8.5  Đo bằng GC-MS

8.5.1  Tạo dẫn xuất và chuẩn bị mẫu cho sắc ký khí

Cho 3,5 g kali bromua (5.7) vào dung dịch mẫu (8.3.2). Thêm 2,5 ml nước brom bão hòa (5.6) và để phản ứng 2 h nơi tối ở nhiệt độ phòng. Thêm vài giọt dung dịch natri thiosulfat (5.8) để khử brom dư. Khi dùng dung dịch 1 mol thì nhỏ vài giọt là đủ để khử màu nâu của brom. Nên tránh dùng quá liều natri thiosulfat.

Cho hết chất chiết vào cột nhựa polyme (hàm lượng 500 mg) có đặc tính trao đổi cation mạnh và phân cực (ví dụ, xem Bảng B.2), đã được ổn định trước theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Trong quá trình này và trong các bước rửa tiếp theo, cần đảm bảo cột không bị chảy đến khô. Sau đó, rửa cột bằng 3 ml nước, 1 ml dung dịch đệm borat có pH 8,6 (5.13) và rửa thêm một lần nữa bằng 0,5 ml nước. Sau đó hút khô cột tiếp theo rửa giải chất phân tích bằng 2 ml etyl axetat với thời gian tiếp xúc trên cột từ 1 min đến 2 min.

CHÚ THÍCH 1: Có thể rửa giải bằng nhiều lượng etyl axetat hơn để cải thiện độ thu hồi. Tuy nhiên, điều này có thể làm tăng ảnh hưởng của chất gây nhiễu.

Làm khô dịch chiết bằng cách bổ sung lượng natri sulfat (5.10) ít nhất có thể để đảm bảo rằng dịch chiết không chứa nước và sau đó thêm 50 μl trjetylamin (5.9). Dung dịch này có thể được sử dụng trực tiếp để phân tích GC.

CHÚ THÍCH 2: Để kiểm tra mức độ hoàn toàn của phản ứng chuyển hóa, có thể bổ sung metacrylamid (ví dụ 100 μl dung dịch pha nước 0,5 μg/ml) vào dung dịch mẫu trước bước brom hóa. Đối với dẫn xuất metacrylamid, nếu độ thu hồi đáp ứng, thì xem như acrylamid đã được brom hóa hoàn toàn.

CHÚ THÍCH 3: Bằng cách bổ sung trietylamin, dibromopropionamid không bền được chuyển thành monobromopropenamid bền, được phát hiện bằng GC-MS. Nếu không có sự chuyển đổi này, việc khử HBr không kiểm soát được có thể xảy ra trong quá trình phân tích tiếp theo (ví dụ tại các vị trí hoạt động trong bơm), cho kết quả không tái lập.

8.5.2  Sắc ký khí

...

...

...

Máy sắc ký khí (6.12) phải được cài đặt theo hướng dẫn của nhà sản xuất và các thông số của thiết bị phải được tối ưu hóa. Việc cài đặt sắc ký phải được điều chỉnh cho phù hợp với cột đã chọn. Các ví dụ được nêu trong Bảng C.2 và C.5 và ví dụ về sắc ký đồ được nêu trong Hình C.3, C.4 và C.5.

8.5.3  Nhận biết và định lượng bằng khối phổ

Các chất phân tích được chuyển về các ion dương (ion phân tử) và các ion phân mảnh đặc trưng bằng quá trình ion hóa điện tử (El). Sử dụng các ion này để nhận biết và định lượng.

Định lượng bằng cách so sánh diện tích pic của các ion thu được từ bromopropenamid với diện tích từ dung dịch nội chuẩn được gắn đồng vị (xem Bảng 2).

Bảng 2 - Các ion quan sát được

Hợp chất ban đầu

Các ion quan sát được

m/z

Bromopropenamid

...

...

...

