Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần. Chỉnh pH sao cho sau khi thanh trùng đạt 7,0 ở 25⁰C, nếu cần.

Phân phối môi trường vào các ống nghiệm (6.8), mỗi ống 15 ml hoặc bình hoặc chai (6.8) có dung tích không quá 500 ml với một lượng khoảng một nửa dung tích của bình chứa.

Thanh trùng trong nồi hấp áp lực 121 ⁰C trong 15 phút. Nếu môi trường được sử dụng ngay thì làm nguội trong nồi cách thủy (6.5) ở 45⁰C trước khi sử dụng.

Nếu không dùng ngay thì trước khi xét nghiệm vi sinh vật, để tránh sự chậm trễ khi rót môi trường vào đĩa cần làm tan chảy hoàn toàn môi trường trong nồi cách thủy đang sôi, sau đó làm nguội trong nồi cách thủy (6.5) ở nhiệt độ 45⁰C.

5.4. Môi trường thạch nước (nếu cần - xem 9.2.3)

Thành phần

Thạch

12 g đến 18 g ²⁾

...

...

...

1 000 ml

Chuẩn bị

Hòa tan thạch trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần. Chỉnh pH sao cho sau khi thanh trùng đạt 7,0 ở 25⁰C, nếu cần.

Phân phối môi trường vào các ống nghiệm (6.8), mỗi ống 4 ml, hoặc bình hoặc chai (6.8) với 100 ml môi trường cho mỗi bình hoặc chai (6.8).

Thanh trùng trong nồi hấp áp lực ở 121⁰C trong 15 phút. Nếu môi trường được sử dụng ngay thì làm nguội trong nồi cách thủy (6.5) ở 45⁰C trước khi sử dụng.

Nếu không dùng ngay thì trước khi xét nghiệm vi sinh vật, để tránh sự chậm trễ khi rót môi trường vào đĩa cần làm tan chảy hoàn toàn môi trường trong nồi cách thủy đang sôi, sau đó làm nguội trong nồi cách thủy (6.5) ở nhiệt độ 45⁰C.

6. Thiết bị và dụng cụ thủy tinh

Chú thích - Có thể sử dụng thiết bị, dụng cụ sử dụng một lần thay cho việc sử dụng lại các dụng cụ thủy tinh nếu chúng đáp ứng được các yêu cầu quy định.

Sử dụng các thiết bị thông thường của phòng thí nghiệm vi sinh vật và đặc biệt là

...

...

...

Xem TCVN 6404 : 1998 (ISO 7218)

6.2. Tủ ấm, có khả năng hoạt động ở 30⁰C ± 1⁰C.

6.3. Đĩa Petri, bằng thủy tinh hoặc bằng chất dẻo có đường kính 90 mm đến 100 mm.

6.4. Pipet xả hết, có dung tích danh định 1 ml.

6.5. Nồi cách thủy, hoặc thiết bị tương tự có thể hoạt động ở 45⁰C ± 0,5 ⁰C.

6.6. Thiết bị đếm khuẩn lạc, bao gồm nền phát quang và thiết bị đếm cơ hoặc điện tử số.

6.7. pH, chính xác đến ± 0,1 đơn vị pH ở 25⁰C.

6.8. Các ống nghiệm, có kích thước 20 mm x 200 mm, bình hoặc chai có dung tích 150 ml nhưng không lớn hơn 500 ml.

7. Lấy mẫu

...

...

...

8. Chuẩn bị mẫu thử

Chuẩn bị mẫu thử theo tiêu chuẩn cụ thể thích hợp đối với sản phẩm có liên quan. Nếu không có tiêu chuẩn cụ thể thì các bên liên quan nên thỏa thuận với nhau về phần này.

9. Cách tiến hành

9.1. Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu và dịch pha loãng

Xem TCVN 4881 : 1989 (ISO 6887) và tiêu chuẩn cụ thể liên quan tới sản phẩm.

9.2. Cấy và nuôi ấm

9.2.1. Lấy hai đĩa Petri vô trùng (6.3) dùng pipet vô trùng (6.4) cho vào đĩa 1 ml mẫu thử nếu sản phẩm là chất lỏng hoặc 1 ml huyền phù ban đầu nếu các sản phẩm ở dạng khác.

Lấy hai đĩa Petri vô trùng khác. Dùng pipet vô trùng cho vào mỗi đĩa 1 ml dịch pha loãng thập phân thứ nhất (10^-1) của mẫu thử nếu sản phẩm là chất lỏng hoặc 1 ml dịch pha loãng thập phân thứ nhất (10^-2) của huyền phù ban đầu nếu các sản phẩm ở dạng khác.

Lặp lại trình tự này với các dịch pha loãng tiếp theo và dùng pipet mới vô trùng đối với mỗi dịch pha loãng thập phân.

...

...

...

Trộn cẩn thận mẫu cấy với môi trường và để cho hỗn hợp đông đặc lại bằng cách đặt các đĩa Petri trên mặt bàn ở chỗ mát.

