5.3.2.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần.

Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,0 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần.

5.3.2.3  Sử dụng

Dung dịch đệm phosphat này được dùng để pha loãng gelatin (9.3).

5.4  Phân phối và khử trùng dịch pha loãng

Xem TCVN 6507-1 (ISO 6887-1).

5.5  Kiểm tra hiệu năng của dịch pha loãng

Xem TCVN 6507-1 (ISO 6887-1).

...

...

...

5.6.1  Dung dịch alpha-amylase

5.6.1.1  Thành phần

α-amylase

Nước

1,0 g

100 ml

5.6.1.2  Chuẩn bị

Hòa tan α-amylase trong nước và khử trùng dung dịch bằng cách lọc qua màng lọc 0,2 µm. Có thể bảo quản dung dịch enzym đến 1 tháng ở nhiệt độ 5 °C ± 3 °C hoặc đến 3 tháng ở nhiệt độ ≤ -20 °C.

Thành phần cuối cùng của dung dịch α-amylase có thể được điều chỉnh tùy thuộc vào hoạt tính enzym của α-amylase thương mại được sử dụng và mức độ đặc của mẫu thử.

...

...

...

Cho 10 ml dung dịch enzym vào 1000 ml dịch pha loãng (1 % phần thể tích) để tăng khả năng hòa tan của ngũ cốc, các sản phẩm có chứa ngũ cốc và các sản phẩm tinh bột đã trương nở (9.1.4.3).

5.6.2  Dung dịch cellulase

5.6.2.1  Thành phần

Cellulase

Nước

1,0 g

100 ml

5.6.2.2  Chuẩn bị

Hòa tan cellulase trong nước và khử trùng dung dịch bằng cách lọc qua màng lọc 0,2 µm. Có thể bảo quản dung dịch enzym đến 2 tuần ở nhiệt độ 5 °C ± 3 °C hoặc đến 1 tháng ở nhiệt độ ≤ -20 °C.

...

...

...

5.6.2.3  Sử dụng

Cho 10 ml dung dịch enzym vào 1000 ml dịch pha loãng (1 % phần thể tích) để tăng khả năng hòa tan của carboxymetyl cellulose, bột locust bean, bột carob, gôm guar và gôm cassia (9.1.4.3).

5.6.3  Dung dịch papain

5.6.3.1  Thành phần

Papain

Nước

5,0 g

100 ml

5.6.3.2  Chuẩn bị

...

...

...

CHÚ THÍCH: Sử dụng dung dịch mới sẽ đảm bảo hoạt tính enzym tối đa.

5.6.3.3  Sử dụng

Cho 20 ml dung dịch enzym vào 1 000 ml dịch pha loãng (2 % phần thể tích) để tăng khả năng hòa tan của gelatin (9.1.4.3 và 9.3).

6  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị của phòng thử nghiệm vi sinh thông thường [xem TCVN 6404 (ISO 7218) và TCVN 6507-1 (ISO 6887-1)] và cụ thể như sau:

6.1  Bộ đồng hóa

6.1.1  Bộ đồng hóa quay (bộ trộn)

Xem TCVN 6404 (ISO 7218). Nếu đồng hóa mẫu thử lớn thì nên dùng cốc vô trùng 1 L.

6.1.2  Bộ đồng hóa kiểu nhu động

...

...

...

6.2  Máy nghiền, vô trùng.

6.3  Búa hoặc vật nặng khác, có khả năng nghiền, đập vụn vật liệu cứng.

6.4  Nồi cách thủy, có thể duy trì được ở nhiệt độ từ 44 °C đến 47 °C hoặc được quy định cho các mục đích cụ thể.

6.5  Kéo, dao, dao mổ và kẹp vô trùng.

6.6  Dao trộn, thìa hoặc xẻng vô trùng.

6.7  Ống lấy mẫu vô trùng, để lấy mẫu sâu bên trong.

6.8  Dụng cụ khuấy, có thể chuyển động ngang.

6.9  Bình cầu cổ rộng hoặc vật chứa khác vô trùng, dung tích 500 ml.

6.10  Bể siêu âm, có tần số vận hành từ 35 MHz đến 45 MHz.

...

...

...

Tiến hành lấy mẫu theo tiêu chuẩn cụ thể phù hợp với sản phẩm có liên quan hoặc xem TCVN 11923 (ISO/TS 17728). Hướng dẫn lấy mẫu một số sản phẩm cụ thể được nêu trong Điều 9 để minh họa. Nếu không có sẵn tiêu chuẩn cụ thể thì các bên liên quan nên thỏa thuận về vấn đề này.

8  Chuẩn bị mẫu

8.1  Yêu cầu chung

Tất cả các thao tác phải được thực hiện sử dụng kỹ thuật vô trùng và thiết bị vô trùng [xem TCVN 6507-1 (ISO 6887-1)]. Các quy trình chuẩn bị mẫu chung được quy định trong TCVN 6507-1 (ISO 6887-1), nhưng chi tiết bổ sung đối với một số loại mẫu được đưa ra trong 8.2 đến 8.4.

8.2  Sản phẩm có tính axit

Điều quan trọng là phải tính đến việc sử dụng cuối cùng của sản phẩm khi thử nghiệm mẫu có tính axit.

Nếu sản phẩm được sử dụng làm một thành phần trong sản phẩm cuối cùng có độ pH cao hơn, thì pH của huyền phù ban đầu của phần mẫu thử phải được chỉnh đến pH 7,0 ±0,5 bằng các dịch pha loãng quy định tại 5.2.2. hoặc 5.3.1 hoặc dịch khác có khả năng đệm tương đương.