Nhận biết và định lượng

106:[C₂H₃⁷⁹Br]⁺

Nhận biết

Bromopropenamid-D2

153:[C₃² H₂¹H₂⁸¹BrON]⁺

Nhận biết và định lượng

110:[C₂ ²H₂¹H₁⁸¹Br]⁺

...

...

...

CHÚ THÍCH: Do sự phân bố đồng vị tự nhiên của brom, sự xuất hiện của các ion có m/z 151 và m/z 108 không dùng để đánh giá

9  Hiệu chuẩn

9.1  Yêu cầu chung

Trước khi áp dụng phương pháp GC, tất cả các dung dịch hiệu chuẩn phải tuân theo quy trình tạo dẫn xuất theo 8.5.1.

Để hiệu chuẩn chính xác quy trình thử nghiệm theo 8.4, cần xác định thời gian lưu của acrylamid (LC-MS/MS) hoặc đối với quy trình theo 8.5 thì xác định thời gian lưu của bromopropenamid (GC-MS). Nhận biết thời gian lưu bằng cách sử dụng dung dịch pha nước của chất chuẩn ở các điều kiện sắc ký quy định.

9.2  Xác định độ tuyến tính và xác định dải làm việc

Xác định độ tuyến tính và dải làm việc bằng cách phân tích các dung dịch acrylamid (5.4.2) ở các mức nồng độ khác nhau được bổ sung D3-acrylamid ở cùng mức như đã cho trong 8.2, ví dụ: 0,5 μg/ml. Những dữ liệu này được áp dụng nhằm thiết lập hàm hiệu chuẩn để tính dải tuyến tính đối với acrylamid (dải làm việc).

9.3  Hiệu chuẩn bằng dung dịch nội chuẩn

Thêm một lượng xác định dung dịch nội chuẩn (5.5.2) vào một vài phần mẫu thử của mẫu cà phê được chọn ở các mức nồng độ khác nhau bao trùm dải làm việc. Sau đó tiến hành quy trình phân tích (8.2). Sử dụng dữ liệu được xác định để tính hàm hiệu chuẩn phụ thuộc nền mẫu có dung dịch nội chuẩn. Thực hiện phép xác định riêng rẽ đối với từng loại nền mẫu (chất chiết cà phê, chất thay thế cà phê).

...

...

...

9.4  Xác định độ thu hồi cụ thể trong phòng thử nghiệm

Thêm một lượng xác định dung dịch hiệu chuẩn acrylamid (5.4.2) vào một vài phần mẫu thử của mẫu cà phê ở các mức nồng độ khác nhau. Sau đó thực hiện quá trình phân tích (8.2). Xác định tỷ lệ thu hồi trung bình của phòng thử nghiệm bằng cách sử dụng các giá trị thu được. Độ thu hồi có thể được xác định bằng cách phân tích mẫu chuẩn có hàm lượng acrylamid đã được chứng nhận hoặc đã biết, nếu sẵn có. Nên sử dụng vật liệu như vậy làm mẫu thu hồi trong phép phân tích thông dụng.

10  Đánh giá

10.1  Tiêu chí nhận biết

Xem Bảng 1 và Bảng 2.

10.2  Tính toán và kết quả cuối cùng

Sử dụng các bộ mẫu hiệu chuẩn đã được chuẩn bị theo 9.2 để dựng đồ thị tỷ lệ pic acrylamid với pic dung dịch nội chuẩn theo tỷ lệ nồng độ acrylamid của dung dịch nội chuẩn và thực hiện phép hồi quy tuyến tính.

Tính tỷ lệ pic acrylamid với pic của dung dịch nội chuẩn đối với pic acrylamid của mẫu. Tỷ lệ nồng độ acrylamid của dung dịch nội chuẩn trong mẫu thử có thể được tính bằng phương trình tuyến tính tổng quát. Tính phần khối lượng của acrylamid, w, trong mẫu, biểu thị bằng microgam trên kilogam (μg/kg), sử dụng Công thức (1). Kết quả được tự động hiệu chính theo tỷ lệ thu hồi.

