CHÚ THÍCH 1: Nếu cho thấy đáng tin cậy, có thể sử dụng nhận dạng Cronobacter spp. bằng sinh hóa trong TCVN 6404 (ISO 7218).

CHÚ THÍCH 2: Có thể sử dụng các quy trình thay thế khác để khẳng định chủng phân lập là Cronobacter spp., với điều kiện là sự phù hợp của quy trình thay thế đã được xác nhận [xem thêm TCVN 6404 (ISO 7218)].

10.5.3.2  Oxydase

Sử dụng vòng cấy platin-iridi hoặc bằng chất dẻo (7.3), lấy một phần khuẩn lạc riêng rẽ từ mỗi đĩa (10.5.2) và ria lên giấy lọc đã làm ẩm với thuốc thử oxidase (B.5.1): màu tím hoa cà, màu tím hoặc màu xanh đậm xuất hiện trong vòng 10 s cho thấy phản ứng dương tính. Nếu sử dụng bộ kit thử oxidase có bán sẵn, cần thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

10.5.3.3  Thủy phân cơ chất 4 Nitrophenyl (PNP) α-D-glucopyranosid

Dùng que cấy (7.3) lấy từng khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch không chọn lọc như TSA (10.5.2) hòa vào 2 ml dung dịch muối sinh lý, 0,85 % NaCl (B.5.2.4). Thêm 2 ml dung dịch thử nghiệm enzym α-glucosidase (B.5.2). Ủ trong nồi cách thủy ở 37 °C (7.12) trong 4 h và đo màu vàng trong máy đo quang phổ (7.9) ở bước sóng 405 nm. Độ hấp thụ sau 4 h tối thiểu là 0,3 ở 405 nm tương đương với 16 mM PNP, có thể được coi là dương tính.

10.5.3.4  L-Lysin decarboxylase

Dùng vòng hoặc que cấy (7.3) cấy từng khuẩn lạc đã chọn (10.5.2) vào ngay dưới bề mặt môi trường L-lysin khử nhóm carboxyl (B.5.3). Ủ các ống ở 37 °C (7.2) trong 24 h ± 2 h.

Màu tím sau khi ủ chứng tỏ phản ứng dương tính. Màu vàng là phản ứng âm tính.

...

...

...

Dùng que cấy (7.3) cấy từng khuẩn lạc đã chọn (10.5.2) vào ngay dưới bề mặt môi trường L-ornithine khử nhóm carboxyl (B.5.4). Ủ các ống ở 37 °C (7.2) trong 24 h ± 2 h.

Màu tím sau khi ủ chứng tỏ phản ứng dương tính. Màu vàng là phản ứng âm tính.

10.5.3.6  Lên men các loại carbohydrat khác nhau

Dùng que cấy (7.3) cấy từng khuẩn lạc đã chọn (10.5.2) vào ngay dưới bề mặt môi trường lên men carbohydrat (B.5.5). Ủ các ống ở 37 °C (7.2) trong 48 h ± 2 h.

Màu vàng sau khi ủ chứng tỏ phản ứng dương tính. Màu đỏ là phản ứng âm tính.

10.5.3.7  Đỏ metyl (MR) (tùy chọn)

Dùng vòng hoặc que cấy (7.3) cấy từng khuẩn lạc đã chọn (10.5.2) vào ngay dưới bề mặt môi trường canh thang MR-VP (B.5.6). Ủ các ống ở 37 °C (7.2) trong 48 h ± 2 h. Nhỏ năm giọt dung dịch đỏ metyl (B.5.6.2) vào mỗi ống. Màu đỏ chứng tỏ phản ứng dương tính. Màu vàng là phản ứng âm tính.

10.5.3.8  Voges-Proskauer (VP) (tùy chọn)

Dùng vòng hoặc que cấy (7.3) cấy từng khuẩn lạc đã chọn (10.5.2) vào ngay dưới bề mặt môi trường canh thang MR-VP (B.5.6). Ủ các ống ở 37 °C (7.2) trong 24 h ± 2 h. Thêm vào mỗi ống 0,2 ml dung dịch KOH 40 % (B.5.6.3.1) và 0,6 ml dung dịch 1-naphtol (B.5.6.3.2). Để yên 1 h ± 0,5 h. Màu hồng eosin xung quanh bề mặt môi trường chứng tỏ phản ứng dương tính.

...

...

...

