5.2.1.2 Chuẩn bị

Hòa tan từng thành phần trong nước, bằng cách đun nóng, nếu cần. Chỉnh pH đến 7,0 ± 0,2 ở 25 ⁰C, nếu cần. Phân phối dung dịch BPW vào các bình cầu hoặc ống nghiệm theo nhu cầu phân tích. Khử trùng 15 min ở 121 ⁰C.

5.2.2 Canh thang tryptoza lauryl sulfat cải biến (mLST)/môi trường vancomyxin

5.2.2.1 Canh thang tryptoza lauryl sulfat cải biến (mLST)

5.2.2.1.1 Thành phần

Natri clorua (NaCl)

34,0 g

Dịch thủy phân mô động vật và thực vật bằng enzym

20,0 g

...

...

...

5,0 g

Kali dihydro phosphat (KH₂PO₄)

2,75 g

Dikali hydro phosphat (K₂HPO₄)

2,75 ml

Natri lauryl sulfat (C₁₂H₂₅NaO₅S)

0,1 g

Nước

1 000 ml

...

...

...

Hòa tan từng thành phần trong nước, bằng cách đun nóng, nếu cần.

Chỉnh pH đến 6,8 ± 0,2 ở 25 ⁰C, nếu cần. Phân phối 10 ml mLST vào các ống nghiệm có kích thước 18 mm x 160 mm.

Khử trùng các ống nghiệm 15 min ở 121 ⁰C.

5.2.2.2 Dung dịch vancomyxin

5.2.2.2.1 Thành phần

Vancomyxin

10 mg

Nước

10 ml

...

...

...

Hòa tan vancomyxin trong nước cất. Trộn và lọc để khử trùng.

Dung dịch vancomyxin có thể bền 15 ngày khi được bảo quản ở nhiệt độ từ 0 ⁰C đến 5 ⁰C

5.2.2.3 Môi trường vancomyxin/mLST

Cho 0,1 ml dung dịch vancomyxin (5.2.2.2.2) vào 10 ml dung dịch mLST (5.2.2.1.2) để thu được nồng độ vancomyxin cuối cùng là 10 mg trên mililit mLST.

Môi trường vancomyxin/mLST hoàn chỉnh có thể bền đến 1 ngày khi được bảo quản ở nhiệt độ tử 0 ⁰C đến 5 ⁰C.

5.2.3 Thạch phân lập Enterobacter sakazakii (ESIA^TM) [1]⁾

5.2.3.1 Thành phần

Pepton pancreatic của casein

7,0 g

...

...

...

3,0 g

Natri clorua (NaCl)

5,0 g

Natri desoxycholat

0,6 g

5-Bromo-4-cloro-3-indolyl a-D-glucopyranosit (C₁₄H₁₅BrClNO₆)

0,15 g

Tím tinh thể

2 mg

...

...

...

Từ 12,0 g đến 18,0 g^a

Nước

1 000 ml

^a Tùy thuộc vào sức đông của thạch

5.2.3.2 Chuẩn bị

Hòa tan từng thành phần trong nước bằng cách đun sôi. Chỉnh pH đến 7,0 ± 0,2 ở 25 ⁰C, nếu cần. Khử trùng 15 min ở 121 ⁰C.

Làm nguội đến nhiệt độ từ 44 ⁰C đến 47 ⁰C. Rót khoảng 15 ml môi trường ESIA^TM vào các đĩa Petri vô trùng và để cho đông đặc trên mặt phẳng nằm ngang, mát.

Môi trường này có thể bền đến 14 ngày khi bảo quản ở nhiệt độ từ 0 ⁰C đến 5 ⁰C.

5.2.4 Thạch đậu tương trypton (TSA)

...

...

...

Dịch thủy phân casein bằng enzym

15,0 g

Dịch thủy phân đậu tương bằng enzym

5,0 g

Natri clorua (NaCl)

5,0 g

Thạch

Từ 9,0 g đến 18,0 g^a

Nước

...

...

...

^a Tùy vào sức đông của thạch

5.2.4.2 Chuẩn bị

Hòa tan từng thành phần trong nước bằng cách đun sôi. Chỉnh pH đến 7,3 ± 0,2 ở 25 ⁰C, nếu cần. Khử trùng 15 min ở 121 ⁰C. Làm nguội đến nhiệt độ từ 44 ⁰C đến 47 ⁰C. Rót khoảng 15 ml môi trường TSA vào các đĩa Petri vô trùng và để cho đông đặc trên mặt phẳng nằm ngang, mát.

