Animal feeding stuffs

Method for determination of lisin content

1. Nguyên tắc của phương pháp

Cắt liên kết peptit của protein bằng axit clohydric 6mol/l và tách lizin trên cột sắc ký trao đổi ion của máy phân tích axit amin. Phức tạo thành trong phản ứng với thuốc thử ninhydrin có cường độ mầu tỷ lệ thuận với hàm lượng axit amin có trong dung dịch.

2. Lấy mẫu

Lấy mẫu theo TCVN 4325 - 86

3. Dụng cụ và hoá chất

3.1. Dụng cụ

- Máy phân tích axit amin;

...

...

...

- Máy cắt mẫu thực vật;

- Rây với đường kính lỗ 1mm theo TCVN 2230 -77;

- Nồi hấp;

- Tủ sấy tự ngắt có nhiệt độ 110 ± 2⁰C;

- Cân phân tích có độ chính xác đến 0,0002 g;

- Thiết bị làm bay hơi dịch thủy phân hay nồi chưng cách thủy;

- Bộ địng lượng dung tích 10ml;

- Máy đo pH;

- Ampun thủy tinh có chỗ thắt, dung tích 20ml;

...

...

...

- Bình định mức dung tích 50; 100; 1000ml;

- Pipet chia độ, dung tích 1,2; 5; 10ml;

- Phễu thủy tinh đường kính 2 - 3cm;

- Bát sứ để làm bay hơi;

- Đũa thủy tinh;

- Giấy lọc không tro, băng xanh đường kính 6 – 8 cm;.

3.2. Hoá chất

- Bộ thuốc thử dùng cho máy phân tích axit amin;

- Axit amin chuẩn (mono clorua lizin);

...

...

...

- Cồn etylic;

- Natri xitrat, TKHH hay TKPT;

- Phenol, TKPT;

- Natri hydroxit, TKHH;

- Nước cất hay nước có độ tinh khiết tương đương.

4. Chuẩn bị thử

4.1. Chuẩn bị mẫu để thử

Mẫu cỏ khô, thức ăn ủ, thức ăn xanh được cắt thành từng đoạn dài 1 – 3 cm. Thức ăn củ quả được cắt thành lát mỏng có độ dày 0,8cm. Đảo đều mẫu đã cắt trên mảnh nilon và từ những chỗ khác nhau lấy một lượng mẫu để sao cho sau khi sấy có được khoảng 100 g. Sấy mẫu trong tủ sấy ở nhiệt độ 60 - 65⁰C đến khối lượng không đổi (trạng thái khô không khí). Nghiền mẫu và sàng qua rây có đường kính lỗ rây 1mm. Phần còn lại không lọt qua lỗ rây được cắt bằng kéo hay nghiền lại trong cối sứ, sau đó đem trộn đều với phần đã lọt qua rây.

Mẫu thức ăn hỗn hợp, thức ăn hạt, khô dầu, bột từ thân lá cây xanh được nghiền nhỏ không cần sấy khô trước và sau đó sàng qua rây.

...

...

...

4.2. Chuẩn bị dung dịch và thuốc thử

4.2.1. Chuẩn bị dung dịch đệm với pH = 2,2:

Hoà tan 19,6g natri xitrat trong 200 - 300 ml nước cất, thêm vào đó 16,6 ml axit clohydric đặc, 1 g phenol và đưa thể tích đến 1000 ml bằng nước cất. Nồng độ ion hydro được kiểm tra trên máy đo pH và khi cần thiết, điều chỉnh pH bằng dung dịch natri hydroxit 50% hay bằng axit clohydric đặc.

4.2.2. Chuẩn bị dung dịch axit clohydric 6mol/l.

Trộn những thể tích bằng nhau của axit clohydric đặc với nước (1:1) trong ống đong hay bình định mức.

4.2.3. Chuẩn bị dung dịch chuẩn lizin.

Cân 156 mg monoclorua lizin với độ chính xác đến 0,0002g hoà tan vào 50ml axit clohydric 0,1 mol/l (3,1ml axit clohydric đặc hoà vào 100ml nước cất). 1ml dung dịch này chứa 2,5 mg lizin tinh khiết.