Cronobacter spp. âm tính với oxisase và có thể thủy phân cơ chất 4-Nitrophenyl α-D-glucopyranoside và sinh axit từ sucrose. Chúng không khử nhóm carboxyl hóa của L-lysin và sinh axit từ D-sorbitol. Chỉ có rất ít chủng Cronobacter cho phản ứng đỏ metyl dương tính và hiếm khi cho phép thử Voges Proskauer âm tính. Có thể phân biệt Cronobacter spp. với các loài có quan hệ gần gũi bằng các đặc tính được liệt kê trong Phụ lục C.

CHÚ THÍCH: Cronobacter spp. được mô tả trong tài liệu tham khảo [9] và [11].

11  Biểu thị kết quả

Với các kết quả thử sinh hóa và diễn giải, nêu rõ có mặt hay không có mặt Cronobacter spp. trong x g hoặc x ml phần mẫu thử [xem TCVN 6404 (ISO 7218)].

12  Đặc tính hiệu năng của phương pháp

12.1  Nghiên cứu liên phòng

Độ chính xác (độ chụm) của phương pháp đã được xác định trong nghiên cứu liên phòng thử nghiệm đề xác định độ đặc hiệu, độ chọn lọc và LOD₅₀ của phương pháp, khi có thể. Dữ liệu được nêu trong Phụ lục D. Các giá trị thu được từ nghiên cứu liên phòng này có thể không áp dụng được cho các loại thực phẩm khác với các loại thực phẩm nêu trong Phụ lục D.

12.2  Độ chọn lọc

Độ chọn lọc được xác định là số lượng mẫu cho kết quả dương tính chia cho số lượng mẫu được thử nghiệm ở nồng độ nhiễm đã biết. Các kết quả do đó phụ thuộc vào mức nhiễm của mẫu.

...

...

...

Độ đặc hiệu được xác định là số lượng mẫu tìm thấy âm tính chia cho số lượng mẫu trắng được thử nghiệm.

12.4  LOD₅₀

LOD₅₀ là nồng độ (cfu/mẫu) mà tại đó khả năng phát hiện là 50 %.

13  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

b) phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

c) mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy lựa chọn cùng với các chi tiết bất thường khác có thể ảnh hưởng tới kết quả;

d) các kết quả thử nghiệm thu được.

...

...

...

Phụ lục A

(Quy định)

Sơ đồ của quy trình thử nghiệm

Hình A.1 - Sơ đồ quy trình phát hiện Cronobacter spp. trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và mẫu môi trường từ cơ sở sản xuất thực phẩm

Phụ lục B

(Quy định)

...

...

...

B.1  Nước đệm pepton (BPW)

B.1.1  Thành phần

Pepton ^a

10,0 g

Natri clorua (NaCl)

5.0 g

Dinatri hydro phosphat ngậm mười hai phân tử nước (Na₂HPO₄.12 H₂O)

9,0 g

Kali dihydro phosphat (KH₂PO₄)

...

...

...

Nước

1 000 ml

^a ví dụ sản phẩm thủy phân casein bằng enzym.

B.1.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong nước, bằng cách đun nóng, nếu cần. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,0 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần.

Phân phối môi trường vào các bình cầu (7.5) có dung tích thích hợp để thu được các lượng cần thiết cho phép phân tích.

Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực (7.1) ở 121 °C. Bảo quản môi trường trong các bình đậy kín ở 5 °C (7.11) đến 6 tháng.

B.2  Canh thang chọn lọc Cronobacter (CSB)

B.2.1  Môi trường cơ bản

...

...

...

Sản phẩm thủy phân mô động vật bằng enzym

10,0 g

Chất chiết thịt

3,0 g

Natri clorua (NaCI)

5,0 g

Tía Bromocresol

0,04 g

Sucrose (C₁₂H₂₂O₁₁)

...

...

...

Nước

1 000 ml

B.2.1.2  Chuẩn bị

Hòa tan từng thành phần trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần.

Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,4 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần. Chuyển 10 ml môi trường cơ bản vào các ống (7.7). Khử trùng các ống trong nồi hấp áp lực (7.1) ở 121 °C trong 15 min. Bảo quản môi trường ở 5 °C (7.11) trong vòng 6 tháng.

B.2.2  Dung dịch vancomyxin

B.2.2.1  Thành phần

Vancomyxin hydro clorua (số CAS 1404-93-9)

10 mg

...

...

...

10 ml

B.2.2.2  Chuẩn bị

Hòa tan vancomyxin trong nước cất. Trộn và khử trùng bằng cách lọc qua bộ lọc cỡ lỗ 0,2 µm.

Dung dịch vancomyxin có thể bền ở 5 °C trong 15 ngày.