9.2.3. Sau khi các đĩa đã đông đặc hoàn toàn, và chỉ khi nghi ngờ sản phẩm được xét nghiệm có chứa các vi sinh vật mà khuẩn lạc của chúng có thể mọc lan trên bề mặt của môi trường, rót khoảng 4 ml môi trường thạch nước (5.4) ở 45⁰C ± 0,5 ⁰C lên bề mặt môi trường đã cấy mẫu. Để cho đông đặc như mô tả ở trên.

Thao tác này nếu có tiến hành thì phải ghi lại trong báo cáo thử nghiệm.

9.2.4. Lật ngược các đĩa đã cấy mẫu và đưa vào nuôi ở tủ ấm ở 30⁰C trong 72 h ± 3 h.

9.3. Đếm khuẩn lạc

Sau thời gian ủ ấm theo quy định (xem 9.2.4), dùng thiết bị đếm khuẩn lạc (6.6) tiến hành đếm hoặc các khuẩn lạc trong mỗi đĩa chứa không quá 300 khuẩn lạc.

10. Biểu thị kết quả

10.1. Phương pháp tính

10.1.1. Trường hợp chung - Các đĩa chứa từ 15 đến 300 khuẩn lạc

...

...

...

Tính số vi khuẩn N trên mililit hoặc trên gam sản phẩm, thùy thuộc vào từng trường hợp và áp dụng công thức sau:

 Trong đó

 là tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa được giữ lại.

n₁  là số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ nhất

n₂  là số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ hai.

d là hệ số pha loãng tương ứng với độ loãng thứ nhất.

Làm tròn kết quả đến hai chữ số có nghĩa.

Biểu thị kết quả số vi sinh vật trên mililit hoặc trên gam sản phẩm bằng cách lấy một số từ 1,0 đến 9,9 x 10^x, trong đó x là số mũ của 10.

...

...

...

Số vi sinh vật đếm được ở 30⁰C cho kết quả sau:

=

Làm tròn kết quả theo quy định ở trên sẽ cho kết quả là 19 000 hoặc 1,9 x 10⁴  vi sinh vật trên mililit hoặc trên gam sản phẩm.

10.1.2. Ước đoán số lượng nhỏ

Nếu hai đĩa ứng với mẫu thử (sản phẩm lỏng) hoặc huyền phù ban đầu (các sản phẩm ở dạng khác) có chứa ít hơn 15 khuẩn lạc thì tính trung bình số học m của số khuẩn lạc đếm được trên cả hai đĩa.

Báo cáo kết quả như sau:

- Số vi sinh vật được ước đoán trong một mililit.

 N_{E =} m (sản phẩm lỏng)

- Số vi sinh vật được ước đoán trong một gam:

...

...

...

10.1.3. Trường hợp không có khuẩn lạc nào mọc

Nếu hai đĩa ứng với mẫu thử (sản phẩm lỏng) hoặc huyền phù ban đầu (các sản phẩm ở dạng khác) không có các khuẩn lạc nào thì báo cáo kết quả như sau:

- nhỏ hơn 1 vi sinh vật trong một mililit (sản phẩm lỏng)

- nhỏ hơn 1 x d^-1 vi sinh vật trong một gam (các sản phẩm ở dạng khác), trong đó d là hệ số pha loãng của huyền phù ban đầu.

10.2. Độ chụm

10.2.1. Các đĩa chứa từ 15 đến 300 khuẩn lạc (xem 10.1.1)

Xét thuần túy về mặt thống kê, 95% trường hợp giới hạn tin cậy của phương pháp dao động từ ± 12% đến ± 37% (Cowel và Morisetti, tạp chí nông nghiệp thực phẩm, tập 20 trang 573). Trên thực tế sai lệch này thậm chí còn lớn hơn, đặc biệt là khi kết quả thu được từ những người phân tích khác nhau.

10.2.2. Ước đoán số lượng nhỏ (xem 10.1.2)

Giới hạn tin cậy đối với việc ước đoán số lượng nhỏ vi sinh vật cho ở bảng A.1

...

...

...

Báo cáo thử nghiệm cần chỉ rõ phương pháp đã sử dụng và kết quả thu được. Báo cáo thử nghiệm cũng cần đề cập đến bất kỳ thao tác nào mà không được quy định trong tiêu chuẩn này hoặc những điều được coi là tùy ý cũng như các sự cố có thể ảnh hưởng đến kết quả thử.

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử.

Phụ lục A

(Qui định)

Giới hạn tin cậy để ước đoán số lượng nhỏ khuẩn lạc

Giới hạn tin cậy ở mức 95% đối với việc ước đoán số lượng nhỏ khi số khuẩn lạc ở trên các đĩa được giữ lại ít hơn 15 khuẩn lạc cho ở bảng A.1

Bảng A.1

Số vi sinh vật

...

...

...

thấp hơn

cao hơn

1

<1

2

2

<1

4

3

...

...

...

5

4

1

6

5

2

9

6

2

...

...

...

7

2

12

8

3

13

9

4

14

...

...

...

4

16

11

5

18

12

6

19

13

...

...

...

20

14

7

21

15

8

23

Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 4884:2001 (ISO 4883 : 1991) về Vi sinh vật học - Hướng dẫn chung về định lượng vi sinh vật - Kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 30oC do Bộ Khoa học Công nghệ và Môi trường ban hành