9.4.13. Thực hiện chiết lần ba mà không cho thêm etanol, bằng cách lặp lại các thao tác như trong 9.4.5 đến hết 9.4.9. Chỉ dụng 15 ml dietyl ete (5.4) và 15 ml dầu nhẹ (5.5). Sử dụng dietyl ete để tráng thành của cổ bình chiết chất béo.

Nếu cần, nâng cao mặt lớp phân cách đến giữa cổ bình bằng cách nhẹ nhàng cho thêm nước theo thành bình (xem Hình 1) để có thể gạn hết dung môi càng nhiều càng tốt (xem Hình 2).

CHÚ THÍCH: Việc chiết lần ba có thể bỏ qua đối với các mẫu có hàm lượng chất béo nhỏ hơn 5% khối lượng (chất khô).

9.4.14. Loại bỏ các dung môi (kể cả etanol) càng hết càng tốt khỏi bình thu nhận chất béo bằng cách chưng cất nếu sử dụng bình đun sôi hoặc bình nón, hoặc bằng cách cho bay hơi nếu sử dụng cốc cỏ mỏ hoặc đĩa (xem 6.3). Tráng thành trong của cổ bình nón bằng một ít dung môi hỗn hợp (5.6) trước khi bắt đầu chưng cất.

9.4.15. Dun nóng bình thu nhận chất béo trong tủ sấy (6.4) được duy trì ở nhiệt độ 102^oC trong 1h, với bình đun sôi hoặc bình nón được đặt nghiêng để hơi dung môi thoát ra được. Lấy bình thu nhận chất béo ra khỏi tủ và kiểm tra ngay xem chất béo đã trong hay chưa. Nếu chất béo không trong, chứng tỏ trong chất béo có tạp chất và phải lặp lại toàn bộ quy trình. Nếu chất béo đã trong, bảo vệ bình thu nhận chất béo khỏi bụi và để nguội bình (tốt nhất là không để trong bình hút ẩm) đến nhiệt độ phòng cân (đối với bình thu nhận chất béo bằng thủy tinh tối thiểu 1h, đĩa kim loại tối thiểu 30 min).

Không lau bình thu nhận chất béo ngay trước lúc cân. Dùng kẹp (6.13) đặt bình thu nhận chất béo lên cân. Cân bình thu nhận chất béo chính xác đến 1,0 mg.

9.4.16. Tiếp tục đun nóng tiếp bình thu nhận chất béo trong 30 min trong tủ sấy (6.4) được duy trì ở nhiệt độ 102^oC, với bình đun sôi hoặc bình nón được đặt nghiêng để hơi dung môi thoát ra được. Để nguội và cân lại theo 9.4.15. Nếu cần, lặp lại các quy trình đun nóng và cân cho đến khi chênh lệch khối lượng của bình thu nhận chất béo giữa hai lần cân liên tiếp nhỏ hơn hoặc bằng 1,0 mg. Ghi khối lượng tối thiểu là khối lượng của bình thu nhận chất béo và của chất chiết được.

10. Tính và biểu thị kết quả

10.1. Tính kết quả

...

...

...

w_f =             (1)

Trong đó:

m₀ là khối lượng của phần mẫu thử (9.1), tính bằng gam (g);

m₁ là khối lượng của bình thu nhận chất béo và chất chiết, xác định được trong 9.4.16, tính bằng gam (g);

m₂ là khối lượng của bình thu nhận chất béo đã chuẩn bị (9.3), tính bằng gam (g);

m₃ là khối lượng của bình thu nhận chất béo sử dụng trong phép thử trắng (9.2) và chất chiết xác định được trong 9.4.16, tính bằng gam (g);

m₄ là khối lượng của bình thu nhận chất béo (9.3) được sử dụng trong phép thử trắng (9.2), tính bằng gam (g).

10.2. Biểu thị kết quả

Làm tròn kết quả đến hai chữ số thập phân.

...

...

...

