Trong đó:

R_t  là tỷ số đồng vị cacbon bền (¹³C/¹²C) của mẫu thử;

R_s  là tỷ số đồng vị cacbon bền (¹³C/¹²C) của vật liệu chuẩn.

Chuyển đổi các chất phân tích trong phòng thử nghiệm, liên quan đến vật liệu chuẩn bất kỳ được sử dụng, thành đường nền PDB theo Công thức (2):

(2)

Trong đó

δ_{(X - B)} và δ_{(X - PDB)}  là giá trị đồng vị tương ứng với các chất phân tích của mẫu thử (X) so với vật liệu chuẩn (3.1) và so với PDB;

δ_{(B - PDB)}  là giá trị đồng vị tương ứng với chất phân tích của vật liệu chuẩn (B) so với PDB.

...

...

...

6.2  Phương pháp 2: Phương pháp dòng khí liên tục

6.2.1  Nguyên tắc

Đốt mẫu thử theo phương pháp đốt Dumas tự động có chất xúc tác crom-crom (III) oxit (3.10), sử dụng xung oxy. Cacbon dioxit sinh ra được tinh sạch và đưa vào nguồn ion hóa của máy đo khối phổ bằng khí mang heli (3.11). Quá trình đốt cháy bằng dòng khí liên tục và tinh sạch cacbon dioxit cùng với phép đo trực tuyến bằng máy đo khối phổ được thực hiện hoàn toàn tự động, với sự kiểm soát của phần mềm.

6.2.2  Chuẩn bị mẫu thử

Dùng cân (4.9), cân ba lần mỗi lần 3 mg phần mẫu thử chưa pha loãng, chính xác đến 0,1 mg, cho vào viên nang bằng thiếc (4.14), đóng kín viên nang rồi đặt trên thiết bị lấy mẫu tự động của hệ đốt Dumas tự động của hệ thống tích hợp (4.4). Sử dụng mẫu chuẩn làm việc [đã được hiệu chuẩn theo tối thiểu hai vật liệu chuẩn (3.1)] sau mỗi dãy tối đa tám phần mẫu thử.

6.2.3  Cách tiến hành

Vận hành hệ thống tích hợp (4.4) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Bơm dòng khí mang [oxy có độ tinh khiết cao (3.6)] tốc độ 60 ml/min với xung 15 ml được kiểm soát bằng máy tính vào ống oxy hóa của hệ thống tích hợp, ở nhiệt độ 1 000 °C. Cài đặt nhiệt độ ống khử ở 600 °C và cột sắc ký ở 150 °C. Các dòng ion ở m/z 45, m/z 46, m/z 47 được tích hợp đồng thời, hiệu chuẩn đường nền, sự đóng góp của đồng vị ¹⁷O ở số khối 45 và độ trôi giữa các vật liệu chuẩn. Vì chỉ có thể thực hiện một phép đo cho mỗi phần mẫu thử, cần xác định độ chụm bằng cách đo năm phần mẫu thử của dầu thô NIST 22 so với vật liệu chuẩn cũng chính là dầu thô NIST 22 (3.1.2).

6.2.4  Tính kết quả

Giá trị đồng vị cacbon bền ¹³C (δ¹³C) của mẫu thử thu được trực tiếp từ máy tính của hệ thống tích hợp.

...

...

...

7.1  Tách và tinh sạch protein

7.1.1  Yêu cầu chung

Nếu có các lượng đáng kể chất rắn thì lọc mẫu thử qua màng lọc (4.15).

CHÚ THÍCH: Mọi chất không hòa tan nặng hơn nước sẽ làm nhiễm bẩn kết tủa protein.

Tách và tinh sạch protein theo 7.1.2 hoặc 7.1.3.

7.1.2  Quy trình rửa lặp lại

Cho 4 ml nước vào 10 g đến 12 g phần mẫu thử đựng trong ống ly tâm 50 ml (4.17) và trộn đều.

Cho 2,0 ml dung dịch natri vonfamat dihydrat 10 % (3.2) và 2,0 ml dung dịch axit sulfuric 0,335 M (3.3) vào ống nghiệm nhỏ (4.18), lắc đều và cho ngay vào dung dịch mẫu thử trong ống ly tâm 50 ml, trộn kỹ. Lắc tròn ống trong nồi cách thủy (4.19) ở nhiệt độ khoảng 80 °C cho đến khi nhìn thấy các lớp cụm xốp nổi phía trên trong. Nếu không nhìn thấy các lớp cụm xốp hoặc nếu lớp cặn nổi phía trên vẩn đục thì thêm các lượng 2 ml dung dịch axit sulfuric 0,335 M, lặp lại việc đun nóng giữa các lần thêm.

Đổ đầy nước vào ống ly tâm, trộn đều, ly tâm 5 min trong máy ly tâm (4.16) ở gia tốc 1 500 g và gạn lấy lớp nổi phía trên.

...

...

...

7.1.3  Quy trình thẩm tách

Nhúng túi thẩm tách cellulose (4.21) vào nước, buộc chặt hai nút ở một đầu của túi.