Để chỉnh pH của các mẫu có tính axit vừa phải (pH ≥ 3,5 + pH < 4,5), sử dụng dung dịch nước đệm pepton nồng độ kép (5.3.1). Xem TCVN 6507-1 (ISO 6887-1).

Nếu cần thử nghiệm các mẫu có tính axit cao (pH < 3,5) (ví dụ: trái cây và nước ép trái cây có pH thấp hoặc dấm và dưa chua) để xác định các vi sinh vật chịu axit và ưa axit thì sử dụng môi trường thích hợp, mà không chỉnh pH của các mẫu đó.

...

...

...

Sử dụng dịch pha loãng có chứa từ 1 g/L đến 10 g/L polysorbat 80 [polyoxyetylen (20) sorbitan monooleat] tính theo hàm lượng chất béo ước tính để tăng khả năng tạo nhũ tương trong quá trình tạo huyền phù (ví dụ: đối với hàm lượng chất béo 40 % thì thêm 4 g/L).

Các chất hoạt động bề mặt và các chất tạo nhũ tương thay thế có sẵn dưới nhiều tên thương mại khác nhau, nhưng tỷ lệ sử dụng chúng phải được phòng thử nghiệm xác định.

8.4  Sản phẩm cứng và sản phẩm khô

Thực hiện đồng hóa các sản phẩm cứng hoặc khô trong thiết bị đồng hóa quay (6.1.1) không quá 2.5 min mỗi lần để tránh quá nhiệt có thể làm ức chế các vi sinh vật có mặt trong mẫu.

Thực hiện đồng hóa các sản phẩm không đồng nhất khô và cứng bằng cách băm hoặc nghiền mẫu phòng thử nghiệm. Tránh quá nhiệt trong quá trình này bằng cách đồng hóa trong khoảng thời gian không quá 1 min mỗi lần, có khoảng thời gian nghỉ phù hợp, tùy thuộc vào sản phẩm được xử lý. Băm hoặc xay cho đến khi mẫu được cho là đồng nhất.

Nên để mẫu phục hồi ở nhiệt độ môi trường phòng thử nghiệm (18 °C đến 27 °C) trong thời gian đến 1 h để hỗ trợ phục hồi các sinh vật bị ức chế có trong các sản phẩm khô và cứng.

9  Quy trình cụ thể

9.1  Sản phẩm đã loại nước và các sản phẩm có độ ẩm thấp

9.1.1  Yêu cầu chung

...

...

...

- thịt và rau đã loại nước;

- súp khô, viên canh thang, hỗn hợp nước thịt dạng khô;

- đồ uống dạng bột (trà, ca cao và các sản phẩm từ ca cao, cà phê, bột nước trái cây);

- cellulose thô, cellulose hòa tan, dextrin, sorbitol, đường, glucose, glutamat;

- các loại thảo mộc, gia vị, hương liệu và chất tạo màu;

- chất tạo gel polysacarit, alginat, gôm, v.v...;

- dừa, các dịch chiết thực vật/nấm men/thịt/cá đã loại bỏ một phần nước;

- socola và bánh kẹo (dạng thanh hoặc kẹo);

- trứng nguyên quả đã loại nước và lòng trắng trứng khô;

...

...

...

- vi sinh vật sống dạng bột hoặc dạng viên (ví dụ: men đề làm bánh mì).

9.1.2  Dụng cụ

Nên sử dụng các túi của bộ đồng hóa kiểu nhu động (6.1.2) để hỗ trợ cho việc trộn các sản phẩm có chất không hòa tan trong huyền phù.

9.1.3  Chuẩn bị mẫu

Trộn kỹ các sản phẩm dạng bột trong vật chứa của chúng sử dụng dụng cụ vô trùng (6.6) và sau đó cân mẫu bằng các kỹ thuật vô trùng. Cân mẫu chính xác và cho mẫu vào một thể tích dịch pha loãng (5.2.2) đã phân phối trước, để giảm thiểu việc gây sốc cho vi sinh vật.

Các sản phẩm khác có thể cần làm vỡ hoặc cắt thành các miếng nhỏ bằng dụng cụ vô trùng trước khi lấy phần mẫu thử.

9.1.4  Chuẩn bị huyền phù ban đầu

9.1.4.1  Sản phẩm dạng bột, hòa tan hoàn toàn

Không cần phải đồng hóa các sản phẩm hòa tan hoàn toàn, chỉ cần trộn thủ công là đủ. Chuẩn bị huyền phù ban đầu theo TCVN 6507-1 (ISO 6887-1).

...

...

...

Chuẩn bị huyền phù ban đầu bằng thiết bị đồng hóa quay (6.1.1) hoặc kiểu nhu động (6.1.2).

9.1.4.3  Sản phẩm trương nở trong nước

Đối với tất cả các sản phẩm trương nở trong nước (ví dụ: các polysacarit và các chất tạo gel, rau mùi tây hoặc hành sấy khô), thì pha loãng thêm (1:20; 1:50 hoặc 1:100, thích hợp) cho đến khi thu được huyền phù phù hợp.

Ghi lại việc sử dụng dịch pha loãng bổ sung để đảm bảo tính chính xác của kết quả thử định lượng.

Nếu cần độ pha loãng cao hơn, thì số lượng các đĩa nuôi cấy cho các phép định lượng phải tăng lên để đảm bảo cho tối thiểu 0,1 g phần mẫu thử được phân chia ra cho tất cả các đĩa khi dự kiến số đếm vi sinh vật thấp.