B.2.3  Môi trường hoàn chỉnh

Thêm 0,1 ml dung dịch vancomycin (B.2.2) một cách vô trùng vào 10 ml môi trường cơ bản (B.2.1) sao cho thu được nồng độ vancomyxin cuối cùng là 10 mg/l CSB.

Môi trường CSB hoàn chỉnh có thể bền ở 5 °C (7.11) trong 1 ngày.

B.3  Thạch phân lập Cronobacter sinh màu (CCI)

B.3.1  Thành phần

...

...

...

7,0 g

Chất chiết nấm men

3,0 g

Natri clorua (NaCI)

5,0 g

5-bromo-4-chloro-3-indolyl-α-D-glucopyranosid

0,15 g

Natri desoxycholat (C₂₄H₃₉NaO₄)

0,25 g

...

...

...

1 g

Natri thiosulfat (Na₂S₂O₃)

1 g

Thạch

9,0 g đến 18,0 g^a

Nước

1000ml

^a Tùy thuộc vào sức đông của thạch.

B.3.2  Chuẩn bị

...

...

...

Khử trùng trong nồi hấp áp lực (7.1) ở 121 °C trong 15 min. Làm nguội trong khoảng nhiệt độ từ 47 °C đến 50 °C. Rót khoảng 18 ml đến 20 ml môi trường thạch CCI vào các đĩa Petri (7.8) rỗng vô trùng và để cho đông đặc trên mặt nằm ngang, mát.

Môi trường có thể giữ ở 5 °C (7.11) lên đến 14 ngày.

B.4  Thạch đậu tương trypton (TSA) (ví dụ của môi trường không chọn lọc)

B.4.1  Thành phần

Sản phẩm thủy phân casein bằng enzym

15,0 g

Sản phẩm thủy phân đậu tương bằng enzym

5,0 g

Natri clorua (NaCl)

...

...

...

Thạch

từ 9,0 g đến 18,0 g^a

Nước

1 000 ml

^a Tùy thuộc vào sức đông của thạch.

B.4.2  Chuẩn bị

Hòa tan từng thành phần trong nước bằng cách đun sôi. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,3 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần. Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực (7.1) ở 121 °C. Làm nguội trong khoảng nhiệt độ từ 47 °C đến 50 °C. Rót khoảng 18 ml đến 20 ml TSA vào các đĩa Petri (7.8) rỗng vô trùng và để cho đông đặc trên mặt phẳng nằm ngang, mát.

Bảo quản môi trường theo TCVN 8128 (ISO 11133).

B.5  Môi trường và thuốc thử đặc tính sinh hóa

...

...

...

B.5.1.1  Thành phần

N,N,N’,N’-Tetrametyl-p-phenylenediamin dihydro clorua (C₁₀H₁₆N₂.2HCI)

1,0 g

Nước

100 ml

B.5.1.2  Chuẩn bị

Hòa tan thành phần trên trong nước ngay trước khi sử dụng.

B.5.2  Dung dịch thử enzym α-Glucosidase

B.5.2.1  Đệm phosphat, 0,3 M (pH 7,0)

...

...

...

Natri phosphat monobasic ngậm 1 phân tử nước (NaH₂PO₄.H₂O)

1,75 g

Natri phosphat dibasic ngậm 7 phân tử nước (Na₂HPO₄.7H₂O)

4,64 g

Nước

90 ml

B.5.2.1.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong nước vô trùng và bảo quản ở 5 °C (7.11) không quá 15 ngày.

B.5.2.2  Cơ chất 4-Nitrophenyl α-D-glucopyranosid

...

...

...

4-Nitrophenyl α-D-glucopyranosid (C₁₂H₁₅NO₈)

0,4 g

Nước

10 ml

B.5.2.2.2  Chuẩn bị

Hòa tan thành phần trong nước ở 50 °C ngay trước khi sử dụng.

B.5.2.3  Môi trường hoàn chỉnh

Cho 10 ml cơ chất 4-Nitrophenyl α-D-glucopyranoside (B.5.2.2) vào 90 ml dung dịch đệm phosphat (B.5.2.1) để đạt được nồng độ 4-Nitrophenyl α-D-glucopyranoside cuối cùng 0,4 g/100 ml dung dịch thử enzym α-glucosidase.

Dung dịch thử nenzym α-glucosidase hoàn chỉnh có thể được giữ ở 5 °C (7.11) trong một ngày.

...

...

...

B.5.2.4.1  Thành phần

Natri clorua (NaCI)

0,85 g

Nước

100 ml

B.5.2.4.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong nước và bảo quản ở 5 °C (7.11) trong không quá 15 ngày.

B.5.3  Môi trường L-lysin khử nhóm carboxyl (decarboxylation)

B.5.2.1  Thành phần

...