...

...

...

Trong đó

w

là phần khối lượng acrylamid của mẫu tính bằng microgam trên kilogam (μg/kg);

K

là nồng độ khối lượng đích của dung dịch nội chuẩn trong mẫu thử, tính bằng microgam trên mililit (μg/ml);

yi

là diện tích pic của acrylamid chia cho diện tích pic của dung dịch nội chuẩn trong mẫu thử;

a

là độ dốc gradient đường hồi quy của tỷ lệ diện tích pic với tỷ lệ nồng độ;

...

...

...

là giao điểm đường hồi quy của tỷ lệ diện tích pic với tỷ lệ nồng độ;

V

là thể tích cuối cùng của việc chuẩn bị mẫu, tính bằng mililit (ml);

m

là khối lượng mẫu, tính bằng gam (g).

Ngoài ra, có thể sử dụng phương pháp tính đơn giản hơn. Với phương pháp này, giả định rằng độ đáp ứng của pic D3-acrylamid của mẫu tương ứng với nồng độ dung dịch nội chuẩn là 500 mg/kg (xem ví dụ trong 8.2). Nồng độ tương ứng của acrylamid có thể tính được từ độ đáp ứng pic acrylamid sẵn có bằng cách sử dụng quy tắc ba và kết quả có thể nhân với hệ số 0,974 (khối lượng phân tử của acrylamid/khối lượng phân tử của D3-acrylamid). Khi áp dụng phương pháp này, khuyến cáo rằng, trong mỗi dãy phân tích có ít nhất một mẫu đã biết hàm lượng acrylamid để đảm bảo chức năng cơ bản của thiết bị đo.

11  Độ chụm

11.1  Yêu cầu chung

Chi tiết về phép thử liên phòng thử nghiệm về độ chụm của phương pháp được tóm tắt trong Bảng 3 và Bảng A.1 Các giá trị thu được từ phép thử liên phòng thử nghiệm có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ chất phân tích và/hoặc chất nền khác với các giá trị nêu trong Bảng 3 và Bảng A.1.

...

...

...

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm đơn lẻ thu được trên vật liệu thử giống hệt nhau do một người thực hiện sử dụng cùng một thiết bị trong khoảng thời gian ngắn nhất không được quá 5 % các trường hợp lớn hơn giới hạn lặp lại r.

11.3  Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm đơn lẻ thu được trên vật liệu thử giống hệt nhau do hai phòng thử nghiệm thực hiện không được quá 5% các trường hợp lớn hơn giới hạn tái lập R.

Bảng 3 - Dữ liệu về độ chụm để xác định acrylamid trong cà phê

Mẫu

μg/kg

r

μg/kg

...

...

...

μg/kg

Mẫu A (chất chiết cà phê)

612,1

51,86

328,44

Mẫu B (chất chiết thay thế cà phê)

204,1

34,80

141,26

...

...

...

53,74

12,13

38.576

Mẫu D (cà phê rang)

217,1

26,49

109,20

11.4  Độ thu hồi

Đối với phương pháp HPLC, độ thu hồi phải nằm trong khoảng từ 80 % đến 120 %. Đối với phương pháp GC, độ thu hồi phải nằm trong khoảng từ 70 % đến 120 %.

...

...

...

Độ không đảm bảo đo cụ thể của phòng thử nghiệm phải được xác định riêng cho từng nền mẫu.

13  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm các dữ liệu theo TCVN ISO/IEC 17025 và bao gồm ít nhất các thông tin sau đây:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu (loại mẫu, nguồn gốc và tên gọi của mẫu);

b) viện dẫn tiêu chuẩn này;

c) ngày và kiểu quy trình lấy mẫu (nếu biết);

d) ngày nhận mẫu;

e) ngày thử nghiệm;

f) kết quả và đơn vị biểu thị kết quả;

...

...

...