Độ hòa tan của một số chất sẽ tăng bằng cách cho thêm một dung dịch enzym cụ thể vào huyền phù ban đầu trong dung dịch đệm pepton (5.2.2). Một số ví dụ về các enzym phù hợp như sau:

- alpha-amylase 1 % (phần thể tích) (5.6.1) đối với các sản phẩm tinh bột trương nở, ngũ cốc và các sản phẩm có chứa ngũ cốc;

- cellulase 1 % (phần thể tích) (5.6.2) đối với carboxymetyl cellulose, các chất chiết từ hạt gồm locust beans, carob, guar và cassia gum.

- papain 2 % (phần thể tích) (5.6.3) đối với gelatin.

...

...

...

Đối với các nguyên liệu thực phẩm có chứa các chất ức chế (ví dụ như bột hành, tỏi, oregano, ớt, một số loại trà và cà phê, hỗn hợp vitamin và các sản phẩm có độ mặn cao), cần phải giảm hoạt tính kháng khuẩn trước khi thử nghiệm bằng cách sử dụng các quy trình chuẩn bị đặc biệt như sau:

- sử dụng độ pha loãng lớn hơn (ví dụ: 1:100 đối với quế và oregano (kinh giới cay) và 1:1000 đối với đinh hương);

- bổ sung kali suifit (K2SO3) vào dung dịch đệm pepton (5.2.2) để đạt được nồng độ cuối cùng là 0,5 % (khối lượng/thể tích);

- để hỗ trợ hòa tan sử dung dịch pha loãng (5.2.2) ở 37 °C ± 1 °C và các độ pha loãng cao hơn (ví dụ 1:50) đối với các hỗn hợp vitamin;

- sử dụng độ pha loãng cao hơn đối với các sản phẩm chứa trên 10 % (phần khối lượng) muối (natri clorua) để đảm bảo tổng nồng độ muối trong huyền phù ban đầu (không bao gồm bất kỳ hàm lượng muối nào của dịch pha loãng hoặc canh thang tăng sinh) không vượt quá 1 % (khối lượng/thể tích).

Nếu sử dụng bất kỳ kỹ thuật nào trong số các kỹ thuật này thi ở lần sử dụng đầu tiên cần kiểm tra xác nhận hiệu quả của quá trình trung hòa được chọn, sử dụng các kiểm chứng quá trình bằng mẫu thêm chuẩn.

9.1.4.5  Ca cao và sản phẩm chứa ca cao

Sử dụng sữa UHT hoặc sữa bột khô không béo hoàn nguyên (100 g/l nước; tiệt trùng sau khi hoàn nguyên) để làm canh thang tăng sinh sơ bộ phát hiện đáng kể sinh vật gây bệnh Salmonella spp. và STEC (Escherichia coli sinh độc tố Shiga). BPW có thể được sử dụng làm dịch pha loãng chung cho các phép thử khác.

CHÚ THÍCH: Sữa được sử dụng để trung hòa các ảnh hưởng diệt khuẩn của ca cao hoặc các sản phẩm có chứa ca cao. Anthocyanin trong ca cao là tác nhân có khả năng ức chế ^{[9], [11], [13]}

...

...

...

Cân phần mẫu thử (ví dụ: 25 g) cho vào túi chất dẻo (6.1.2), thêm dịch pha loãng đã được làm ẩm (ví dụ: 225 ml) để thu được huyền phù ban đầu 1 trong 10 và trộn thủ công ngay.

Để huyền phù ở nhiệt độ môi trường phòng thử nghiệm (18 °C đến 27 °C) trong thời gian 20 min đến 30 min để mẫu thử tan chảy. Sau đó, dùng bộ trộn kiểu nhu động trộn kỹ trong 60 s ± 5 s.

Đối với bột ca cao và bất kỳ mẫu khác có thể bị nhiễm vi khuẩn gram dương ở mức cao do xử lý nhiệt chưa đủ, thì thêm 0,45 ml dung dịch brilliant green 1 % (khối lượng/thể tích) (1 g/100 ml nước) vào 250 ml huyền phù ban đầu có thể làm giảm sự ức chế các vi sinh vật gram âm đích có ở mức thấp trong quá trình tăng sinh sơ bộ không chọn lọc^[8],[12]. Quy trình này được sử dụng phụ thuộc vào loại mẫu và kinh nghiệm của phòng thử nghiệm với các mẫu đó.

Khi thực hiện thử các phần mẫu lớn socola rắn hoặc các vật liệu có chứa ca cao khác mà không thể bị phá vỡ dễ dàng, cần làm tan chảy socola ở nhiệt độ từ 42 °C đến 47 °C, không lâu hơn mức cần thiết, trước khi lẩy phần mẫu thử.

Đối với các sản phẩm socola chứa > 20 % chất béo, trừ khi các sản phẩm chứa đủ chất nhũ hóa, cho thêm một lượng đủ polysorbat 80 [polyoxyetylen (20) sorbitan monooleat] hoặc chất nhũ hóa khác vào dịch pha loãng [xem 8.3 và TCVN 6507-1 (ISO 6887-1)].

9.1.4.6  Bánh kẹo (dạng thanh hoặc dạng viên kẹo)

Làm nóng sơ bộ dịch pha loãng đến khoảng từ 37 °C đến 40 °C.