5.1. Thủy phân mẫu thử

5.1.1. Thủy phân trong tủ sấy

...

...

...

5.1.2. Thủy phân trong nồi hấp

Cân 100 mg mẫu với độ chính xác đến 0,0002 g, cẩn thận đổ vào đáy ống nghiệm có dung tích 20 ml, thêm vào 2 - 3 giọt cồn êtylic và bằng bộ định lượng đổ vào đó 10 ml dung dịch axít clohyđric 6 mol /l. Đậy ống nghiệm bằng nút thủy tinh hay phễu nhỏ để tránh sự bắn toé axít trong quá trình thủy phân. Đặt ống nghiệm vào nồi hấp và tiến hành thủy phân 3 giờ ở nhiệt độ 137⁰C và áp suất 25 .10⁴ Pa.

5.2. Sau khi kết thúc thủy phân, ống nghiệm (hay ampun) được làm lạnh đến nhiệt độ phòng, lắc đều và lọc qua giấy lọc không tro. Phần nước lọc được cho vào bát sứ, tráng ống nghiệm 2 - 3 lần bằng một lượng nước cất không nhiều và rửa phễu lọc bằng chính lượng nước tráng này. Đặt bát sứ vào thiết bị làm bay hơi hay trên nồi chưng cách thủy có nhiệt độ 50 - 60⁰C và làm bay hơi dịch lọc đến trạng thái còn hơi ẩm .

Rót vào phần cặn còn hơi ẩm trong bát sứ 5 – 10 ml dung dịch đệm có pH bằng 2,2, dùng đũa thủy tinh khuấy cẩn thận đến tan hoàn toàn. Lọc dung dịch một lần nữa. Dịch thủy phân được bảo quản trong tủ lạnh.

5.3. Tiến hành phân tích trên máy.

Nhỏ dịch thủy phân của mẫu thử vào cột sắc ký của máy phân tích axit amin. Để xây dựng sắc ký độ chuẩn cần nhỏ lên cột dung dịch chuẩn lizin với thể tích đúng bằng thể tích dịch thủy phân đã nạp lên cột. Việc phân tích được thực hiện theo chương trình ngắn với việc sử dụng dung dịch đệm để tách các axit amin cơ bản và tuân theo quy trình trên máy phân tích axit amin.

Kết quả nhận được các sắc ký đồ với các píc có diện tích tỷ lệ thuận với nồng độ axit amin. Diện tích píc (S) được tính như diện tích hình tam giác - chiều cao của píc x 1/2 chiều rộng. Việc tính hàm lượng của lizin dựa vào kết quả so sánh diện tích píc của dung dịch chuẩn lizin với diện tích píc của mẫu thử.

6. Tính toán kết quả

6.1. Hàm lượng lizin (X₁) biểu thị bằng gam trên 1 kg mẫu thử ở dạng khô không khí được tính theo công thức :

...

...

...

Trong đó : C - Nồng độ lizin trong dung dịch chuẩn, tính bằng mg/ml;

S_tp - Diện tích píc lizin của mẫu phân tích, tính bằng mm²;

V - Thể tích cuối cùng của dịch thủy phân, tính bằng ml;

S_tc - Diện tích píc lizin của dung dịch chuẩn, tính bằng mm²;

m - Khối lượng mẫu thử, tính bằng mg.

Kết quả cuối cùng là trị số trung bình của hai lần xác định song song. Sự sai khác cho phép giữa hai lần xác định song song này ở xác suất tin cậy P = 0,95 không được vượt quá 10% giá trị trung bình.

6.2. Hàm lượng lizin (X₂) biểu thị bằng g/kg vật chất khô của mẫu thử được tính theo công thức :

Trong đó : X₁ - Hàm lượng lizin trong mẫu thử ở dạng khô không khí , tính bằng g/kg;

...

...

...

Ban hành theo Quyết định số 738/QĐ ngày 31 tháng 12 năm 1990 của Uỷ ban Khoa học Nhà nước

Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5281:1990 về thức ăn chăn nuôi - Phương pháp xác định hàm lượng lizin