5.2.5 Môi trường và thuốc thử về đặc tính sinh hóa

5.2.5.1 Thuốc thử phát hiện oxidaza

5.2.5.1.1 Thành phần

N,N,N’,N’-Tetrametyl-p-phenylendiamin dihydro clorua (C₁₀H₁₆N₂.2HCl)

1,0 g

Nước

...

...

...

5.2.5.1.2 Chuẩn bị

Hòa tan thành phần trên trong nước ngay trước khi sử dụng.

5.2.5.2 Môi trường L-lysin tách nhóm carboxyl (decarboxylation)

5.2.5.2.1 Thành phần

L-lysin monohydroclorua (C₆H₁₄N₂O₂.HCl)

5,0 g

Dịch chiết nấm men

3,0 g

Glucoza (C₆H₁₂O₆)

...

...

...

Bromocresol tía

0,015 g

Nước

1 000 ml

5.2.5.2.2 Chuẩn bị

Hòa tan từng thành phần trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 6,8 ± 0,2 ở 25 ⁰C. Phân phối 5 ml môi trường L-lysin decacboxylation sang các ống nghiệm có kích thước 18 mm x 160 mm.

Khử trùng các ống nghiệm này 15 min ở nhiệt độ 121 ⁰C.

5.2.5.3 Môi trường L-Ornithin tách nhóm carboxyl (decarboxylation)

5.2.5.3.1 Thành phần

...

...

...

5,0 g

Dịch chiết nấm men

3,0 g

Glucoza (C₆H₁₂O₆)

1,0 g

Bromocresol tía

0,015 g

Nước

1 000 ml

...

...

...

Hòa tan từng thành phần trên trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 6,8 ± 0,2 ở 25 ⁰C.

Phân phối 5 ml môi trường L-ornithin decarboxylation sang các ống nghiệm có kích thước 18 mm x 160 mm. Khử trùng các ống đựng môi trường này 15 min ở nhiệt độ 121 ⁰C.

5.2.5.4 Môi trường L-Arginin cộng hai hydro (dihydrolation)

5.2.5.4.1 Thành phần

L-Arginin monohydroclorua (C₅H₁₄N₄O₂.HCl)

5,0 g

Dịch chiết nấm men

3,0 g

Glucoza (C₆H₁₂O₆)

...

...

...

Bromocresol tía

0,015 g

Nước

1 000 ml

5.2.5.4.2 Chuẩn bị

Hòa tan từng thành phần trên trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 6,8 ± 0,2 ở 25 ⁰C.

Phân phối 5 ml môi trường L-Arginin dihydrolation này sang các ống nghiệm có kích thước 18 mm x 160 mm. Khử trùng các ống đựng môi trường này 15 min ở nhiệt độ 121 ⁰C.

5.2.5.5 Môi trường để lên men hydrat cacbon (nước pepton có đỏ phenol, D-sorbitol, L-rhamnoza, D-sucroza, D-melibioza và amygdalin)

5.2.5.5.1 Môi trường cơ bản

...

...

...

Dịch thủy phân casein bằng enzym

10,0 g

Natri clorua (NaCl)

5 g

Đỏ phenol

0,02 g

Nước

 1 000 ml

5.2.5.5.1.2 Chuẩn bị

...

...

...

Phân phối môi trường cơ bản này sang các bình cầu có dung tích thích hợp. Khử trùng môi trường này 15 min ở nhiệt độ 121 ⁰C.

5.2.5.5.2 Dung dịch hydrat cacbon (D-sorbitol, L-rhamnoza, D-sucroza, D-melibioza và amygdalin), 80 mg/ml.

5.2.5.5.2.1 Thành phần

Hydrat cacbon

8 g

Nước

100 ml

5.2.5.5.2.2 Chuẩn bị

Hòa tan riêng rẽ bốn thành phần hydrat cacbon trong nước để thu được bốn dung dịch hydrat cacbon. Lọc để khử trùng.

...

...

...

5.2.5.5.3.1 Thành phần

Môi trường cơ bản (5.2.5.5.1)

875 ml

Dung dịch hydrat cacbon (5.2.5.5.2)

125 ml

5.2.5.5.3.2 Chuẩn bị

Đối với từng loại hydrat cacbon, thêm dung dịch hydrat cacbon đã chuẩn bị (5.2.5.5.2) vào môi trường cơ bản (5.2.5.5.1) một cách vô trùng và trộn. Phân phối 10 ml môi trường hoàn chỉnh của từng hydrat cacbon vào các ống nghiệm kích thước 18 mm x 160 mm.