Cân phần mẫu thử trong túi bằng chất dẻo của bộ đồng hóa kiểu nhu động (6.1.2) và thêm dịch pha loãng đã được làm ẩm. Trộn ngay bằng tay để phân tán phần mẫu thử. Bánh hoặc kẹo rất cứng cần được đập vụn một phần bằng vật nặng như búa (6.3) để hỗ trợ cho việc phân tán.

Giữ huyền phù ở nhiệt độ môi trường phòng thử nghiệm (18 °C đến 27 °C) trong 20 min đến 30 min để hòa tan. Sau đó, dùng bộ trộn kiểu nhu động (6.1.2) để đồng hóa mẫu.

...

...

...

Thông thường, giữ huyền phù ban đầu của các sản phẩm có độ ẩm thấp cần hồi phục trong thời gian lên đến 1 h ở nhiệt độ môi trường phòng thử nghiệm (18 °C đến 27 °C) trước khi cho thêm bất kỳ dịch pha loãng. Một số trường hợp cụ thể được nêu chi tiết trong tiêu chuẩn có liên quan.

9.1.6  Hoạt độ nước

Bảng 1 đưa ra các ví dụ về loại thực phẩm và dải hoạt độ nước điển hình để hướng dẫn sử dụng các phương pháp thử quy định các quy trình khác nhau tùy thuộc vào hoạt độ nước [ví dụ: TCVN 8275-1 (ISO 21527-1) và TCVN 8275-2 (ISO 21527-2)].

Bảng 1 - Hoạt độ nước của các sản phẩm khác nhau (được lấy từ Tài liệu tham khảo [10]

Hoạt độ nước^[5]

a_w

Ví dụ về sản phẩm

≥ 0,95

Thực phẩm rất dễ hỏng, quả tươi và đóng hộp, rau, thịt cá, sữa, xúc xích chế biến, bánh mì

...

...

...

Phomat (ví dụ: Cheddar, phomat Thụy Sĩ, muenster, provolone), thịt ướp muối, một số nước ép trái cây cô đặc, thực phẩm chứa 55 % sucrose (phần khối lượng) hoặc 12 % muối (phần khối lượng).

≥ 0,87

Xúc xích lên men, bánh xốp, pho mát khô, bơ thực vật, thực phẩm chứa 65 % sucrose (khối lượng) hoặc 15 % muối (phần khối lượng)

≥ 0,80

Đa số các loại nước ép trái cây cô đặc, sữa đặc có đường, xi-rô và trái cây, bột, gạo, đậu (độ ẩm từ 15 % đến 17 % phần khối lượng), bánh trái cây, giăm bông, kẹo mềm, bánh ngọt có hàm lượng đường cao

≥ 0,75

Mứt, kẹo dạng mứt, bánh hạnh nhân (marzipan), trái cây ngâm đường, một số kẹo dẻo

≥ 0,65

Yến mạch cán (độ ẩm = 10 % phần khối lượng), thạch, kẹo mềm, mật đường, một số loại trái cây khô, các loại hạt

...

...

...

Trái cây sấy khô (độ ẩm từ 15 % đến 20 % phần khối lượng), kẹo bơ cứng, caramen, mật ong, thanh bánh ngũ cốc, gôm cho vật nuôi, sản phẩm dạng hạt, ngũ cốc, các sản phẩm ngũ cốc và hạt ngũ cốc

≥ 0,50

Mì (độ ẩm 12 % phần khối lượng), gia vị (độ ẩm 10 % khối lượng)

≥ 0,40

Kẹo nuga, bột trứng nguyên chất (độ ẩm 5 % khối lượng), socola

≥ 0,30

Bánh quy, bánh quy giòn, bột sốt khô

≥ 0,03

Bột sữa nguyên chất, cà phê hòa tan, bột súp khô

...

...

...

Trộn đều bột khô trong vật chứa mẫu, dùng dụng cụ vô trùng (6.6), trước khi cân phần mẫu thử.

Cân chính xác phần mẫu thử và cho vào một lượng cần thiết dung dịch muối pepton (5.2.1) để giảm thiểu việc gây sốc thẩm thấu cho hệ vi sinh vật. Đây là huyền phù ban đầu ở độ pha loãng 1 trong 10.

Đối với các loại bột, lấy một lượng cần thiết dịch pha loãng và thêm phần mẫu thử vào. Trộn kỹ bằng tay và sau đó cho nốt phần còn lại của dịch pha loãng vào để thu được dung dịch pha loãng 1 trong 10.

Trước khi thực hiện đồng hóa, giữ yên từ 20 min đến 30 min ở nhiệt độ môi trường phòng thử nghiệm (18 °C đến 27 °C) để hỗ trợ cho các sinh vật bị tổn thương hồi phục.

Nếu huyền phù trở nên quá đặc hoặc quá dính để trộn đều hoặc để hút thì thêm tiếp một lượng tương tự dung dịch muối pepton để tạo huyền phù ban đầu có độ pha loãng 1:20 và ghi lại điều này để đảm bảo tính chính xác của các kết quả thử định lượng.

Tiến hành trộn trong 60 s ± 5 s, dùng bộ trộn kiểu nhu động (6.1.2) đối với các loại bột hoặc dùng bộ đồng hóa quay (6.1.1) đối với các loại hạt ngũ cốc hoặc thức ăn chăn nuôi.

Sử dụng 50 g phần mẫu thử là cần thiết khi thử hạt ngũ cốc và các sản phẩm không đồng nhất khác để làm tăng độ tin cậy của các kết quả thử. Trong trường hợp này, sử dụng huyền phù độ pha loãng 1 trong 5, thực hiện đồng hóa và sau đó tạo tiếp độ pha loãng 1 trong 2 để thu được huyền phù có độ pha loãng ban đầu là 1 trong 10.