11.1. Phép thử liên phòng thử nghiệm

Các chi tiết của phép thử liên phòng thử nghiệm theo ISO 5725:19861) (xem Tài liệu tham khảo [2]) về độ chụm của phương pháp nêu trong Tài liệu tham khảo [4].

Các giá trị về giới hạn độ lặp lại và độ tái lập được biểu thị ở mức xác suất 95 % và có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ và chất nền khác với các giá trị đã nêu.

11.2. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử độc lập, đơn lẻ, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp, trên vật liệu thử giống hệt nhau, trong cùng một phòng thử nghiệm, do cùng một người phân tích, sử dụng cùng một thiết bị, thực hiện trong một khoảng thời gian ngắn, không được quá 5 % các trường hợp lớn hơn phần khối lượng của chất béo sau đây:

- 0,05 % đối với các sản phẩm dạng lỏng;

- 0,1 % đối với các sản phẩm có hàm lượng chất béo nhỏ hơn hoặc bằng 5% khối lượng;

- 0,2 % đối với sản phẩm có hàm lượng chất béo lớn hơn 5% khối lượng.

11.3. Độ tái lập

...

...

...

- 0,1 % đối với các sản phẩm chất lỏng;

- 0,2 % đối với các sản phẩm có hàm lượng nhỏ hơn hoặc bằng 5 % khối lượng;

- 0,4 % đối với sản phẩm có hàm lượng chất béo lớn hơn 5 % khối lượng.

12. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải nêu rõ:

^-  mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

- phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

- phương pháp thử sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này;

- mọi thao tác chi tiết không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được coi là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả;

...

...

...

- kết quả thử nghiệm thu được hoặc nếu kiểm tra độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được.

PHỤ LỤC A

(Tham khảo)

CÁC LƯU Ý VỀ CÁCH TIẾN HÀNH

A.1. Phép thử trắng để kiểm tra thuốc thử (xem 9.2.2)

Trong phép thử trắng này, bình thu nhận chất béo dùng cho mục đích kiểm soát khối lượng được dùng sao cho các thay đổi về điều kiện môi trường của phòng cân hoặc ảnh hưởng nhiệt độ của bình thu nhận chất béo không làm, ảnh hưởng đến việc xem xét sự có mặt hay không có mặt của chất lỏng không bay hơi có trong phần chiết của thuốc thử. Bình thu nhận chất béo này có thể được dùng làm bình đối trọng trong trường hợp cân có hai đĩa cân. Mặt khác, chênh lệch khối lượng biểu kiến (m₃-m₄ trong công thức trong 10.1) của bình thu nhận chất béo dùng cho mục đích kiểm soát cần được xem xét khi kiểm tra khối lượng của bình thu nhận chất béo, được điều chỉnh theo sự thay đổi khối lượng biểu kiến của bình thu nhận chất béo dùng cho mục đích kiểm soát, khối lượng không được lớn hơn 1,0 mg.

Rất hiếm khi dung môi có chứa chất bay hơi bị giữ lại nhiều trong chất béo. Nếu thấy sự có mặt của các chất như thế, cần tiến hành phép thử trắng đối với tất cả các thuốc thử và từng dung môi thì sử dụng bình thu nhận chất béo với khoảng 1g butterfat khan. Nếu cần, chưng cất lại các dung môi với sự có mặt của 1 g butterfat khan trong 100 ml dung môi. Chỉ dùng các dung môi này trong khoảng thời gian ngắn sau khi chưng cất lại.

A.2. Tiến hành phép thử trắng đồng thời với phép xác định (xem 9.2.1)

...

...

...