...

...

5g

Dịch chiết nấm men

3g

Glucoza (C₆H₁₂O₆)

1g

Tía bromocresol

0,015 g

Nước

1 000 ml

...

...

...

Hòa tan từng thành phần trong nước bằng cách đun sôi, nếu cần. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 6,8 ± 0,2 ở 25 °C. Phân phối 5 ml môi trường L-lysin khử nhóm carboxyl sang các ống nghiệm (7.7).

Khử trùng các ống nghiệm trong nồi hấp áp lực (7.1) ở nhiệt độ 121 °C trong 15 min. Bảo quản các ống đã rót ở 5 °C (7.11) đến 3 tháng.

B.5.4  Môi trường L-Ornithin khử nhóm carboxyl (decarboxylation)

B.5.4.1  Thành phần

L-Ornithin monohydroclorua (C₅H₁₂N₂O₂.HCI)

10g

Chất chiết nấm men

3g

Glucose (C₆H₁₂O₆)

...

...

...

Tía bromocresol

0,015 g

Nước

1 000 ml

B.5.4.2  Chuẩn bị

Hòa tan từng thành phần trong nước bằng cách đun sôi, nếu cần. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 6,8 ±0,2 ở 25 °C.

Phân phối 5 ml môi trường L-ormithin khử carboxyl vào các ống nghiệm (7.7). Khử trùng các ống đựng môi trường này trong nồi hấp áp lực (7.7) ở nhiệt độ 121 °C trong 15 min. Bảo quản các ống ở 5 °C (7.11) đến 3 tháng.

B.5.5  Môi trường lên men cacbohydrat (nước pepton có đỏ phenol, D-arabitol, α-methyl-D-glucoside, D-sorbitol and D-sucrose)

B.5.5.1  Môi trường cơ bản

...

...

...

Sản phẩm thủy phân casein bằng enzym

10 g

Natri clorua (NaCI)

5g

Đỏ phenol

0,02 g

Nước

1 000 ml

B.5.5.1.2  Chuẩn bị

...

...

...

Phân phối môi trường cơ bản này sang các bình cầu (7.5) có dung tích thích hợp. Khử trùng trong nồi hấp áp lực (7.1) ở nhiệt độ 121 °C trong 15 min. Bảo quản môi trường ở 5 °C (7.11) lên đến 6 tháng.

B.5.5.2  Dung dịch cacbohydrat D-arabitol (C₅H₁₂O₅), α-Methyl-D-glucoside (C₇H₁₄O₆), D-sorbitol (C₆H₁₄O₆) và D-sucrose (C₁₂H₂₂O₁₁), 80 mg/ml.

B.5.5.2.1  Thành phần

Cacbohydrat

8g

Nước

100 ml

B.5.5.2.2  Chuẩn bị

Hòa tan riêng rẽ bốn thành phần cacbohydrat trong nước để thu được bốn dung dịch cacbohydrat. Khử trùng tất cả dung dịch bằng cách lọc qua bộ lọc cỡ lỗ 0,2 µm. Bảo quản môi trường ở 5 °C (7.11) lên đến 6 tháng.

...

...

...

B.5.5.3.1  Thành phần

Môi trường cơ bản (B.5.5.1)

875 ml

Dung dịch cacbohydrat (B.5.5.2)

125 ml

B.5.5.3.2  Chuẩn bị

Đối với từng loại cacbohydrat, cho dung dịch cacbohydrat đã chuẩn bị (B.5.5.2) vào môi trường cơ bản (B.5.5.1) một cách vô trùng và trộn đều. Phân phối 10 ml môi trường hoàn chỉnh của từng cacbohydrat vào các ống nghiệm (7.7) vô trùng.

Môi trường cacbohydrat hoàn chỉnh cần được chuẩn bị trong ngày sử dụng.

B.5.6  Các hợp chất phản ứng Đỏ metyl (MR) và Voges-Proskauer (VP)

...

...

...

B.5.6.1.1  Thành phần

Sản phẩm thủy phân mô động vật bằng enzym

7 g

D-glucose

5g

Dikali hydro phosphat (K₂HPO₄)

5g

Nước

100 ml

...

...

...

Hòa tan từng thành phần trong nước bằng cách đun sôi, nếu cần. Chỉnh pH, nếu cần, sao cho sau khi khử trùng pH là 6,9 ± 0,2 ở 25 °C.

Phân phối 10 ml môi trường MR/VP này vào từng ống nghiệm (7.7). Hấp khử trùng môi trường này trong nồi hấp áp lực (7.1) ở nhiệt độ 121 °C trong 15 min. Bảo quản môi trường ở 5 °C (7.11) lên đến 6 tháng.

