5.3.2 Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần khác nhau hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần.

Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 6,8 ± 0,2 ở 25 ^oC, nếu cần.

Phân phối từng lượng môi trường 10 ml vào các ống có kích thước 16 mm x 160 mm (6.4) chứa ống Durham (6.5) đối với môi trường nồng độ đơn, và vào các ống nghiệm có kích thước 20 mm x 200 mm (6,4) [không chứa các ống Durham (6.5)] đối với môi trường nồng độ kép.

Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực ở nhiệt độ 121 ^oC. Các ống Durham không được chứa các bọt khí sau khi khử trùng.

5.3.3 Kiểm tra tính năng về đảm bảo chất lượng môi trường cấy

Đối với việc xác định tính chọn lọc và hiệu quả, xem ISO/TS 11133-1. Kiểm tra tính năng đối với canh thang tryptoza lauryl sulfat theo ISO/TS 11133-2 : 2003, Bảng B.1.

5.4 Môi trường khẳng định: Canh thang mật lactoza lục sáng (lactose bile brilliant green broth)

5.4.1 Thành phần

...

...

...

10 g

Lactoza (C₁₂H₂₂O₁₁.H₂O)

10 g

Mật bò khô

20 g

Lục sáng

0,0133 g

Nước

1 000 ml

...

...

...

Hòa tan các thành phần hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun nóng nhẹ, nếu cần.

Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,2 ± 0,2 ở 25 ^oC, nếu cần.

Phân phối từng lượng môi trường 10 ml vào các ống có kích thước 16 mm x 160 mm (6.4) có ống Durham (6.5).

Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực ở 121 ^oC. Các ống Durham không được chứa bọt khí sau khi khử trùng.

5.4.3 Kiểm tra tính năng về đảm bảo chất lượng môi trường cấy

Đối với việc xác định tính chọn lọc và hiệu quả, xem ISO/TS 11133-1. Kiểm tra tính năng đối với canh thang mật lactoza lục sáng theo Bảng B.1 của ISO/TS 11133-2 : 2003.

6. Thiết bị và dụng cụ thủy tinh

Sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm vi sinh [TCVN 6263 (ISO 8261)] và cụ thể như sau:

6.1 Thiết bị để khử trùng khô (tủ sấy) hoặc để khử trùng ướt (nồi hấp áp lực)

...

...

...

6.2 Tủ ấm, có khả năng hoạt động ở 30 ^oC ± 1 ^oC hoặc 37 ^oC ± 1 ^oC.

6.3 Vòng que cấy, bằng platin/iridi hoặc niken/crom có đường kính khoảng 3 mm hoặc vòng que cấy sử dụng một lần.

6.4 Các ống nghiệm, có kích thước khoảng 16 mm x 160 mm và 20 mm x 200 mm.

6.5 Ống Durham, phù hợp để dùng với các ống nghiệm có kích thước 16 mm x 160 mm (6.4).

6.6 Pipet xả hết, có dung tích danh định 1 ml và 10 ml.

6.7 Máy đo pH, chính xác đến ± 0,1 đơn vị pH ở 25 ^oC.

7. Lấy mẫu

Lấy mẫu theo tiêu chuẩn cụ thể thích hợp đối với sản phẩm liên quan. Nếu không có tiêu chuẩn cụ thể thì các bên có liên quan nên thỏa thuận với nhau vấn đề này.

8. Chuẩn bị mẫu thử

...

...

...

9. Cách tiến hành (Phụ lục A)

9.1 Phương pháp phát hiện (xem hình A.1)

9.1.1 Phần mẫu thử và huyền phù ban đầu

Xem TCVN 6507 (ISO 6887) (phần có liên quan), TCVN 6263 (ISO 8261) hoặc tiêu chuẩn cụ thể thích hợp đối với sản phẩm liên quan.

9.1.2 Cấy và ủ

9.1.2.1 Tùy thuộc vào giới hạn phát hiện yêu cầu, mà lấy x ml mẫu thử dạng lỏng hoặc x ml huyền phù ban đầu nếu mẫu thử ở dạng khác, chuyển vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trường tăng sinh chọn lọc nồng độ kép [5.3.1 a)] khi 1 ml < x < 10 ml, hoặc vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trường tăng sinh chọn lọc nồng độ đơn [5.3.1 b)] khi x ≤ 1 ml.

9.1.2.2 Để ống môi trường nồng độ kép (9.1.2.1) trong tủ ấm (6.2) ở 30 ^oC hoặc 37 ^oC (theo thỏa thuận) trong 24 h ± 2 h.

9.1.2.3 Để ống môi trường nồng độ đơn (9.1.2.1) trong tủ ấm (6.2) ở 30 ^oC hoặc 37 ^oC (theo thỏa thuận) trong 24 h ± 2 h hoặc nếu ở giai đoạn này mà không thấy có sinh khí hoặc mờ đục làm cản trở việc phát hiện sinh khí thì ủ tiếp 24 h ± 2 h.

9.1.3 Phép thử khẳng định (xem hình A.3)

...

...

...

9.1.3.2 Tiến hành theo cùng một trình tự như trong 9.1.3.1 đối với các ống đã được ủ ấm trong 9.1.2.3 có biểu hiện sinh khí hoặc mờ đục làm cản trở việc phát hiện sinh khí, khi quan sát thấy một trong các biểu hiện đó (tức là sau 24 h ± 2 h hoặc sau 48 h ± 2 h).