CHÚ THÍCH: Các vật liệu cứng (vi dụ: các ngũ cốc và các hạt) có thể làm thủng túi bằng chất dẻo (6.1.2); nên sử dụng túi có hai hoặc ba lớp để ngăn ngừa các vật liệu lọt ra ngoài và ô nhiễm sau đó. Các phần mẫu thử cũng có thể cần được nghiền sơ bộ bằng vật nặng như búa (6.3) trước khi đồng hóa.

Thức ăn chăn nuôi được đưa đến để thử nghiệm ở các dạng khác nhau, tuy nhiên các quy tắc chung cho các sản phẩm ngũ cốc nêu trên áp dụng được cho nhiều loại sản phẩm.

...

...

...

9.3  Gelatin (dạng bột và dạng tấm)

9.3.1  Chuẩn bị mẫu

Lấy 20 g phần mẫu thử phòng thử nghiệm bằng các kỹ thuật vô trùng.

9.3.2  Chuẩn bị huyền phù ban đầu

Chuyển phần mẫu thử vào bình cầu vô trùng 500 ml (6.9). Thêm 180 ml dịch pha loãng đệm phosphat (5.3.2) và trộn để phân tán các hạt vào trong chất lỏng.

Để gelatin hấp phụ dịch pha loãng trong 60 min ở nhiệt độ môi trường phòng thử nghiệm (18 °C đến 27 °C).

Đặt bình vào nồi cách thủy (6.4) ở 44 °C đến 47 °C tối đa 30 min; trộn thường xuyên để hòa tan gelatin để thu được huyền phù ban đầu 1 trong 10.

Cách khác, papain có thể được sử dụng để hòa tan gelatin (xem 9.1.4.3).

9.4  Bơ thực vật và bơ mềm hỗn hợp (spread)

...

...

...

9.4.1.1  Yêu cầu chung

Các mẫu có thể được lấy từ bên trong khối sản phẩm hoặc từ bên trong và/hoặc từ trên bề mặt của các gói sản phẩm đóng gói để bán, luôn phải sử dụng các kỹ thuật vô trùng.

9.4.1.2  Sản phẩm để rời hoặc được đóng gói ≥ 1 kg

Để xác định chất lượng vi sinh của sản phẩm để rời, kiểm tra các mẫu lấy ở bên trong khối sản phẩm. Đầu tiên, loại bỏ một lát ngoài cùng có độ dày 3 mm đến 5 mm bằng thìa (6.6) hoặc dao (6.5) đã tiệt trùng, cắm ống lấy mẫu bằng kim loại vô trùng (6.7) vào sản phẩm theo đường chéo mà không xuyên thủng khối sản phẩm. Xoay ống đủ một vòng tròn, sau đó rút ống ra để lấy được mẫu lõi hình trụ.

Sử dụng thìa (6.6) hoặc dao (6.5) chuyển một phần mẫu lõi này vào một hộp đựng hoặc túi bằng chất dẻo vô trùng (6.1.2.), trừ lại 25 mm mẫu phía trên để cắm bịt lại vào lỗ do ống lấy mẫu tạo ra.

Lấy một hoặc nhiều mẫu lõi để có được đủ mẫu phòng thử nghiệm.

CHÚ THÍCH: Cho phép sử dụng phương pháp lấy mẫu khác (như lấy một khối lượng ít nhất 500 g) nếu sản phẩm được coi là đồng nhất.

9.4.1.3  Sản phẩm được đóng gói sẵn ≤ 1 kg

Mẫu phòng thử nghiệm phải được tạo thành từ một hoặc nhiều sản phẩm được đóng gói sẵn, còn nguyên trong bao bì.

...

...

...

Nếu khách hàng chỉ yêu cầu thử nghiệm bề mặt sản phẩm, thì lấy mẫu thử bằng cách cạo đủ vật liệu từ bề mặt sản phẩm bằng dụng cụ vô trùng.

9.4.2  Chuẩn bị mẫu thử

9.4.2.1  Yêu cầu chung

Từ mẫu phòng thử nghiệm, cân lấy 50 g mẫu thử, có chứa tỷ lệ thể tích trên khối lượng nước (W, %) cho vào bình cầu hoặc bình chứa khác (6.9) vô trùng.

9.4.2.2  Chuẩn bị pha nước (dung dịch pha loãng ban đầu)

Làm ấm sơ bộ một thể tích [50 - (50 x W/100)] ml dịch pha loãng (5.2) trong nồi cách thủy (6.4) ở 44 °C đến 47 °C và cho vào mẫu thử đựng trong vật chứa. Trong những trường hợp này, 1 ml pha nước này tương đương với 1 g bơ thực vật hoặc bơ mềm hỗn hợp trong mẫu thử [xem TCVN 6507-1 (ISO 6887-1)].

VÍ DỤ: Đối với 50 g mẫu thử bơ thực vật với hàm lượng chất béo 84 % và do đó tỷ lệ thể tích trên khối lượng khoảng 16 %, pha nước tương ứng với 8 ml nước. Thêm [50 - (50 x 16/100)] = 42 ml dịch pha loãng. Lượng dịch pha loãng này cũng có thể tính được bằng cách lấy khối lượng mẫu là 50 g và nhân với hàm lượng chất béo là 84 % (tức là 50 x 84/100 = 42 ml).

Đặt vật chứa vào nồi cách thủy (6.4) ở nhiệt độ 44 °C đến 47 °C cho đến khi sản phẩm tan chảy hoàn toàn. Thời gian thực hiện không quá 20 min.