B.5.6.2  Thuốc thử đỏ metyl (MR)

B.5.6.2.1  Thành phần

Đỏ metyl (C₁₅H₁₅N₃O₂)

0,03 g

Etanol

85,5 ml

Nước

...

...

...

B.5.6.2.2  Chuẩn bị

Hòa tan đỏ metyl trong dung dịch etanol:nước. Không khử trùng, nếu cần. Bảo quản ở nhiệt độ phòng (từ 20 °C đến 25 °C).

B.5.6.3  Thuốc thử Voges-Proskauer (VP)

B.5.6.3.1  Dung dịch KOH 40 %

B.5.6.3.1.1  Thành phần

Kali hydroxit (KOH)

40 g

Nước

100 ml

...

...

...

Hòa tan kali hydroxit trong nước. Không khử trùng, nếu cần. Bảo quản ở nhiệt độ phòng (từ 20 °C đến 25 °C).

B.5.6.3.2  Dung dịch 1-naphtol 5 %

B.5.6.3.2.1  Thành phần

1-naphthol (C₁₀H₇OH)

5g

Etanol

100 ml

B.5.6.3.2.2  Chuẩn bị

Hòa tan 1-naphtol trong etanol. Không khử trùng, nếu cần. Bảo quản ở nhiệt độ phòng (từ 20 °C đến 25 °C).

...

...

...

Thực hiện phép thử hiệu năng của môi trường nuôi cấy và thuốc thử theo các phương pháp và tiêu chí quy định trong TCVN 8128 (ISO 11133), xem Bảng B.1.

Bảng B.1 - Phép thử hiệu năng để đánh giá chất lượng môi trường nuôi cấy

Môi trường

Loại³

Chức năng

Ủ

Chủng kiểm chứng

Số WDCM^C

Phương pháp kiểm soát

...

...

...

Phản ứng đặc trưng

BPWg

L

Năng suất

(18 ± 2) h / 34 °C đến 38 °C

Cronobacter sakazakii Cronobacter muytjensii

00214^b 00213

Định tính

Độ đục (1-2)^e

...

...

...

CSB

L

Năng suất

(24 ± 2) h / (41,5 ± 1) °C

Cronobacter sakazakii + Staphylococcus aureus^d

00214^b

00032 hoặc 00034

Định tính

Thay đổi màu của CSB

...

...

...

Màu vàng của CSB;

Khuẩn lạc có màu xanh da trời đến màu lục lam, khối lượng nhỏ đến trung bình (1 mm đến 3 mm) trên CCI

Cronobacter muytjensil + Staphylococcus aureus^d

00213

00032 hoặc 00034

Chọn lọc

(24 ± 2) h / (41,5 ± 1) °C

Staphylococcus aureus^d

00032 hoặc 00034

...

...

...

Ức chế hoàn toàn hoặc ức chế một phần trên TSA

≤ 100 khuẩn lạc

CSB có màu tía

CCI

S

Năng suất

(24 ± 2) h / (41,5 ± 1) °C

Cronobacter sakazakii Cronobacter muytjensii

00214 ^b 00213

...

...

...

Phát triển tốt (2)^f

Khuẩn lạc có màu xanh da trời đến màu Iục lam, khối lượng nhỏ đến trung bình (1 mm đến 3 mm)

Chọn lọc

Staphylococcus aureus^d

00032 hoặc 00034

Định tính

Không phát triển (0)^f

—

Đặc hiệu

...

...

...

00083

Định tính

Phát triển (1-2)^f

Khuẩn lạc không có màu xanh da trời hoặc lục lam

^a L = môi trường lòng, S = môi trường rắn

^b Chủng tối thiểu phải sử dụng.

^c Danh mục chủng tham khảo có sẵn tại www.wfcc.info thông tin về số chủng cấy thu thập, chi tiết liên lạc WDCM: Trung tâm dữ liệu thế giới về vi sinh vật.

^d Chủng được tự do lựa chọn nhưng một trong số đó là chủng tối thiểu phải sử dụng.

^e Phân loại sự phát triển: 0: không phát triển; 1: hơi đục; 2: rất đục (xem TCVN 8128 (ISO 11133).

...

...

...

^g Môi trường dùng cho mọi mục đích, tham khảo TCVN 8128 (ISO 11133).

Phụ lục C

(Tham khảo)

Phân biệt Cronobacter spp. với các chi khác

Bảng C.1 - Phân biệt Cronobacter spp. với các chi khác

Cronobacter^a

Enterobacter và các loài có liên quan^b

...

...