Phụ lục A

(Tham khảo)

Đặc tính hiệu năng

Một nghiên cứu liên phòng thử nghiệm do Ban công tác NA 057-05-09 Kaffee thuộc ban tiêu chuẩn sản phẩm nông nghiệp và thực phẩm của DIN thực hiện với sự tham gia của các phòng thử nghiệm khác nhau. Nghiên cứu này được thực hiện theo các hướng dẫn được mô tả trong tiêu chuẩn này trong thời gian phân tích không quá 10 ngày. Độ chụm của phương pháp phù hợp với các yêu cầu của TCVN 6910-1 (ISO 5725-1) và TCVN 6910-2 (ISO 5725-2). Các kết quả được nêu trong Bảng A.1.

Bảng A.1 - Kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm
(cho cả hai phương pháp: HPLC và GC)^a

Thông số

Mẫu A

Mẫu B

...

...

...

Mẫu D

Năm tiến hành phép thử liên phòng thử nghiệm

2009

2009

2009

2009

Số lượng phòng thử nghiệm tham gia

13

13

...

...

...

13

Số lượng phòng thử nghiệm được giữ lại sau khi trừ ngoại lệ

10

11

11

11

Số lượng kết quả được chấp nhận

30

33

...

...

...

33

Số lượng phòng thử nghiệm ngoại lệ

7

4

5

4

Giá trị trung bình,  (mg/kg)

612,1

204,1

...

...

...

217,1

Độ lệch chuẩn lặp lại, s_r (μg/kg)

18,52

12,43

4,333

9,46

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại RSD_r (%)

3,0

6,1

...

...

...

4,4

Giới hạn lặp lại r (2,8.s_R) (μg/kg)

51,86

34,80

12.132

26,49

Độ lệch chuẩn tái lập, S_R (μg/kg)

117,30

50,45

...

...

...

39,00

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập RSD_R (%)

19,2

24,7

25,6

18,0

Giới hạn tái lập, R (2,8.S_R) (μg/kg)

328,44

141,26

...

...

...

109,20

Độ tái lập theo giá trị Horwitz R_Horr

294,79

116,01

37,317

122,18

Giá trị Horrat R/R_Horr

1,12

1,22

...

...

...

0,90

^a Một đánh giá thống kê riêng biệt về kết quả HPLC-MS/MS và các kết quả GC-MS cho thấy không có sự khác biệt đáng kể giữa các dải giá trị đo được.

Phụ lục B

(Tham khảo)

Ví dụ về các vật liệu hấp phụ

Bảng B.1 - Ví dụ về chất hấp phụ phù hợp để làm sạch bằng SPE (HPLC và GC; xem 8.3)

Sản phẩm (hoặc nhà sản xuất)^a

Chất hấp phụ (mô tả)

...

...

...

Chromabond ABC18 500 mg

Octadecyl silica có chức năng trao đổi ion

Cột ghép

(Combined cartridge)

lsolute® Multimod

500 mg

Chế độ hỗn hợp chứa các nhóm chức không phân cực (C₁₈), trao đổi cation mạnh (-SO3-) và trao đổi anion mạnh (-NR3⁺)

Cột ghép

(Combined cartridge)

...

...

...

500 mg

Chất hấp phụ silica kỵ nước C18

C18

Strata C18E

500 mg

Chất hấp phụ silica kỵ nước C18, đầu khoá đuôi

C18

Strata™ -X-C 33u

500 mg

...

...

...

Trao đổi ion mạnh

Cromabond HR-XC 500 mg

Chất trao đổi cation polyme biến tính bằng axit benzen sulfonic dùng cho SPE

Trao đổi ion mạnh

^a Các vật liệu được nêu tên là ví dụ về các sản phẩm thích hợp có bán sẵn. Thông tin này tạo thuận tiện cho người sử dụng và không ấn định phải sử dụng sản phẩm này.

Bảng B.2 - Ví dụ về chất hấp phụ thích hợp để làm sạch bằng SPE
của dịch chiết GC (xem 8.5.1 )

Sản phẩm (hoặc nhà sản xuất)^a

Chất hấp phụ (mô tả)

Chức năng

...