Trộn trong bộ trộn kiểu nhu động (6.1.2) trong 60 s ± 5 s và sau đó trộn thêm 30 s cho đến khi tạo nhũ tương. Giữ bình chứa ở nhiệt độ môi trường trong phòng thử nghiệm (18 °C đến 27 °C) để lớp chất béo (phía trên) và lớp nước (phía dưới) được tách hoàn toàn.

...

...

...

9.4.2.3  Chuẩn bị huyền phù để tăng sinh hoặc tăng sinh sơ bộ

Xem tiêu chuẩn liên quan đến các vi sinh vật cần được phát hiện hoặc cần được định lượng.

Nếu phương pháp yêu cầu phải tăng sinh hoặc tăng sinh sơ bộ thì mẫu có thể là toàn bộ phần sản phẩm chứ không phải chỉ là lớp nước (9.4.2.2), nhưng điều này phải được ghi lại.

9.5  Trứng và các sản phẩm trứng

9.5.1  Trứng tươi nguyên quả

9.5.1.1  Yêu cầu chung

Trứng được kiểm tra vi sinh vật thông thường không được có vết nứt ở vỏ có thể nhìn thấy được.

Trứng có thể được kiểm tra riêng lẻ hoặc theo lô tùy thuộc vào mục đích thử nghiệm. Trường hợp do khách hàng chỉ định, thì tiến hành gộp tất cả lòng trắng và lòng đỏ của một số quả theo TCVN 6507-1 (ISO 6887-1).

Việc kiểm tra trứng nguyên quả có thể được thực hiện bằng hai cách có làm sạch hoặc không làm sạch/khử trùng vỏ trứng tùy theo yêu cầu của khách hàng. Nếu chỉ để kiểm tra ruột quả trứng, luôn luôn phải khử trùng vỏ trước khi tách vỏ. Để phát hiện vi sinh vật gây bệnh (cũng có thể tìm thấy ở bên ngoài vò trứng), có thể không cần phải khử trùng vỏ, nhưng phải đạt được thỏa thuận giữa các bên về quy trình áp dụng.

...

...

...

Dùng một miếng vải ẩm lau sạch bụi bẩn hoặc phân và thấm khô vỏ trứng.

Đeo găng tay vô trùng và sử dụng gạc sạch hoặc khăn lau nhúng vào dung dịch etanol 70 % (thể tích) hoặc isopropanol vào nước, lau toàn bộ bề mặt vỏ trứng. Điều này làm giảm nguy cơ ô nhiễm lòng đỏ trứng và lòng trắng (albumen) khi trứng bị vỡ được tách vỏ để lẩy lòng trứng.

Để trứng khô hoàn toàn mà không làm vỏ trứng bị nhiễm bẩn trước khi tách vỏ để lấy phần mẫu thử.

9.5.2  Hệ vi sinh vật của trứng nguyên vỏ

9.5.2.1  Phương pháp rửa trứng nguyên vỏ

Đặt trứng nguyên vỏ vào túi của bộ đồng hóa kiểu nhu động (6.1.2) hoặc vật chứa vô trùng khác và thêm một lượng đã biết dịch pha loãng hoặc môi trường nuôi cấy yêu cầu trong phương pháp thử. Sau đó, xoa nhẹ hoặc xoay trứng cẩn thận trong dịch lỏng. Lấy trứng ra và sử dụng dịch lỏng làm huyền phù ban đầu để tiếp tục phương pháp thử.

9.5.2.2  Phương pháp cọ xát

Sử dụng gạc vô trùng (hoặc vải/giấy tương đương khác) ngâm trong dịch pha loãng hoặc môi trường nuôi cấy cần thiết. Dùng kẹp vô trùng kẹp giữ miếng gạc và chà lên toàn bộ vỏ trứng.

Cho các miếng gạc vào một thể tích dịch pha loãng hoặc môi trường nuôi cấy theo yêu cầu của phương pháp thử.

...

...

...

Tách vỏ trứng một cách vô trùng và thu lấy lòng đỏ và lòng trắng trứng vào bát hoặc cốc.

Giữ lại vỏ trứng và cho vỏ trứng vào túi của bộ đồng hóa kiểu nhu động (6.1.2) cùng với một lượng cần thiết dịch pha loãng hoặc môi trường nuôi cấy.

Xoa nhẹ và nghiền vỏ trứng trong túi bằng tay và sử dụng dung dịch này làm huyền phù ban đầu.

9.5.3  Hệ vi sinh vật bên trong quả trứng

Sử dụng găng tay vô trùng mới cho mỗi quả trứng, tách vỏ trứng một cách vô trùng, cho lòng trứng vào vật chứa vô trùng. Nếu cần kiểm tra riêng lòng đỏ và lòng trắng thì tách riêng lòng trắng ra khỏi lòng đỏ và cho mỗi loại vào một vật chứa vô trùng khác nhau.

Thêm dung dịch muối pepton (5.2.1) để có độ pha loãng 1 trong 10 đối với lòng đỏ và độ pha loãng 1 trong 40 đối với lòng trắng để khắc phục sự ức chế bởi lysozym có tự nhiên.

Để kiểm tra toàn bộ lòng trứng, cho tất cả lòng đỏ và lòng trắng (khoảng 20 ml) vào vật chứa vô trùng với 180 ml dung dịch dung dịch đệm pepton (5.2.2) hoặc trong dịch pha loãng hoặc canh thang tăng sinh thích hợp theo yêu cầu của tiêu chuẩn cụ thể và sử dụng dung dịch này làm huyền phù ban đầu có độ pha loãng 1 trong 10.