5.2.5.6 Môi trường Simmons xitrat

5.2.5.6.1 Thành phần

...

...

...

2,0 g

Natri clorua (NaCl)

5,0 g

Dikali hydro phosphat (K₂HPO₄)

1,0 g

Amoni dihydro phosphat (NH₄H₂PO₄)

1,0 g

Magie sulfat (MgSO₄)

0,2 g

...

...

...

0,08

Thạch

Từ 8,0 đến 18,0 g^a

Nước

1 000 ml

^a Tùy thuộc vào sức đông của thạch

5.2.5.6.2 Chuẩn bị

Hòa tan từng thành phần trên hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun sôi. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 6,8 ± 0,2 ở 25 ⁰C.

Phân phối 10 ml môi trường Simmons xitrat này sang các ống nghiệm (6.7) có kích thước 18 mm x 160 mm. Khử trùng các ống đựng môi trường này 15 min ở nhiệt độ 121 ⁰C.

...

...

...

6. Thiết bị, dụng cụ thủy tinh

Có thể sử dụng dụng cụ thủy tinh một lần thay cho các dụng cụ sử dụng nhiều lần nếu có các qui định phù hợp.

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm vi sinh thông thường và cụ thể như sau:

6.1. Thiết bị khử trùng khô (tủ sấy) hoặc thiết bị khử trùng ướt (nồi hấp áp lực)

Xem TCVN 6404 (ISO 7218).

6.2. Pipet xả hết, dung tích danh định 1 ml.

6.3. Nồi cách thủy, có thể duy trì nhiệt độ ở 44 ⁰C ± 0,5 ⁰C.

6.4. Đĩa Petri, bằng thủy tinh hoặc chất dẻo, đường kính từ 90 mm đến 100 mm.

6.5. Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ ở 25 ⁰C ± 1 ⁰C, 30 ⁰C ± 1 ⁰C và 44 ⁰C ± 1 ⁰C tương ứng.

...

...

...

6.7. Ống nghiệm, đường kính 18 mm và dài 160 mm (có nút đậy hoặc nắp vặn).

6.8. Máy đo pH, có thể đo chính xác đến 0,1 đơn vị pH ở nhiệt độ 25 ⁰C ± 1 ⁰C.

7. Lấy mẫu

Điều quan trọng là mẫu gửi đến phòng thử nghiệm đúng là mẫu đại diện và không bị thay đổi hoặc suy giảm chất lượng trong quá trình bảo quản và vận chuyển.

Việc lấy mẫu không qui định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 6400 (ISO 707).

8. Chuẩn bị mẫu thử

Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 6263 (ISO 8261)

9. Cách tiến hành (xem sơ đồ trong Phụ lục A)

9.1 Phần mẫu thử

...

...

...

Để yên cho các mẫu khô tan trong dịch lỏng mà không thấy trộn. Nếu sau 30 min mà mẫu không tan hết thì trộn nhẹ nhàng mẫu với môi trường.

9.2. Tiền tăng sinh

Ủ mẫu đã cấy trong môi trường tiền tăng sinh (8.1) ở 37 ⁰C ± 1 ⁰C trong 18 h ± 2 h.

9.3. Tăng sinh chọn lọc

Sau khi ủ mẫu thử được cấy trong môi trường tiền tăng sinh, chuyển 0,1 ml dịch cấy thu được (9.2) vào 10 ml môi trường vancomyxin/mLST (5.2.2.3). Ủ ở 44 ⁰C ± 0,5 ⁰C trong 24 h ± 2 h.

Nên sử dụng nồi cách thủy (6.3) hoặc tủ ấm khí cưỡng bức để đảm bảo rằng nhiệt độ tối đa (44,5 ⁰C) không bị vượt quá.

9.4. Phân lập Enterobacter sakazakii giả định

Sau khi ủ môi trường vancomyxin/mLST đã cấy (9.3), ria cấy một vòng đầy (khoảng 10 ml) lên bề mặt đĩa thạch phân lập Enterobacter sakazakii (5.2.3.2). Ủ đĩa ở 44 ⁰C ± 1 ⁰C trong 24 h ± 2 h.

Sau khi ủ, kiểm tra đĩa thạch sinh màu về sự có mặt hay không có mặt các khuẩn lạc điển hình của Enterobacter sakazakii giả định.

...

...

...

