Các nghiên cứu cộng tác khác tiến hành phân tích trên hai mẫu gồm 13 phòng thử nghiệm tham gia để kiểm tra xác nhận phương pháp chiết tryptophan tự do. Mỗi mẫu thực hiện năm phép phân tích lặp lại. Các kết quả được nêu trong Bảng A.2.

Bảng A.2

Mẫu 4

Hỗn hợp lúa mì và đậu tương

Mẫu 5

Hỗn hợp lúa mì và đậu tương (= mẫu 4) có bổ sung tryptophan (0,457 g/kg)

Số lượng phòng thử nghiệm gửi kết quả

12

...

...

...

Số lượng kết quả thử nghiệm từ các phòng thử nghiệm còn lại

55

60

Giá trị trung bình,  , g/kg

0,391

0,931

Độ lệch chuẩn lặp lại, s_r, g/kg

0,005

0,012

...

...

...

1,34

1,34

Giới hạn lặp lại, r (= 2,8 s_r), g/kg

0,014

0,034

Độ lệch chuẩn tái lập, s_R, g/kg

0,018

0,048

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, %

...

...

...

5,11

Giới hạn tái lập, R (= 2,8 s_R), g/kg

0,05

0,134

Các phép thử liên phòng thử nghiệm khác tiến hành phân tích trên bốn mẫu gồm 7 phòng thử nghiệm tham gia để kiểm tra xác nhận phương pháp thủy phân tryptophan. Các kết quả được nêu trong Bảng A.3. Mỗi mẫu thực hiện năm phép phân tích lặp lại.

Bảng A.3

Mẫu 1

Thức ăn hỗn hợp cho lợn (CRM 117)

...

...

...

Bột cá có hàm lượng chất béo thấp (CRM 118)

Mẫu 3

Bột đậu tương (CRM 119)

Mẫu 4

Bột sữa gầy (CRM 120)

Số lượng phòng thử nghiệm gửi kết quả

7

7

7

...

...

...

Số lượng kết quả thử nghiệm từ các phòng thử nghiệm còn lại

25

30

30

30

Giá trị trung bình,  , g/kg

2,064

8,801

6,882

...

...

...

Độ lệch chuẩn lặp lại, s_r, g/kg

0,021

0,101

0,089

0,040

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, %

1,04

1,15

1,30

...

...

...

Giới hạn lặp lại, r (= 2,8 s_r), g/kg

0,059

0,283

0,249

0,112

Độ lệch chuẩn tái lập, s_R, g/kg

0,031

0,413

0,283

...

...

...

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, %

1,48

4,69

4,11

4,22

Giới hạn tái lập, R (= 2,8 s_R), g/kg

0,087

1,156

0,792

...

...

...

Phụ lục B

(Tham khảo)

Các lưu ý về phương pháp

B.1  Các điều kiện sắc ký cụ thể sau đây có thể giúp cho việc tách tryptophan và α-metyl tryptophan tốt hơn.

Việc rửa giải được thực hiện sau khi làm sạch cột gradient:

Cột sắc ký lỏng: Cột C₁₈, kích thước 125 mm x 4 mm, cỡ hạt 5 µm hoặc tương đương

Nhiệt độ cột: 32 °C

Pha động: A: 0,001 mol/l KH₂PO₄/metanol, 95 + 5 (phần thể tích)

...

...

...

Chương trình gradient:

0 min

100% A

0 % B

15 min

100 % A

0 % B

...

...

...

60 % A

40 % B

19 min

60 % A

40 % B

21 min

100 % A

...

...

...

33 min

100% A

0 % B

Tốc độ dòng:

1,2 ml/min

Tổng thời gian chạy:

Khoảng 33 min

B.2  Việc chạy sắc ký sẽ thay đổi tùy theo loại HPLC và vật liệu nhồi cột được sử dụng. Hệ thống được chọn phải có khả năng tách đường nền của tryotophan và chất nội chuẩn. Tuy nhiên, điều quan trọng là các sản phẩm phân hủy được tách ra khỏi tryptophan và chất nội chuẩn. Dịch thủy phân không chứa chất nội chuẩn phải được chạy sắc ký để kiểm tra đường nền về tạp chất của chất nội chuẩn. Điều quan trọng là thời gian chạy đủ dài để rửa giải tất cả các sản phẩm phân hủy, ngoài ra các pic rửa giải chậm có thể cản trở việc chạy sắc ký sau đó.

...

...

...