Trong các điều kiện thích hợp (giá trị thấp trong phép thử trắng đối với thuốc thử, nhiệt độ cân bằng của phòng cân, thời gian để cho bình thu nhận chất béo đủ nguội), giá trị này thường nhỏ hơn 1,0 mg và sau này có thể được bỏ qua trong phần tính kết quả trong trường hợp xác định thông thường. Cũng thường gặp giá trị lớn hơn một chút lên đến 2,5 mg (dương và âm). Sau khi hiệu chỉnh các giá trị này thì kết quả sẽ đúng. Khi phải hiệu chỉnh giá trị lớn hơn 2,5 mg thì phải được đề cập trong Báo cáo thử nghiệm (Điều 12).

Nếu giá trị thu được trong phép thử trắng thường xuyên vượt quá 1,0 mg thì cần kiểm tra lại thuốc thử nếu ngay trước đó chưa kiểm tra. Thuốc thử có lẫn tạp chất hoặc có vết thì cần phải thay thế hoặc tinh sạch (xem 9.2.2 và A.1).

A.3. Phép thử đối với peroxit

Để thử peroxit, cho 1 ml dung dịch kali iodua 100g/l mới chuẩn bị vào 10 ml dietyl ete (5.4) đựng trong ống đong nhỏ bằng thủy tinh có nắp đậy, trước đó đã được tráng bằng ete. Lắc ống đong và sau đó để yên trong 1 min. Không được có màu vàng trong lớp dietyl ete.

Có thể sử dụng các phương pháp thử thích hợp khác để kiểm tra peroxit.

Để đảm bảo rằng dietyl ete không còn chứa peroxit, xử lý dietyl ete ít nhất là ba ngày trước khi sử dụng như sau:

Cắt lá kẽm thành những dải để chúng ít nhất chạm được đến nửa chai đựng dietyl ete, dùng khoảng 8000 mm² lá kẽm cho 1 lít dietyl ete.

Trước khi sử dụng, nhúng toàn bộ các dải lá kẽm này 1 min trong dung dịch chứa 10 g đồng (II) sulfat ngậm 5 phân tử nước (CuSO₄.5H₂O) và 2 ml axit sulfuric đậm đặc (98% khối lượng) trên một lít. Rửa kỹ các dải này nhẹ nhàng bằng nước, rồi đặt các dải đã mạ đồng còn ướt này vào trong chai đựng dietyl ete và để chúng trong chai.

Có thể dùng các phương pháp khác với điều kiện là không làm ảnh hưởng đến kết quả xác định.

...

...

...

Ở một số nơi các loại diety ete có bán sẵn, chứa khoảng 1 mg chất chống oxi hóa trên kilogam, đặc biệt dùng để xác định chất béo. Hàm lượng này không dùng cho mục đích đối chứng.

Cũng có loại dietyl ete bán sẵn có chứa hàm lượng chất chống oxi hóa cao hơn, ví như lên đến 7mg/kg. Những loại ete này chỉ nên sử dụng đối với những phép xác định thông thường và phải tiến hành phép thử trắng đồng thời với phép xác định, để hiệu chỉnh các sai số hệ thống do lượng dư của chất chống oxi hóa gây ra. Đối với mục đích đối chứng, các loại dietyl ete này luôn phải chưng cất trước khi sử dụng.

A.5. Etanol

Có thể sử dụng etanol đã biến tính không phải metanol với điều kiện là chất làm biến tính này không làm ảnh hưởng đến kết quả của việc xác định.

PHỤ LỤC B

(Tham khảo)

QUY TRÌNH THAY THẾ SỬ DỤNG ỐNG CHIẾT CHẤT BÉO CÓ XI PHÔNG HOẶC CÓ NỐI VỚI CHAI RỬA

B.1. Yêu cầu chung

...

...

...

B.2. Cách tiến hành

B.2.1. Chuẩn bị mẫu thử

Xem Điều 8.

B.2.2. Phần mẫu thử

Tiến hành theo quy định trong 9.1 nhưng sử dụng các ống chiết chất béo (xem chú thích trong 6.6 và Hình B.1).

Cần chuyển hết phần mẫu thử sang đáy của ống chiết chất béo.

B.2.3. Phép thử trắng

Xem 9.2 và A.2.