9.5. Khẳng định

9.5.1 Sinh sắc tố vàng

9.5.1.1 Chọn khuẩn lạc

Chọn từ 1 khuẩn lạc đến 5 khuẩn lạc Enterobacter sakazakii giả định điển hình đã kiểm tra trên đĩa thạch sinh màu đã ủ (9.4).

9.5.1.2 Ủ

Cấy vạch các khuẩn lạc đã chọn (9.5.1.1) lên bề mặt đĩa thạch TSA (5.2.4.2) sao cho sau khi ủ quan sát được các khuẩn lạc tách biệt. Ủ đĩa này ở 25 ⁰C ± 1 ⁰C từ 44 h đến 48 h. Sau khi ủ, kiểm tra các đĩa TSA về sự có mặt các khuẩn lạc màu vàng.

Khi chỉ có một khuẩn lạc được chọn (9.5.1.1) và được chuyển sang đĩa thạch TSA và sau khi ủ không thấy có khuẩn lạc màu vàng, thì chọn thêm bốn khuẩn lạc điển hình (9.5.1.1) và tiến hành theo 9.5.1.2. Nếu có ít hơn năm khuẩn lạc điển hình thì chọn tất cả chúng.

CHÚ Ý – Một vài chủng đặc biệt của Enterobacter sakazakii có thể không sinh màu vàng trong các điều kiện thử nghiệm qui định trong tiêu chuẩn này, hoặc mất sắc tố do cấy truyền. Trong các trường hợp đó, khi sử dụng phương pháp này thì các chủng như thế có thể bị bỏ sót.

9.5.2 Khẳng định bằng sinh hóa

...

...

...

Có thể sử dụng các bộ kít thử nhỏ có bán sẵn trên thị trường để nhận dạng bằng sinh hóa để nhận dạng Enterobacter sakazakii.

9.5.2.2 Chọn các khuẩn lạc

Chọn một khuẩn lạc màu vàng từ mỗi đĩa thạch đậu tương trypton (9.5.1.2) để nhận dạng bằng sinh hóa theo 9.5.2.3 đến 9.5.2.8.

9.5.2.3 Phép thử oxidaza

Dùng kim cấy sử dụng một lần hoặc que cấy bằng thủy tinh, lấy một phần của mỗi khuẩn lạc đặc trưng đã chọn (9.5.2.2).

Ria cấy lên giấy lọc được ẩm bằng thuốc thử oxidaza (5.2.5.1) hoặc lên đĩa bán sẵn. Không sử dụng vòng cấy hoặc que cấy bằng niken/crom.

Nếu màu của giấy lọc không đổi sang màu tím hoa cà, màu tím hoặc màu xanh đậm trong 10 s thì phản ứng được coi là âm tính.

9.5.2.4 Phép thử decarboxylaza L-Lysin

Dùng vòng cấy, que cấy hoặc đũa thủy tinh lấy từng khuẩn lạc đã chọn (9.5.2.2) cấy vào ngay dưới bề mặt môi trường lỏng L-Lysin decarboxylation (5.2.5.2). Ủ các ống này ở 30 ⁰C ± 1 ⁰C từ 24 h ± 2 h.

...

...

...

9.5.2.5 Phép thử decarboxylaza L-Ornithin

Dùng vòng cấy, que cấy hoặc đũa thủy tinh lấy từng khuẩn lạc đã chọn (9.5.2.2) cấy vào ngay dưới bề mặt môi trường lỏng decarboxylaza L-Ornithin (5.2.5.3). Ủ các ống này ở 30 ⁰C ± 1 ⁰C từ 24 h ± 2 h.

Sau khi ủ có màu tím chứng tỏ dương tính. Màu vàng chứng tỏ âm tính.

9.5.2.6 Phép thử dihydrolaza L-Arginin

Dùng vòng cấy, que cấy hoặc đũa thủy tinh lấy từng khuẩn lạc đã chọn (9.5.2.2) cấy vào ngay dưới bề mặt môi trường lỏng dihydrolaza L-Arginin (5.2.5.4). Ủ các ống này ở 30 ⁰C ± 1 ⁰C từ 24 h ± 2 h.

Sau khi ủ có màu tím chứng tỏ phản ứng dương tính. Màu vàng chứng tỏ âm tính.

9.5.2.7 Phép thử lên men các loại đường khác nhau

Dùng vòng cấy, que cấy hoặc đũa thủy tinh lấy từng khuẩn lạc đã chọn (9.5.2.2) cấy vào ngay dưới bề mặt môi trường lỏng lên men hydrat cacbon (5.2.5.5.3). Ủ các ống này ở 30 ⁰C ± 1 ⁰C từ 24 h ± 2 h.