9.5.4  Toàn bộ lòng trứng, lòng trắng trứng và lòng đỏ trứng dạng lỏng để rời

Các sản phẩm này có thể được thanh trùng hoặc không thanh trùng.

...

...

...

Đối với lòng trắng trứng để rời, sử dụng huyền phù pha loãng tỷ lệ 1:40 bằng dung dịch đệm pepton (5.2.2) để khắc phục sự ức chế bởi lysozym sẵn có tự nhiên.

9.5.5  Trứng nguyên quả khô và lòng trắng trứng dạng khô

Xử lý như các sản phẩm đã loại nước (xem 9.1).

9.5.6  Hệ vi sinh vật của toàn bộ quả trứng (vỏ trứng cộng với lòng đỏ và lòng trắng)

Sử dụng các kỹ thuật vô trùng, tách vỏ trứng và cho vỏ trứng và lòng trứng vào túi bằng chất dẻo vô trùng (6.1.2) hoặc vật chứa khác.

Dùng tay nghiền và lắc hỗn hợp để đồng nhất.

Lấy phần mẫu thử cần thiết để tạo huyền phù ban đầu.

9.6  Các loại bánh mỳ, bánh ngọt và các loại bánh

9.6.1  Yêu cầu chung

...

...

...

Phần mẫu thử của các sản phẩm tương đối đồng nhất, như bánh mì, bánh cuộn và các thành phẩm khác được làm từ bột thông thường, cần thực hiện phù hợp với mục đích thử nghiệm. Ví dụ, các mẫu bề mặt bảnh có thể được yêu cầu để kiểm tra hư hại do nấm mốc.

9.6.2  Chuẩn bị mẫu

Đối với các sản phẩm nấu chín sơ bộ bao gói sẵn, mở bao gỏi bằng kỹ thuật vô trùng.

Từ mỗi thành phần lấy ra các miếng theo tỷ lệ với số lượng của chúng trong toàn bộ sản phẩm.

Cách khác, thực hiện đồng hóa toàn bộ mẫu phòng thử nghiệm để phản ánh hệ vi sinh vật của toàn bộ sản phẩm và lấy một phần mẫu thử đại diện.

Xử lý bánh quy nhỏ hoặc bánh ngọt theo cách tương tự như xử lý các sản phẩm đã loại nước nếu chúng có trạng thái cứng và độ ẩm thấp (9.1).

9.7  Rau và quả tươi (đóng gói sẵn)

9.7.1  Chuẩn bị mẫu đối với các sản phẩm có nhiều thành phần

Đối với các sản phẩm có nhiều thành phần (những sản phẩm có chứa các phần rau hoặc quả khác nhau), từ mỗi thành phần lấy ra các phần tương ứng với lượng có trong toàn bộ sản phẩm để tạo thành mẫu thử.

...

...

...

Pha loãng phần mẫu thử theo tỷ lệ 1:10 bằng dung dịch đệm pepton (5.2.2).

Đồng hóa mẫu bằng bộ trộn kiểu nhu động (6.1.2) cho đến khi thu được huyền phù ban đầu thích hợp.

9.7.2  Sản phẩm đóng gói sẵn của một loại rau hoặc quả

Cân phần mẫu thử và pha loãng ở tỷ lệ 1:10 bằng dung dịch đệm pepton (5.2.2).

Đồng hóa mẫu bằng bộ trộn kiểu nhu động (6.1.2) cho đến khi thu được huyền phù ban đầu thích hợp.

9.8  Sản phẩm lên men hoặc các sản phẩm khác có chứa vi sinh vật sống

9.8.1  Yêu cầu chung

Các sản phẩm này được kiểm tra về sự nhiễm vi sinh vật mà các vi sinh vật này khác với các vi sinh vật được sử dụng làm chủng khởi động để lên men hoặc làm thành phần hệ vi sinh vật hoạt động của các sản phẩm chế phẩm sinh học (probiotic).

Để kiểm tra các sản phẩm này về việc nhiễm vi sinh vật, sử dụng các chất ức chế phù hợp để ngăn chặn sự phát triển của chúng khởi động hoặc các vi sinh vật probiotic.

...

...

...

Sử dụng nước đệm pepton (5.2.2) thông thường hoặc nước đệm pepton nồng độ kép (5.3.1) nếu mẫu có tính axit cao (pH < 4,5).

Trong trường hợp các dịch nuôi cấy nấm men hoặc dịch lên men, thì thêm chất kháng nấm (ví dụ: cycloheximid hoặc nystatin ở nồng độ 50 mg/kg hoặc amphotericin ở nồng độ 10 mg/kg) vào môi trường đếm để giảm sự phát triển mạnh của nấm men và nấm mốc không mong muốn.

Đối với các sản phẩm khác, sử dụng kháng sinh chống lại hệ vi sinh vật của sản phẩm được kiểm tra [xem TCVN 9633 (ISO 27205) về các chế phẩm sinh học)^[6].

Ghi lại việc sử dụng và nồng độ của kháng sinh và bổ sung các chi tiết này vào báo cáo thử nghiệm.

9.9  Đồ uống (đồ uống có cồn và không cồn, nước đóng chai, có ga hoặc không có ga)

9.9.1  Yêu cầu chung

Để phát hiện sự nhiễm bẩn của các sản phẩm này, lọc một lượng quy định qua màng lọc vô trùng 0,45 µm [xem TCVN 9716 (ISO 8199)].