9.1.4 Diễn giải kết quả (xem hình A.1)

Ống nghiệm thu được trong 9.1.3.1 hoặc 9.1.3.2 cho thấy sinh khí sau 24 h ± 2 h và 48 h ± 2 h được coi là dương tính.

9.2 Phương pháp định lượng (MPN) (xem hình A.2)

9.2.1 Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng

Xem TCVN 6507 (ISO 6887) (phần có liên quan), TCVN 6263 (ISO 8261) hoặc tiêu chuẩn cụ thể thích hợp đối với sản phẩm liên quan.

Chuẩn bị một số độ pha loãng đủ để đảm bảo rằng các ống tương ứng với độ pha loãng cuối cùng sẽ cho kết quả âm tính.

9.2.2 Cấy và ủ

9.2.2.1 Thông thường lấy một tổ hợp ba ống đối với mỗi độ pha loãng. Tuy nhiên, đối với một số sản phẩm và/hoặc các kết quả yêu cầu có độ chính xác lớn hơn, mà có thể cần thiết phải cấy một loạt nhiều hơn ba ống (ví dụ: năm ống). Đối với các trường hợp này, để tính MPN xem các bảng liên quan trong TCVN 6404 (ISO 7218).

...

...

...

9.2.2.3 Lấy ba ống môi trường tăng sinh chọn lọc nồng độ đơn [5.3.1 b)]. Dùng pipet vô trùng (6.6) chuyển 1 ml mẫu thử nếu là chất lỏng hoặc 1 ml huyền phù ban đầu, nếu là các sản phẩm ở dạng khác vào từng ống nghiệm nói trên.

9.2.2.4 Đối với mỗi độ pha loãng tiếp theo, tiếp tục như mô tả trong 9.2.2.3. Sử dụng mỗi pipet vô trùng cho mỗi độ pha loãng. Trộn kỹ dịch cấy với môi trường.

9.2.2.5 Để ống môi trường nồng độ kép (9.2.2.2) trong tủ ấm (6.2) ở 30 ^oC hoặc 37 ^oC (theo thỏa thuận) trong 24 h ± 2 h.

9.2.2.6 Để ống môi trường nồng độ đơn (9.2.2.3 và 9.2.2.4) trong tủ ấm (6.2) ở 30 ^oC hoặc 37 ^oC (theo thỏa thuận) trong 24 h ± 2 h, hoặc nếu ở giai đoạn này mà không thấy sinh khí hoặc mờ đục làm cản trở việc phát hiện sinh khí thì ủ tiếp 24 h ± 2 h.

9.2.3 Phép thử khẳng định (xem hình A.3)

9.2.3.1 Dùng que cấy vòng (6.3) cấy dịch cấy thu được trong 9.2.2.5 vào ống môi trường thử khẳng định (5.4). Đặt vào tủ ấm (6.2) ở nhiệt độ 30 ^oC hoặc 37 ^oC (theo thỏa thuận) trong 24 h ± 2 h, nếu không sinh khí ở giai đoạn này thì ủ tiếp 24 h ± 2 h.

9.2.3.2 Tiến hành theo cùng một trình tự như trong 9.2.3.1 đối với các ống đã được ủ ấm từ 9.2.2.6 có biểu hiện sinh khí hoặc mờ đục làm cản trở việc phát hiện sinh khí, khi quan sát lần thứ nhất (tức là sau 24 h ± 2 h hoặc sau 48 h ± 2 h).

9.2.4 Diễn giải kết quả (xem hình A.2)

Đối với mỗi độ pha loãng, đếm tổng số các ống quan sát thấy có sinh khí trong 9.2.3 (các ống dương tính) sau 24 h ± 2 h và sau 48 h ± 2 h (nếu có).

...

...

...

Theo các kết quả diễn giải (xem 9.1.4), chỉ rõ sự có mặt hay không có mặt coliform trong phần mẫu thử x g hoặc x ml của sản phẩm [xem TCVN 6404 (ISO 7218)].

Tính số có xác suất lớn nhất từ số ống dương tính đối với mỗi độ pha loãng. Xem [TCVN 6404 (ISO 7218)].

11. Độ chụm

Với kỹ thuật MPN có thể cho kết quả với dao động lớn, do đó hết sức thận trọng khi sử dụng kết quả thu được bằng phương pháp này.

Giới hạn tin cậy được nêu trong TCVN 6404 (ISO 7218).

12. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

- mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

- phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

...

...

...

- mục đích của phép thử và nhiệt độ ủ đã sử dụng;

- tất cả các chi tiết thao tác không qui định trong tiêu chuẩn này, cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng tới kết quả.

- các kết quả thử nghiệm thu được.

Phụ lục A

(Qui định)

Sơ đồ về cách tiến hành

Hình A.1 - Phương pháp phát hiện

...

...

...

Hình A.2 - Phương pháp định lượng

Hình A.3 - Các chi tiết về bước khẳng định

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1]  TCVN 6848 (ISO 4832) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp định lượng coliform - Kỹ thuật đếm khuẩn lạc.

[2]  EDWARD, Ρ.R. and EWING, W.H. Indentification of Enterobacteriaceae 3^rd edition, Burgess Publishing Company, Minneapolis, USA, 1972.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 4882:2007 (ISO 4831 : 2006) về Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp phát hiện và định lượng Coliform - Kỹ thuật đếm số có xác suất lớn nhất