Sau khi ủ có màu tím chứng tỏ dương tính. Màu đỏ chứng tỏ âm tính.

...

...

...

Dùng vòng cấy, que cấy hoặc đũa thủy tinh lấy từng khuẩn lạc đã chọn (9.5.2.2) cấy lên bề mặt môi trường Simmons xitrat (5.2.5.6). Ủ các ống này ở 30 ⁰C ± 1 ⁰C từ 24 h ± 2 h.

Sau khi ủ môi trường chuyển sang màu xanh chứng tỏ phản ứng dương tính.

9.6. Diễn giải các kết quả của phép thử khẳng định

Diễn giải các kết quả theo Bảng 1.

Bảng 1 – Diễn giải các kết quả

Phép thử khẳng định

Phản ứng dương tính hoặc âm tính

Phần trăm chủng Enterobacter sakazakii cho phản ứng

Sinh màu vàng

...

...

...

> 99

Oxidaza

-

> 99

Decarboxylaza L-Lysin

-

> 99

Decarboxylaza L-Ornithin

+

...

...

...

Dihydrolaza L-Arginin

+

> 99

Axit sinh ra từ việc

- lên men D-sorbitol

-

± 95

...

...

...

+

> 99

- lên men D-sucroza

+

> 99

- lên men D-melibioza

+

> 99

- lên men amygdalin

...

...

...

> 99

- thủy phân xitrat

+

> 95

10. Chủng kiểm chứng

Để kiểm tra khả năng của môi trường tăng sinh và môi trường phân lập giúp cho việc phát triển của Enterobacter sakazakii, đưa chủng ở mức thấp của chủng cấy đối chứng Enterobacter sakazakii vừa mới phân lập, hoặc của chủng đối chứng từ trung tâm giữ dịch cấy được công nhận, cho vào các bình kiểm chứng đựng môi trường tiền tăng sinh (9.2). Tiến hành đối với các bình kiểm chứng như đã thực hiện đối với dịch cấy thử nghiệm để chứng minh rằng chủng kiểm chứng dương tính đã thu hồi được.

11. Biểu thị kết quả

Báo cáo có mặt hay không có mặt Enterobacter sakazakii giả định trong phần mẫu thử, theo diễn giải kết quả. Trong trường hợp này không khẳng định Enterobacter sakazakii giả định đã tìm thấy trên đĩa sinh màu.

Sau khi một hoặc nhiều Enterobacter sakazakii giả định thu được trong 9.4 được khẳng định bằng qui trình trong 9.5, ghi lại sự có mặt hay không có mặt Enterobacter sakazakii trong phần mẫu thử.

...

...

...

12. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi chi tiết thao tác không qui định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy lựa chọn, cùng với các chi tiết bất thường khác có thể ảnh hưởng tới kết quả.

e) các kết quả thử nghiệm thu được.

Phụ lục A

...

...

...

Sơ đồ của phương pháp

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] TCVN 6400 (ISO 707), Sữa và sản phẩm sữa – Hướng dẫn lấy mẫu.

[2] TCVN 6507 -1 (ISO 6887 – 1), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Chuẩn bị mẫu thử, dung dịch huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật. Phần 1: Các nguyên tắc chung để chuẩn bị huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân.

[3] ISO/TS 11133 – 1, Microbiology of food and animal feeding stuffs – Guidelines on preparation and production of culture media – Part 1: General guidelines on quality assurance for the preparation of culture media in the laboratory.

[4] GULLAUME-GENTIL, O., SONNARD, V., KANDHAI, M.C., MARUGG, J.D. and JOOSTEN, H. A Simple and Rapid Cultural Method for Detection of Enterobacter sakazakii in Environmental Samples Journal of food Protection, 68 (1), 2005, pp. 64-69.

[1] ESIA^TM là tên thương mại của sản phẩm do Phòng thử nghiệm AES, Rue Maryse Bastie, Ker Lann, F-35172 Bruz (FR) cung cấp. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn này và tổ chức ISO/IDF không ấn định phải sử dụng chúng. Có thể sử dụng các sản phẩm tương đương nếu cho các kết quả tương tự.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 7850:2008 (ISO/TS 22964 : 2006) về Sữa và sản phẩm sữa - Phát hiện Enterobacter sakazakii