Đun nóng từ 5 g đến 7 g phần mẫu thử đến khi bắt đầu sôi (có thể dùng lò vi sóng), thêm khoảng 3 ml đến 5 ml nước, trộn đều, cho vào túi thẩm tách cellulose, buộc chặt hai nút ở đầu còn lại của túi và thẩm tách trên vòi nước chảy trong thời gian không ngắn hơn 16 h. Chuyển lượng chứa trong túi vào ống ly tâm 50 ml (4.17) và ly tâm 5 min trong máy ly tâm (4.16) ở gia tốc 1 500 g. Gạn lớp nổi phía trên vào cốc có mỏ 100 ml (4.22) và loại bỏ cặn. Trộn 6,0 ml dung dịch natri vonfamat dihydrat 10 % (3.2) và 6,0 ml dung dịch axit sulfuric 0,335 M (3.3), rồi thêm vào cốc có mỏ. Đun hỗn hợp trên bếp điện (4.23), khuấy đều cho đến khi có thể nhìn thấy các lớp cụm xốp cùng lớp nổi phía trên trong. Có thể thêm các lượng axit sulfuric 0,335 M, nếu cần. Chuyển lượng chứa trong cốc có mỏ vào ống ly tâm 50 ml (4.17) và ly tâm trong 5 min ở gia tốc 1 500 g. Loại bỏ lớp nổi phía trên, phân tán kỹ các phần protein thu được, đổ đầy nước vào ống, trộn đều và ly tâm tiếp như trên để thu được protein đã tinh sạch.

7.2  Xác định tỷ số đồng vị cacbon bền đối với protein

Lấy lượng thích hợp protein đã tinh sạch (xem 7.1), đốt cháy protein bằng phương pháp được sử dụng cho phần mẫu thử và xác định tỷ số đồng vị cacbon bền đối với protein theo Điều 6.

Nếu cần để giữ cho phép phân tích tỷ số đồng vị tiếp theo, sử dụng pipet Pasteur (4.20) chuyển phần protein đã rửa sạch bằng lượng nước tối thiểu vào lọ nhỏ (4.24), đậy nắp và đặt trong nước sôi 2 min hoặc làm khô protein trong tủ sấy (4.7) ở nhiệt độ khoảng 75 °C trong ít nhất 3 h.

8  Tính và biểu thị kết quả

Hàm lượng đường C-4 biểu kiến có trong mẫu thử, X, tính bằng phần trăm khối lượng (%), theo Công thức (3):

...

...

...

Trong đó

δ¹³C_p  là giá trị đồng vị ¹³C của protein tách được từ mẫu thử (xem 7.2), tính bằng phần nghìn (‰);

δ¹³C  là giá trị đồng vị ¹³C của mẫu thử (xem 6.1.3 hoặc 6.2.4), tính bằng phần nghìn (‰);

-9,7  là giá trị đồng vị cacbon bền 13 (δ¹³C) trung bình đối với xi-rô ngô, tính bằng phần nghìn (‰).

Nếu kết quả tính cho giá trị âm thì báo cáo hàm lượng đường C-4 biểu kiến có trong mẫu thử là 0 %.

Mật ong nguyên chất (không chứa đường mía hoặc xi-rô ngô) thường có hàm lượng đường thực vật C-4 không lớn hơn 7 %. Một số mẫu mật ong nguyên chất có thể có hàm lượng đường thực vật C-4 cao hơn 7 % một chút, nhưng giá trị đồng vị cacbon bền ¹³C vẫn trong dải thông thường (nhỏ hơn -24,0 ‰).

9  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ít nhất bao gồm các thông tin sau:

- mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

...

...

...

- phương pháp thử, viện dẫn tiêu chuẩn này;

- mọi điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được xem là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả;

- kết quả thử nghiệm thu được hoặc nếu kiểm tra độ lặp lại, thì nêu kết quả cuối cùng thu được.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Phép thử liên phòng thử nghiệm

Kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm đối với phương pháp được nêu trong Bảng A.1.

Bảng A.1 - Kết quả liên phòng thử nghiệm

...

...

...

từ -1,9 đến +10,9

Độ lệch chuẩn lặp lại của tỷ số đồng vị ¹³C của mật ong, ‰

0,06

Độ lệch chuẩn tái lập của tỷ số đồng vị ¹³C của mật ong, ‰

0,14

Độ lệch chuẩn lặp lại của tỷ số đồng vị ¹³C của protein từ mật ong, ‰

0,14

Độ lệch chuẩn tái lập của tỷ số đồng vị ¹³C của protein từ mật ong, ‰

0,25

...

...

...

0,9

Độ lệch chuẩn tái lập của hàm lượng đường C-4 biểu kiến, %

1,4

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] TCVN 5261, Sản phẩm ong - Phương pháp lấy mẫu

[2] Geochimica et Cosmochimica Acta 3, 54-55(1953)

[3] Anal. Chem. 48, 1652 (1976)

[4] GB/T 18932.1-2002, Method for the determination of C-4 plant sugars in honey - Stable carbon isotope ratio method

...

...

...

2) Đây là ví dụ về sản phẩm thích hợp có bán sẵn. Thông tin này đưa ra tạo thuận lợi cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng sản phẩm này.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 13844:2023 về Mật ong - Xác định đường thực vật C-4 bằng phương pháp đo tỷ số đồng vị cacbon bền