3. Nuôi cấy

Lấy hai đĩa Petri vô trùng. Dùng pipet vô trùng chuyển sang mỗi đĩa 1 ml mẫu thử nếu sản phẩm ở dạng lỏng, hoặc 1 ml huyền phù ban đầu nếu sản phẩm ở dạng khác.

Lấy hai đĩa Petri vô trùng khác. Dùng pipet vô trùng mới chuyển sang mỗi đĩa 1 ml dung dịch pha loãng thập phân thứ nhất (10^-1) của mẫu thử nếu sản phẩm ở dạng lỏng, hoặc 1 ml dung dịch pha loãng thập phân thứ nhất của huyền phù ban đầu (10^-2) nếu sản phẩm ở dạng khác.

Lặp lại quy trình trên với các dung dịch pha loãng tiếp theo, sử dụng mỗi pipet vô trùng mới cho mỗi độ pha loãng.

...

...

...

Sau khi môi trường đã đông đặc, phủ cùng loại môi trường lên đĩa với lượng từ 5 ml đến 10 ml.

Nếu dùng ống nghiệm thì cấy vào hai ống đựng môi trường để ở 44 ⁰C đến 47 ⁰C, mỗi ống 1 ml mỗi dung dịch pha loãng. Trộn nhẹ, không để tạo bọt và để yên cho môi trường đông đặc lại trên nồi cách thủy lạnh (6.2).

Sau khi môi trường đã đông đặc, phủ cùng loại môi trường lên mỗi ống với lượng từ 2 ml đến 3 ml.

9.4. Ủ ấm

Sau khi đã đông đặc, ủ ấm các đĩa Petri trong các bình kỵ khí (6.3) ở 37 ⁰C ± 1 ⁰C trong 24 h đến 48 h.

Nếu nghi ngờ có vi khuẩn ưa nhiệt, thì chuẩn bị một dãy các đĩa Petri thứ hai (xem 9.3). Ủ ấm dãy đĩa này ở 50 ⁰C ± 1 ⁰C.

Trong trường hợp dùng các ống, không cần phải ủ trong các bình kỵ khí.

9.5. Đếm khuẩn lạc

Đọc kết quả sau 24 h và 48 h, tùy vào độ đen và tốc độ phát triển của các vi sinh vật. Đếm các khuẩn lạc màu đen, có thể có quầng đen bao quanh được coi là vi khuẩn khử sulfit.

...

...

...

Đếm các khuẩn lạc của vi khuẩn khử sulfit trong mỗi đĩa chứa ít hơn 150 khuẩn lạc điển hình và chứa ít hơn 300 khuẩn lạc tổng số.

Khi số lượng khuẩn lạc cao, thì một số ống có thể không đếm được. Trong trường hợp này, chỉ có các ống có các khuẩn lạc mọc tách biệt rõ ràng mới dùng để đếm.

CHÚ THÍCH 2 Tiêu chuẩn này chỉ có thể sử dụng để định lượng chỉ Clostridium. Sau khi thu được các khuẩn lạc đặc trưng, từ mỗi đĩa lấy năm khuẩn lạc và được dùng để khẳng định chi Clostridium bằng các phép thử khẳng định (ví dụ, các phép thử hô hấp, sinh bào tử).

10. Biểu thị kết quả và giới hạn tin cậy

Xem phần bổ sung của TCVN 6404 (ISO 7218).

11. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

...

...

...

d) mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy ý lựa chọn, cùng với các chi tiết bất thường khác có thể ảnh hưởng tới kết quả;

e) các kết quả thử nghiệm thu được;

Báo cáo kết quả cũng phải nêu rõ nếu các phép thử tiếp theo được thực hiện bởi phòng thử nghiệm chuẩn, hoặc nếu đã thực hiện thì nêu kết quả thu được.

PHỤ LỤC A

(quy định)

Sơ đồ cách tiến hành

...

...

...

[1] NMKL No. 95:1997, Sulfite-reducing Clostridia - Determination in food 1).

1) Phương pháp NMKL soát xét này do Reidar Skjelkvale soạn thảo. Oslo City Food Control Authority, Vestbyvn, 13, N-0976 Oslo, Norway.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 7902:2008 (ISO 15213 : 2003) về Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp định lượng vi khuẩn khử sulfit phát triển trong điều kiện kỵ khí