...

...

500 mg

Chất trao đổi cation polyme biến tính bằng axit benzen sulfonic dùng cho SPE

Trao đổi ion mạnh

Cromabond HR-XC

500 mg

Chất trao đổi cation polyme biến tính bằng axit benzen sulfonic dùng cho SPE

Trao đổi ion mạnh

^a Các vật liệu được nêu tên là ví dụ về các sản phẩm thích hợp có bán sẵn. Thông tin này tạo thuận tiện cho người sử dụng và không ấn định phải sử dụng sản phẩm này.

...

...

...

(Tham khảo)

Ví dụ về cột và các điều kiện phân tích

C.1  Cột sắc ký phù hợp thông thường

Cột sắc ký với các điều kiện phân tích tương ứng được nêu trong Bảng C.1 và C.2. Các kích thước cột khác nhau có thể được sử dụng sau khi chỉnh tốc độ dòng.

Bảng C.1 - Điều kiện phân tích cho các cột HPLC được chọn

Cột HPLCa

Chiều dài

mm

Đường kính trong

...

...

...

Cài đặt sắc ký

Chất rửa giải

Tốc độ dòng

ml/min

Synergi™Hydro-RPA

250

4,6

axit axetic, loãng, pH 2,6

1,0

...

...

...

150

3

nước : metanol 9:1 (phần thể tích), với axit formic 0,1 %

0,4

LiChrospher® 100 CN, 5 μm

250

4

axetonitril:axit axetic 1 % 1:1 (phần thể tích)

0,7

...

...

...

250

4,6

metanol:axit formic 1 %

0,8

Shodex RSpak DE-413,4 μm

150

4,6

A: Nước, axit formic 0,01 %,

B: metanol

...

...

...

5 min, 60 % A,

6 min, 10 % A,

12 min 10 % A,

16 min 90 % A

0,6

Hypercarb®, 3 μm

100

2,1

nước: axit formic 1 %

...

...

...

^a Các vật liệu được nêu tên là ví dụ về các sản phẩm thích hợp có bán sẵn. Thông tin này tạo thuận tiện cho người sử dụng và không ấn định phải sử dụng sản phẩm này.

Bảng C.2 - Cột mao quản GC

Cột GC^a

Vật liệu

Chiều dài

m

Đường kính trong

mm

Độ dày màng

...

...

...

Optima WAX

Polyetylen glycol 20 000 Da

30

0,25

0,25

RTX-200

Crossbond® tritluoropropylmethyl polysiloxan

60

0,25

...

...

...

^a) Các vật liệu được nêu tên là ví dụ về các sản phẩm thích hợp có bán sẵn. Thông tin này tạo thuận tiện cho người sử dụng và không ấn định phải sử dụng sản phẩm này.

C.2  Ví dụ về phương pháp và thời gian lưu gần đúng đối với HPLC-MS/MS

C.2.1  Ví dụ A

Bơm 20 μl dung dịch mẫu lên cột Phenomenex Luna Phenyl-Hexyl1) (xem Bảng C.1; 5 μm, 250 mm × 4,6 mm) ở các điều kiện sắc ký nêu trong Bảng C.3 .

Bảng C.3 - Các điều kiện sắc ký cho ví dụ A

Chất rửa giải

Chất rửa giải A
axit formic

1 %

Chất rửa giải B
metanol

...

...

...

0,8 ml/min

Gradient

(0 đến 3) min, 95 % A; (5 đến 8) min, 2 % A

Chạy mẫu

8 min

Thời gian lưu

4,7 min

C.2.2  Ví dụ B

Bơm 20 μl dung dịch mẫu lên cột¹⁾ LiChrosphert® 100 CN (xem Bảng C.1) bằng tiền cột LiChrospher® 100 RP-18 (4 mm × 4 mm) ở các điều kiện sắc ký nêu trong Bảng C.4 .