B.3  Nếu để quá lâu, bari hydroxit trở nên khó hòa tan. Điều này dẫn đến dung dịch không trong đối với phép xác định HPLC và cho kết quả thấp đối với tryptophan.

Phụ lục C

(Tham khảo)

Chuẩn bị mẫu thử: Ví dụ về phép phân tích các tryptophan tinh khiết và premix

Bảng C.1

Tryptophan tự do dự kiến,

%

Khối lượng mẫu,

...

...

...

Pha loãng

Dung dịch nội chuẩn đặc (3.16),

ml

Hệ số pha loãng

d

Nồng độ tryptophan tự do dự kiến trong dung dịch,

g/l

2 - 10

5,00 g

...

...

...

2

50

từ 0,002 0 đến 0,010 0

10 - 20

2,50 g

2 ml thành 100 ml

2

50

từ 0,005 0 đến 0,010 0

...

...

...

1,25 g

2 ml thành 100 ml

2

50

từ 0,005 0 đến 0,010 0

40 - 60

0,80 g

2 ml thành 100 ml

2

...

...

...

từ 0,006 4 đến 0,009 6

60 - 80

0,60 g

2 ml thành 100 ml

2

50

từ 0,007 2 đến 0,009 6

80 - 100

0,50 g

...

...

...

2

50

từ 0,008 0 đến 0,010 0

Phụ lục D

(Tham khảo)

Các kết quả phép thử liên phòng thử nghiệm đối với tryptophan trong các tryptophan tinh khiết và premix có chứa trên 2 % tryptophan

Năm 2011, một so sánh liên phòng thử nghiệm đã được tiến hành để đánh giá các đặc tính hiệu năng phương pháp của phương pháp phân tích xác định tryptophan tự do trong các tryptophan tinh khiết và premix có trên 2 % tryptophan thương mại.

Trong tổng số, mười sáu mẫu tương ứng có tám cặp mẫu mù đã được gửi đến mười tám phòng thử nghiệm.

...

...

...

Hàm lượng tryptophan thu được trong các vật liệu thử trong dải từ 1,26 g/100 g đến 49,99 g/100 g đối với các hỗn hợp premix và từ 90,30 g/100 g đến 99,78 g/100 g đối với các tryptophan tinh khiết thương mại. Các giá trị đo được phù hợp với các giá trị dự kiến được đưa ra bởi nhà sản xuất premix, ngoại trừ giá trị thấp nhất (giá trị dự kiến sai đối với mẫu premix 1).

Bảng D.1

Premix 1 (Tryptophan tự do 2,5 %)

Premix 2 (Tryptophan tự do 10,0 %)

Premix 3 (Tryptophan tự do 15,0%)

Premix 4 (Tryptophan tự do 50,0%)

Tryptophan tinh khiết 1 (Tryptophan tự do 90,0%)

Tryptophan tinh khiết 2 (Tryptophan tự do 94,0%)

...

...

...

Tryptophan tinh khiết 4 (Tryptophan tự do 98,0%)

Số lượng phòng thử nghiệm sau khi trừ ngoại lệ, p

12

11

12

11

12

11

12

...

...

...

Giá trị trung bình X, g/100 g

1,26

9,94

19,33

49,99

90,30

93,84

95,77

99,78

...

...

...

0,07

0,14

0,42

0,46

0,63

0,71

0,86

0,51

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, CV_r, (s_r/X%)

...

...

...

1,38%

2,18 %

0,93 %

0,69 %

0,76 %

0,90 %

0,51 %

Giới hạn lặp lại, r

0,19

...

...

...

1,18

1,30

1,75

1,99

2,42

1,42

Độ lệch chuẩn tái lập, s_R, g/100 g

0,12

0,30

...

...

...

1,05

1,18

1,13

1,29

0,96

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, CV_R (s_R/X%)

9,50 %

3,04 %

3,31 %

...

...

...

1,30%

1,20%

1,34%

0,96 %

Giới hạn tái lập R, g/100 g

0,34

0,85

1,79

2,95

...

...

...

3,16

3,60

2,67

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] Commission Directive 2000/45/EC of 6 July 2000, establishing Community methods of analysis for the determination of vitamin A, vitamin E and tryptophan in feedingstuffs

[2] Interlaboratory comparisons report from BIPEA: RCIL n° 2011-2012- 0334: Precision test “Determination of free tryptophan in premixes and pure products”

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 5293:2018 (ISO 13904:2016) về Thức ăn chăn nuôi - Xác định hàm lượng tryptophan