...

C. malo- naticus

C. condi-menti/ C. muyt- jensii

C. saka-zakii

C. turi- censis/ C. universalis

E.aero-genes

E.can- cerog- enus

E. cloacae^c

E ger- goviae^e

F. helv- eticus^d

...

...

...

F. pul- veris^d

S.turi- censis^d

Oxidase

0

0

0

0

0

0

...

...

...

0

0

0

0

0

0

Thủy phân 4-NP α-D- glucoside

100

100

...

...

...

100

100

0

0

1

0

100

0

100

...

...

...

Lysin decarboxy lase

0

0

0

0

0

98

0

0

...

...

...

0

0

0

0

Omithin decarboxy lase

100

95

100

94

...

...

...

98

100

96

100

0

91

0

0

Đỏ methyl

...

...

...

0

0

1

0

5

0

5

5

91

...

...

...

83

100

Voges- Proskauer

100

100

100

99

100

98

...

...

...

100

100

9

100

17

0

Axit từ:

...

...

...

...

...

...

D-Arabitol

17

0

0

0

10

100

0

15

...

...

...

91

0

83

100

α-Methyl-D-glucoside

100

100

0

100

...

...

...

95

0

85

2

0

83

0

0

D-Sorbitol

...

...

...

0

0

0

0

100

0

95

0

0

...

...

...

0

0

D-Sucrose

100

100

100

100

100

100

...

...

...

97

98

0

100

100

0

Chữ số biểu thị phần trăm chủng dương tính.

^a Từ Tài liệu tham khảo [7], [8], [9] và [11].

^b Từ Tài liệu tham khảo [12], [13] và [14].

...

...

...

^d Franconibacter helveticus, Franconibacter pulveris và Siccibacter turicensis có thể xuất hiện như khuẩn lạc dương tính giả định trên thạch CCI.

^e Phần trăm tương tự thu được đối với E. pyrinus.

Phụ lục D

(Tham khảo)

Nghiên cứu xác nhận giá trị sử dụng phương pháp và đặc tính hiệu năng

D.1  Kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm

Các nghiên cứu liên phòng quốc tế gồm 14 đến 17 cộng tác viên từ 9 quốc gia đã tham gia thực hiện. Các nền mẫu được sử dụng để xác nhận giá trị sử dụng phương pháp này là các loại thực phẩm điển hình nhất, các thành phần hoặc các mẫu được điều tra về sự có mặt của Cronobacter spp.: bột sữa công thức cho trẻ sơ sinh; thức ăn công thức cho trẻ sơ sinh từ bột đậu nành; lactose; tinh bột và các mẫu môi trường. Các mẫu được kiểm tra ở hai mức độ nhiễm khác nhau kèm với kiểm chứng âm. Nghiên cứu được tổ chức vào năm 2013 bởi AINIA, Valencia, Tây Ban Nha, là một phần của CEN Mandate M/381 của Ủy ban châu Âu.

Tiêu chuẩn này đã được nghiên cứu liên phòng. Các bộ sưu tập nhỏ [xem TCVN 6404 (ISO 7218)] được sử dụng để khẳng định các khuẩn lạc. Các giá trị về đặc tính hiệu năng thu được từ các nghiên cứu liên phòng cho từng loại mẫu được nêu trong các Bảng D.1 đến D.5. Dữ liệu thu được từ một số cộng tác viên đã bị loại ra khỏi phép tính vì các lý do kỹ thuật đã được xác định rõ ràng (sai lệch so với quy trình quy định).

...

...

...

Bảng D.1 - Kết quả phân tích dữ liệu thu được với sữa bột công thức cho trẻ sơ sinh

Đặc tính hiệu năng

Mẫu trắng

Mức nuôi cấy thấp
4 cfu/10 g

Mức nuôi cấy cao^a 55 cfu/10 g

Số lượng phòng thử nghiệm tham gia

17

17

17

...

...

...

15

15

15

Số lượng mẫu trên mỗi phòng thử nghiệm

8

8

8

Số lượng mẫu còn lại sau đánh giá dữ liệu

120

...

...

...

120

Cỡ mẫu (g/ml/cm²/đơn vị)

10

10

10

Độ nhạy, %

-

-

100

...

...

...

99

-

-

LOD₅₀, cfu/phần mẫu thử (mức tin cậy 95 %)

-

1,1 (0,8 đến 1,4)

^a Sữa bột công thức cho trẻ sơ sinh (có bán sẵn), chứa bifidobacteria ở mức từ 1,0 E+6 cfu/g đến 1,0 E+7 cfu/g, đã được nuôi cấy với Cronobacter sakazakii.