B.2.4. Chuẩn bị bình thu nhận chất béo

...

...

...

B.2.5. Xác định

B.2.5.1. Tiến hành ngay phép xác định.

Nếu cần, thêm nước đã được làm ấm trước đến nhiệt độ 65^oC ± 5^oC vào phần mẫu thử trong ống chiết chất béo (B.2.2) để thu được tổng thể tích từ 10 ml đến 11 ml. Dùng nước để tráng phần mẫu thử trên đáy của ống. Lắc nhẹ ống với nước hơi ấm trên nồi cách thủy (6.5), ở nhiệt độ từ 40^oC đến 60^oC cho đến khi phần mẫu thử tan hết.

B.2.5.2. Cho 2 ml dung dịch amoniac (5.1) hoặc một thể tích tương ứng của dung dịch amoniac đậm đặc hơn (xem chú thích trong 5.1) vào phần mẫu thử trong ống chiết chất béo (B.2.5.1). Trộn kỹ với phần mẫu thử đã xử lý trước ở đáy ống chiết chất béo.

B.2.5.3. Làm nóng ống chiết chất béo ở nhiệt độ 65^oC ± 5^oC trên nồi cách thủy (6.5) từ 15 min đến 20 min, thỉnh thoảng lắc ống (đối với sản phẩm dạng lỏng thì tùy chọn). Làm nguội dưới dòng nước chảy đến nhiệt độ phòng.

B.2.5.4. Thêm 10 ml etanol (5.2). Trộn kỹ một cách nhẹ nhàng hỗn hợp ở đáy ống chiết chất béo. Tốt nhất là thêm 2 giọt dung dịch đỏ Congo (5.3).

Kích thước tính bằng milimet

...

...

...

b) có gắn chai rửa

CHÚ DẪN

1 Dung tích 105 ml ± 5 ml khi tháo nút

2 Độ dày thành ống: 1,5 mm ± 0,5 mm

Hình B.1 - Các ví dụ về ống chiết chất béo

B.2.5.5. Cho thêm 25 ml dietyl ete (5.4). Đậy nắp ống chiết chất béo bằng nút bần đã bão hòa nước hoặc bằng nắp làm bằng chất liệu khác đã làm ướt bằng nước (6.6). Lắc mạnh ống, nhưng không quá mạnh để tránh tạo nhũ bằng cách đảo chiều trong khoảng 1 min. Nếu cần, làm mát ống dưới dòng nước chảy. Cẩn thận tháo bỏ nút hoặc nút bần, tráng nút và cổ ống bằng một ít hỗn hợp dung môi (5.6). Sử dụng chai rửa (6.8) sao cho nước rửa chảy vào ống.

B.2.5.6. Cho thêm 25 ml dầu nhẹ (5.5). Đậy ống chiết chất béo bằng nút bần hoặc nút khác đã thấm lại nước (bằng cách ngâm vào trong nước). Lắc nhẹ ống 30 s như trong B.2.5.5.

B.2.5.7. Cho li tâm chiết chất béo đã đậy nút từ 1 min đến 5 min ở gia tốc 80 g đến 90 g. Nếu không có sẵn máy li tâm (6.2) thì đặt ống chiết chất béo trên giá đỡ (6.7) ít nhất 30 min cho đến khi thấy rõ lớp nổi trên bề mặt và phân biệt rõ với lớp chất lỏng. Nếu cần, làm mát ống dưới dòng nước chảy đến nhiệt độ phòng.

B.2.5.8. Cẩn thận tháo bỏ nút hoặc nắp, tráng nút và cổ của ống chiết chất béo bằng một ít hỗn hợp dung môi (5.6). Sử dụng chai rửa (6.8) sao cho nước rửa chảy vào ống.

...

...

...

