5.3.1.2 Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần cơ bản trên hoặc môi trường cơ bản khô trong nước, đun đến sôi.

Chỉnh pH bằng dụng cụ đo pH (6.4) sao cho khi khử trùng pH là 7,2 ± 0,2 ở 25 ^oC, nếu cần.

Phân phối môi trường cơ bản vào các bình hoặc các chai có dung tích thích hợp (6.6).

Khử trùng môi trường trong nồi hấp áp lực (6.1) 15 min ở 121 ^oC.

5.3.2 Dung dịch ức chế

Không giữ các dung dịch ức chế quá 7 ngày ở nhiệt độ 5 ^oC ± 3 ^oC.

5.3.2.1 Dung dịch cephalothin

5.3.2.1.1 Thành phần

...

...

...

Nước

0,1 g

100 ml

5.3.2.1.2 Chuẩn bị

Hòa tan cephalothin trong nước rồi khử trùng bằng các lọc.

5.3.2.2 Dung dịch natri fusidat

5.3.2.2.1 Thành phần

Natri fusidat

Nước

...

...

...

100 ml

5.3.2.2.2 Chuẩn bị

Hòa tan natri fusidat trong nước rồi khử trùng bằng cách lọc.

5.3.2.3 Dung dịch cetrimide

5.3.2.3.1 Thành phần

Cetrimide^a

Nước

0,1 g

100 ml

...

...

...

5.3.2.3.2 Chuẩn bị

Hòa tan cetrimide  trong nước rồi khử trùng bằng cách lọc.

5.3.3 Môi trường hoàn chỉnh

5.3.3.1 Thành phần

Thể tích

ml

Nồng độ cuối cùng

μg/ml

...

...

...

Dung dịch cephalothin (5.3.2.1)

Dung dịch natri fusidat (5.3.2.2)

Dung dịch cetrimide (5.3.2.3)

100

5

1

1

-

50

...

...

...

10

5.3.3.2 Chuẩn bị

Cho đến các dung dịch chất ức chế vào môi trường cơ bản đã được làm nguội trong nồi cách thủy (6.3) đến 47 ^oC ± 2 ^oC và trộn cẩn thận.

5.3.4 Chuẩn bị các đĩa thạch CFC

Rót khoảng 15 ml môi trường hoàn chỉnh (5.3.3) vào các đĩa Petri vô trùng (6.8) và để cho đông lại.

Ngay trước khi sử dụng, làm khô các đĩa thạch theo TCVN 8128-1 (ISO/TS 11133-1).

Nếu được chuẩn bị trước thì các đĩa thạch chưa khô không được để quá 4 tuần ở nhiệt độ 5 ^oC ± 3 ^oC.

5.3.5 Thử hiệu năng

Xác định năng suất và tính chọn lọc theo TCVN 8128-1 (ISO/TS 11133-1). Thử hiệu năng của thạch CFC theo các phương pháp và tiêu chí nêu trong TCVN 8128-2 (ISO/TS 11133-2).

...

...

...

Ủ:                                 ở 25 ^oC ± 1 ^oC trong 44 h ±  4 h

Chủng:                          Pseudomonas fluorescens WDCM 001151) hoặc

                                    Pseudomonas fragi WDCM 00116¹⁾

Môi trường chuẩn:         Môi trường thạch của sản phẩm thủy phân casein đậu tương (TSA)

Phương pháp kiểm chứng: Định lượng

Tiêu chí:                        Hệ số năng suất P_R ≥ 0,5

5.3.5.2 Tính chọn lọc

Ủ:                                 ở 25 ^oC ± 1^oC trong 44 h ± 4 h

Chủng:                          Escherichia coli WDCM 00013¹⁾

...

...

...

Tiêu chí:                        Ức chế toàn bộ

5.4 Thuốc thử để phát hiện oxidase

5.4.1 Thành phần

N,N,N',N'-Tetrametyl-p-phenylenendiamin dihydroclorua

Nước

1,0 g

100 ml

5.4.2 Chuẩn bị

Hòa tan thuốc thử trong nước ngay trước khi sử dụng.

...

...

...

6 Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thí nghiệm vi sinh thông thường (xem TCVN 6404 (ISO 7218)) cụ thể như sau:

6.1 Thiết bị khử trùng khô (tủ sấy) hoặc thiết bị khử trùng ướt (nồi hấp áp lực).

6.2 Tủ ấm, có khả năng duy trì nhiệt độ 25 ^oC ± 1 ^oC.

6.3 Nồi cách thủy, có khả năng duy trì nhiệt độ 47 ^oC ± 2 ^oC.

6.4 Máy đo pH, có thể đo chính xác đến ± 0,05 đơn vị pH.

6.5 Que cấy, bằng hợp kim platin-iridi hoặc vòng cấy vô trùng sử dụng một lần.

6.6 Ống nghiệm, chai hoặc bình, có dung tích thích hợp.