...

...

...

Dung dịch rửa giải

Dung dịch rửa giải A

axetonitril

Dung dịch rửa giải B

axit axetic 1 %

Tốc độ dòng

0,7 ml/min

Gradient

(0 đến 5) min, 50 % A; (6 đến 9) min, 100 % A, (10 đến 20) min, 50 % A

...

...

...

20 min

Nhiệt độ của bộ lấy mẫu tự động

20 °C

Nhiệt độ lò cột

25 °C

Chia dòng

khoảng 1:5

Thời gian lưu acrylamid

3,7 min

...

...

...

Bơm 2 μl dung dịch mẫu ở “chế độ xung chia dòng” trên cột Optima WAX ¹⁾ (xem Bảng C.2 ) ở các điều kiện sắc ký nêu trong Bảng C.5 dưới đây.

Bảng C.5 - Phương pháp GC: Ví dụ về các điều kiện thích hợp và thời gian lưu gần đúng đối với GC-MS

Bơm

250 °C

-

Chương trình nhiệt độ

50 °C

Giữ 1 min

...

...

...

240 °C

Giữ 11 min

-

Dòng khí

1,0 ml/min

(đẳng dòng)

Thời gian lưu bromopropenamid (xấp xỉ)

4,4 min

...

...

...

C.4  Ví dụ về sắc ký đồ đối với HPLC-MS/MS

Sắc ký đồ nêu trong Hình C.1 đến Hình C.5 thu được từ phép phân tích các mẫu cà phê rang xay có hàm lượng acrylamid xấp xỉ 240 μg/kg. Nồng độ của D3-acrylamid được bổ sung là 500 μg/kg (GC) và 1 000 μg/kg (HPLC).

CHÚ GIẢI

Y  cường độ tín hiệu

t  thời gian tính bằng phút

1  ở t = 5,2 min MRM 75,0 → 44,0 (ion định tính)

2  ở t = 5,2 min MRM 75,0 → 58,0 (ion định lượng)

Hình C.1 - D3-acrylamid

...

...

...

CHÚ GIẢI

Y  cường độ tín hiệu

t  thời gian tính bằng min

1  ở t = 5,2 min MRM 72,0 → 44,0 (ion định tính)

2  ở t = 5,2 min MRM 72,0 → 55,0 (ion định lượng)

Hình C.2 - D3-acrylamid, sẵn có

C.5  Ví dụ về sắc ký đồ đối với GC-MS

CHÚ GIẢI

...

...

...

t  thời gian tính bằng phút

1  bromopropenamid

Hình C.3 - Sắc ký đồ của ion tổng số (chế độ quét)

CHÚ GIẢI

Y  cường độ tín hiệu

t  thời gian tính bằng phút

1  ở t = 10,214 min, khối lượng bromopropenamid = 149 [C₃H₄⁷⁹Br]⁺

2d  tạp chất

...

...

...

CHÚ GIẢI

Y  cường độ tín hiệu

t  thời gian tính bằng phút

1  ở t = 10,213 min, khối lượng bromopropenamid = 106 [C₃H₄⁷⁹Br]⁺

Hình C.5 - Ion được chiết, số khối 106 (ion định lượng)

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] TCVN 6910-1 (ISO 5725-1), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 1: Nguyên tắc và định nghĩa chung

...

...

...

[3] TCVN ISO/IEC 17025, Yêu cầu chung về năng lực của phòng thử nghiệm và hiệu chuẩn

1) Các vật liệu được nêu tên là ví dụ về các sản phẩm thích hợp có bán sẵn. Thông tin này tạo thuận tiện cho người sử dụng và không ấn định phải sử dụng sản phẩm này.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 13838:2023 (ISO 18862:2016) về Cà phê và sản phẩm cà phê - Xác định acrylamid - Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao-hai lần khối phổ (HPLC-MS/MS) và sắc ký khí-khối phổ (GC-MS) sau khi tạo dẫn xuất