Bảng D.2 - Kết quả phân tích dữ liệu thu được với thức ăn công thức cho trẻ sơ sinh từ bột đậu nành

Đặc tính hiệu năng

...

...

...

Mức nuôi cấy thấp
4 cfu/10 g

Mức nuôi cấy cao^a 50 cfu/10 g

Số lượng phòng thử nghiệm tham gia

16

16

16

Số lượng phòng thử nghiệm còn lại sau đánh giá dữ liệu

14

14

...

...

...

Số lượng mẫu trên mỗi phòng thử nghiệm

8

8

8

Số lượng mẫu còn lại sau đánh giá dữ liệu

109

112

112

Cỡ mẫu (g/ml/cm²/đơn vị)

...

...

...

10

10

Độ nhạy, %

-

-

71^b

Độ đặc hiệu, %

99

-

...

...

...

LOD₅₀, cfu/phần mẫu thử

-

0,83 (0,66 đến 1,05)

^a Thức ăn công thức dành cho trẻ sơ sinh từ bột đậu nành đã được cấy Cronobacter sakazakii. Chỉ Enterobacter cloacae (5 cfu/10 g) được nuôi cấy ở mức độ nhiễm cao hơn.

^b Độ nhạy thấp khi phát hiện Cronobacter spp. ở mức cấy này là do Enterobacter cloacae phát triển quá mức làm khó khăn hơn cho việc chọn khuẩn lạc.

Bảng D.3 - Kết quả phân tích dữ liệu thu được với lactose

Đặc tính hiệu năng

Mẫu trắng

Mức nuôi cấy thấp^a
27 cfu/10 g

...

...

...

Số lượng phòng thử nghiệm tham gia

16

16

16

Số lượng phòng thử nghiệm còn lại sau đánh giá dữ liệu

16

16

16

Số lượng mẫu trên mỗi phòng thử nghiệm

...

...

...

8

8

Số lượng mẫu còn lại sau đánh giá dữ liệu

128

128

128

Cỡ mẫu (g/ml/cm²/đơn vị)

10

10

...

...

...

Độ nhạy, %

-

67^b

100

Độ đặc hiệu, %

99

-

-

LOD₅₀, (khoảng tin cậy 95 %) cfu/phần mẫu thử

...

...

...

Không xác định được

^a Các mẫu lactose được cấy Cronobacter turicensis.

^b Độ nhạy thấp khi phát hiện Cronobacter spp. ở mức cấy này là do vi khuẩn cấy mất khả năng sống quan sát được sau khi chuẩn bị mẫu.

Bảng D.4 - Kết quả phân tích dữ liệu thu được với tinh bột

Đặc tính hiệu năng

Mẫu trắng

Mức nuôi cấy thấp^a 11 cfu/10 g

Mức nuôi cấy cao^a 19 cfu/10 g

Số lượng phòng thử nghiệm tham gia

...

...

...

14

14

Số lượng phòng thử nghiệm còn lại sau đánh giá dữ liệu

12

12

12

Số lượng mẫu trên mỗi phòng thử nghiệm

8

8

...

...

...

Số lượng mẫu còn lại sau đánh giá dữ liệu

128

128

128

Cỡ mẫu (g/ml/cm²/đơn vị)

10

10

10

Độ nhạy, %

...

...

...

-

65^b

Độ đặc hiệu, %

100

-

LOD₅₀, cfu/phần mẫu thử

-

0,94 (0,73 đến 1,21)

...

...

...

^b Độ nhạy thấp khi phát hiện Cronobacter spp. ở mức này là do mức cấy thấp hơn so với dự kiến có trong các mẫu này.

Bảng D.5 - Kết quả phân tích dữ liệu thu được với các mẫu môi trường

Đặc tính hiệu năng

Mẫu trắng^a

Mức nuôi cấy thấp^a 28 cfu/10 g

Mức nuôi cấy cao^a 95 cfu/10g

Số lượng phòng thử nghiệm tham gia

15

15

...

...

...

Số lượng phòng thử nghiệm còn lại sau đánh giá dữ liệu

10

10

10

Số lượng mẫu trên mỗi phòng thử nghiệm

8

8

8

Số lượng mẫu còn lại sau đánh giá dữ liệu

...

...

...

80

80

Cỡ mẫu (g/ml/cm²/đơn vị)

Mẫu tăm bông

Mẫu tăm bông

Mẫu tăm bông

Độ nhạy, %

-

91

...

...

...