6.7 Pipet xả hết, vô trùng, dung tích danh nghĩa 1 ml, được chia vạch 0,1 ml, phù hợp với yêu cầu loại A trong TCVN 7150 (ISO 835) ^[1] hoặc pipet tự động phù hợp với yêu cầu trong ISO 8655-2^[2] với các đầu tip vô trùng.

...

...

...

6.9 Que gạt, bằng thủy tinh hoặc bằng chất dẻo, ví dụ que bằng thủy tinh dài 200 mm và có đường kính khoảng 3,5 mm, một đầu được uốn vuông góc dài khoảng 30 mm và các đầu được làm nhẵn bằng nhiệt.

7 Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nếu chưa có tiêu chuẩn về phương pháp lấy mẫu thì các bên có liên quan cần thỏa thuận về phương pháp lấy mẫu.

Điều quan trọng là phòng thử nghiệm phải nhận được đúng mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc giảm chất lượng trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản [xem TCVN 6404 (ISO 7218)].

8 Chuẩn bị mẫu thử

Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 6507-1 (ISO 6887-1) và TCVN 6507-2 (ISO 6887-2) và/hoặc tiêu chuẩn cụ thể có liên quan. Nếu chưa có tiêu chuẩn cụ thể thì các bên có liên quan cần thỏa thuận về phương pháp chuẩn bị mẫu.

9 Cách tiến hành

9.1 Phẫn mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng

Chuẩn bị huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng theo TCVN 6507-2 (ISO 6887-2).

...

...

...

9.2.1 Sử dụng một đĩa cho mỗi độ pha loãng đối với ít nhất hai dung dịch pha loãng liên tiếp, phù hợp với TCVN 6404 (ISO 7218). Nếu chỉ thực hiện với một độ pha loãng thì sử dụng hai đĩa.

9.2.2 Lấy một đĩa thạch CFC (5.3.4). Dùng pipet (6.7) chuyển 0,1 ml huyền phù ban đầu sang đĩa thạch này.

Lấy một đĩa thạch CFC khác. Dùng pipet vô trùng khác chuyển vào đĩa 0,1 ml dung dịch pha loãng thập phân thứ nhất của huyền phù ban đầu.

Lặp lại các thao tác trên đối với các dung dịch pha loãng tiếp theo, dùng pipet vô trùng mới cho mỗi dung dịch pha loãng thập phân.

9.2.3 Dùng que gạt mẫu vô trùng (6.9) để dàn đều chất lỏng trên bề mặt đĩa thạch cho đến khô hẳn.

9.2.4 Lật ngược các đĩa đã chuẩn bị và ủ trong tủ ấm (6.2) ở nhiệt độ 25 ^oC ± 1 ^oC trong 44 h  ± 4 h.

9.3 Đếm và chọn các khuẩn lạc

Sau khi kết thúc thời gian ủ quy định, đếm số khuẩn lạc trên từng đĩa và giữ lại các địa chứa ít hơn 150 khuẩn lạc.

Từ mỗi đĩa được giữ lại để khẳng định (9.4), chọn ngẫu nhiên năm khuẩn lạc, bao gồm tất cả các dạng khuẩn lạc.

...

...

...

9.4.1 Phản ứng oxidase

Làm ẩm mảnh giấy lọc bằng thuốc thử oxidase (5.4.2). Dùng que cấy bằng hợp kim platin-iridi hoặc vòng cấy bằng chất dẻo (vòng cấy bằng niken-crom sẽ cho kết quả dương tính giả) (6.5) để lấy mẫu từ khuẩn lạc đã chọn cho lên giấy lọc đã được làm ẩm.

Nếu có mặt oxidase thì trong khoảng từ 5 s đến 10 s sẽ cho màu tím đến màu đỏ tía. Nếu sau 10 s mà màu sắc không đổi thì phép thử được coi là âm tính.

Khẳng định kết quả bằng các kiểm chứng dương tính và kiểm chứng âm tính. Ví dụ về các chủng kiểm chứng thích hợp là Pseudomonas aeruginosa WDCM 000252) (kiểm chứng dương tính), Escherichia coli WDCM 00013²⁾ (Kiểm chứng âm tính).

9.4.2 Diễn giải kết quả

Các khuẩn lạc cho phản ứng oxidase dương tính được coi là các khuẩn lạc Pseudomonas spp. giả định.

10 Biểu thị kết quả

Xem TCVN 6404 (ISO 7218).

11 Báo cáo thử nghiệm

...

...

...

a) mọi thông tin cần thiết về nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

c) kết quả thử nghiệm thu được;

d) mọi điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được coi là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] TCVN 7150:2007 (ISO 835:2007), Dụng cụ thí nghiệm bằng thủy tinh - Pipet chia độ

[2] ISO 8655-2, Piston-operated volumetric apparatus- part 2: Piston pipettes

[3] MEAD, G.C and ADAMS, B.W.A setective medium for the rapid isolation of Pseudomonas associated with poultry meat spoilage. Br. Poult. Sci, 18, 1977, pp. 661-670.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 7138:2013 (ISO 13720:2010) về Thịt và sản phẩm thịt - Định lượng Pseudomonas spp. giả định