Cẩn thận chuyển lớp nổi bên trên ra khỏi ống chiết chất béo vào bình thu nhận chất béo (xem 9.3) có chứa một ít chất trợ sôi (6.10) trong trường hợp đối với bình đun sôi hoặc bình nón (còn đối với đĩa kim loại thì tùy chọn). Không được để lớp chất lỏng lẫn vào. Tráng phía ngoài khớp nối bằng một ít hỗn hợp dung môi, thu lấy nước tráng vào bình thu nhận chất béo.

CHÚ THÍCH: Lớp nổi phía trên có thể được chuyển ra khỏi ống chiết chất béo, ví dụ như bằng cách dùng bầu cao su được nối với một ống ngắn để tạo áp lực.

B.2.5.10. Tháo khớp nối ra khỏi cổ của ống chiết chất béo. Nâng nhẹ ống nối và tráng phần trong phía dưới của ống nối bằng một ít hỗn hợp dung môi (5.6). Hạ thấp, chèn  lại ống nối và chuyển nước rửa vào bình thu nhận chất béo.

Tráng rửa đầu ra của khớp nối bằng một ít hỗn hợp dung môi, cho nước rửa vào bình thu nhận chất béo. Tốt nhất là loại bỏ dung môi hoặc một phần dung môi ra khỏi bình thu nhận bằng cách chưng cất hoặc làm bay hơi như trong 9.4.14.

B.2.5.11. Tháo khớp nối ra khỏi cổ của ống chiết. Nâng nhẹ khớp nối và thêm 5 ml etanol vào lượng chứa trong ống chiết chất béo. Dùng etanol để tráng thành trong của khớp nối. Trộn đều như trong B.2.5.4.

B.2.5.12. Thực hiện chiết lần hai bằng cách lặp lại các thao tác như trong B.2.5.5 đến B.2.5.10. Thay 25 ml bằng cách chỉ sử dụng 15 ml dietyl ete (5.4) và 15 ml dầu nhẹ (5.5). Dùng dietyl ete để tráng thành trong của khớp nối trong suốt quá trình tháo khớp nối ra khỏi ống sau lần chiết lần trước.

B.2.5.13. Thực hiện chiết lần ba mà không thêm etanol, bằng cách lặp lại các thao tác như trong B.2.5.5 đến B.2.5.10. Chỉ sử dụng 15 ml dietyl ete và 15 ml dầu nhẹ. Sử dụng dietyl ete để tráng thành trong của khớp nối như trong B.2.5.12.

CHÚ THÍCH: Có thể bỏ qua lần chiết thứ ba đối với các sản phẩm chứa hàm lượng chất béo với khối lượng nhỏ hơn 5% tính theo chất khô.

B.2.5.14. Tiến hành tiếp theo quy định trong 9.4.14 đến 9.4.16.

...

...

...

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] TCVN 6400 (ISO 707), Sữa và sản phẩm sữa - Hướng dẫn lấy mẫu.

[2] ISO 5725:1986, Precision of test methods - Determination of repeatability and reproducibility for standard tests methods by inter - laboratory tests.

[3] TCVN 6688-1 (ISO 8262-1), Sản phẩm sữa và thực phẩm từ sữa - Xác định hàm lượng chất béo bằng phương pháp khối lượng Weibull-Bemtrop (phương pháp chuẩn) - Phần 1: Thực phẩm dành cho trẻ nhỏ.

[4] International Dairy, Federation, Interlaboratory Collaborative Studies, Second series, Bull. Int. Dairy Fed, 1988, (235).

1) ISO 5725:1986, Precision of test methods - Determination of repeatability and reproducibility for a standard test method by inter-laboratory test dùng để thu được dữ liệu về độ chụm. Tiêu chuẩn này đã hủy, được thay bằng bộ tiêu chuẩn ISO 5725 (gồm 6 phần) và đã được chấp nhận thành bộ TCVN 6910 (ISO 5725).

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 6687:2013 (ISO 8381:2008) về Thực phẩm từ sữa dành cho trẻ sơ sinh - Xác định hàm lượng chất béo - Phương pháp khối lượng (Phương pháp chuẩn)