Độ đặc hiệu, %

100

-

-

LOD₅₀, cfu/phần mẫu thử

-

Không xác định được

⁸ Các mẫu môi trường (tăm bông), có chứa vi khuẩn nhiễm tự nhiên (Bacillus spp. ở mức 1,0 E + 6 cfu/g) đã được nuôi cấy với Cronobacter dublinensis spp. dublinensis. Các mẫu trắng bị làm nhiễm với hỗn hợp Franconibacter pulveris và Franconibacter helveticus.

...

...

...

[1] TCVN 12365 (ISO 16140) (tất cả các phần), Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm - Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp

[2] TCVN 11922 (ISO 17468) Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm - Yêu cầu và hướng dẫn kỹ thuật để xây dựng hoặc soát xét phương pháp chuẩn

[3] TCVN 11923 (ISO/TS 17728), Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm - Kỹ thuật lấy mẫu để phân tích vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi

[4] TCVN 8129 (ISO 18593) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp lấy mẫu bề mặt sử dụng đĩa tiếp xúc và lau bề mặt

[5] BENNOUR MILED R., GUILLIER L., NEVES S., AUGUSTIN J.-C., COLIN P., GNANOU BESSE N. Individual cell lag time distributions of Cronobacter (Enterobacter sakazakii) and impact of pooling samples on its detection in powdered infant formula. Food Microbiol. 2011, 28 pp. 648-655

[6] BENNOUR MILED R., NEVES S., BAUDOUIN N., LOMBARD B., DEPERROIS V., COLIN P., GNANOU BESSE N. Impact of pooling powdered infant formula samples on bacterial evolution and Cronobacter detection. Int. J. Food Microbiol. 2010,138 pp. 250-259

[7] FARMER JJ III. Enterobacteriaceae: introduction and identification. In: Manual of Clinical Microbiology, (Murray P.R., Barron E.J., Pfaller M.A., Tenover F.C., Yolken R.H., eds.). ASM Press Inc, Washington, DC, Seventh Edition, 1999, pp. 442-58

[8] IVERSEN C., LEHNER A., MULLANE N., MARUGG J., FANNING S., STEPHAN R., JOOSTEN H. The identification of Cronobacter spp. (Enterobacter sakazakii). J. Clin. Microbiol. 2007, 45 pp. 3814-3816

[9] IVERSEN C., MULLANE N., MCCARDELL B., TALL B.D., LEHNER A., FANNING S., STEPHAN R., JOOSTEN H. Cronobacter gen. nov., a new genus to accommodate the biogroups of Enterobacter sakazakii, and proposal of Cronobacter sakazakii gen. nov. comb, nov., C. malonaticus sp. nov., C. turicensis sp. nov., C. muytjensii sp. nov., C. dublinensis sp. nov., Cronobacter genomospecies 1, and of three subspecies, C. dublinensis sp. nov. subsp. dublinensis subsp. nov., C. dublinensis sp. nov. subsp. lausannensis subsp. nov., and C. dublinensis sp. nov. subsp. lactaridi subsp. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2008, 58 pp. 1442-1447

...

...

...

[11] JOSEPH S., CETINKAYA E., DRAHOVSKA H., LEVICAN A., FIGUERAS M.J., FORSYTHE S.J. Cronobacter condimenti sp. nov., isolated from spiced meat and Cronobacter universalis sp. nov., a novel species designation for Cronobacter sp. genomospecies, recovered from a leg infection, water, and food ingredients. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2012 June, 62 pp. 1277-1283

[12] STEPHAN R., GRIM C.J., GOPINATH G.R., MAMMEL M.K., SATHYAMOORTHY V., TRACH L.H., CHASE H.R., FANNING S., TALL B.D. Re-examination of the taxonomic status of Enterobacter helveticus, Enterobacter pulveris and Enterobacter turicensisas members of the genus Cronobacter and their reclassification in the genera Franconibacter gen. nov. and Siccibacter gen. nov. as Franconibacter helveticus comb, nov., Franconibacter pulveris comb. nov. and Siccibacter turicensis comb, nov., respectively. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2014, 64 pp. 3402-3410

[13] STEPHAN R., VAN TRAPPEN S., CLEENWERCK I., IVERSEN C., JOOSTEN H., DE VOS P., LEHNER A. Enterobacter pulverissp. nov. isolated from fruit powder, infant formula and infant formula production environment. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2008, 58 pp. 237-241

[14] STEPHAN R., VAN TRAPPEN S., CLEENWERCK I., VANCANNEYT M., DE VOS P., LEHNER A. Enterobacter turicensis sp. nov. and Enterobacter helveticus sp. nov. isolated from fruit powder. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2007, 57 pp. 820-826

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 7850:2018 (ISO 22964:2017) về Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm - Phát hiện cronobacter spp