Đối với đồ uống có ga, cần khử khí sơ bộ để đảm bảo lượng chính xác được lọc hoặc được hút.

9.9.2  Loại khí bằng cách đảo chiều vật chứa và trộn

...

...

...

9.9.3  Loại khí bằng siêu âm

Có thể sử dụng phương pháp siêu âm để loại khí đồ uống có ga.

Đảo ngược vật chứa mẫu (chuyển động theo hình vòng cung 25 cm năm lần) để trộn và gạn một cách vô trùng lấy 10 % lượng mẫu cho vào một vật chứa vô trùng.

Nới lỏng nắp vật chứa và đặt chứa vào bể siêu âm (6.10) trong 120 s ± 5 s. Kiểm tra xem có khí ga còn lại không, lặp lại việc siêu âm, nếu cần. Không lặp lại quy trình này quá hai lần để giảm thiểu ảnh hưởng tiềm tàng đến các vi sinh vật có trong mẫu.

Lấy chính xác phần mẫu thử bằng cách hút hoặc lọc. Sử dụng kỹ thuật vô trùng trong mọi thao tác.

9.10  Các sản phẩm thay thế protein (côn trùng nấu chín, protein thực vật có kết cấu hoặc mycoprotein)

9.10.1  Yêu cầu chung

Nhiều sản phẩm trong số các sản phẩm này có thể được xử lý sử dụng các quy trình chuẩn bị chung nêu trong TCVN 6507-1 (ISO 6887-1). Một số chi tiết bổ sung được nêu trong 9.10.2 và 9.10.3 đối với các sản phẩm cụ thể.

9.10.2  Côn trùng nấu chín

...

...

...

Đồng hóa trong bộ trộn kiểu nhu động cho đến khi thu được huyền phù ban đầu thích hợp.

Một số côn trùng có lớp vỏ (biểu bì) kitin, ví dụ như châu chấu, có thể làm thủng túi, vì vậy nên sử dụng túi hai hoặc ba lớp để ngăn ngừa túi thủng và mẫu lọt ra ngoài. Các phần mẫu thử cũng có thể cần được nghiền sơ bộ bằng vật nặng như búa (6.3) trước khi thực hiện đồng hóa.

9.10.3  Protein thực vật có cấu trúc và mycoprotein

Cân phần mẫu thử cho vào túi bằng chất dẻo (6.1.2) và pha loãng ở tỷ lệ 1:10 bằng dung dịch đệm pepton (5.2.2).

Đồng hóa trong bộ trộn kiểu nhu động cho đến khi thu được huyền phù ban đầu thích hợp.

Nên sử dụng túi bằng chất dẻo có bộ lọc (6.1.2) để giảm phần hạt.

10  Dung dịch pha loãng tiếp theo

Chuẩn bị các dung dịch pha loãng tiếp theo, theo TCVN 6507-1 (ISO 6887-1).

...

...

...

[1 ] TCVN 9716 (ISO 8199) Chất lượng nước - Hướng dẫn chung về đếm vi sinh vật bằng nuôi cấy

[2] TCVN 8128 (ISO 11133) Vi sinh vật trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và nước - Chuẩn bị, sản xuất, bảo quản và thử hiệu năng của môi trường nuôi cấy

[3] TCVN 8275-1 (ISO 21527-1) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp định lượng nấm men và nấm mốc - Phần 1: Kỹ thuật đếm khuẩn lạc trong các sản phẩm có hoạt độ nước lớn hơn 0,95

[4] TCVN 8275-2 (ISO 21527-2) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp định lượng nấm men và nấm mốc – Phần 2: Kỹ thuật đếm khuẩn lạc trong các sản phẩm có hoạt độ nước nhỏ hơn hoặc bằng 0,95

[5] TCVN 8130 (ISO 21807) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi-Xác định hoạt độ nước

[6] TCVN 9633 (ISO 27205) Sản phẩm sữa lên men - Giống vi khuẩn khởi dộng - Tiêu chuẩn nhận dạng

[7] TCVN 11923 (ISO/TS 17728) Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm - Kỹ thuật lấy mẫu để phân tích vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi

[8] ANDREWS W.H., JACOBSEN A. and HAMMACK T. Chapter 5 Salmonella. In: US Food and Drug Administration Bacteriological Analytical Manual. 2014. Available at: http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070149.htm

[9] BAYLIS C.L., MACPHEE S., ROBINSON A.J., GRIFFITHS R., LILLEY K. and BETTS R.P. Survival of Escherichia coli O157:H7, O111:H and O26:H11 in artificially contaminated chocolate and confectionery products. Int. J. Food Microbiol. 2004, 96 pp. 35-48

...

...

...

[11] BUSTA F.F. and SPECK M.L. Antimicrobial effect of cocoa on Salmonellae. Appl. Microbiol. 1968, 16 (2) pp. 424-425

[12] JACOBS W.F., OOSTRA-VAN DIJK S., VAN OVERBEEK W., BOLEIJ P. and VAN DER VOET H. Expert Lab Report on the ISO 16140:2003 Validation of Nestec Laboratory Instruction LI-oo.713-5 for the detection of Salmonella. MicroVal project 2007LR06, Rikilt report 2009.502. 2009. Available at: http://www.microval.orq/resources/MV2007-LR06.pdf

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 6507-4:2019 (ISO 6887-4:2017) về Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm - Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật - Phần 4: Các nguyên tắc cụ thể để chuẩn bị các mẫu sản phẩm hỗn hợp