Trong đó:

C_s  là nồng độ đường trong mẫu, tính bằng gam trên lít (g/L);

17  là nồng độ thực tế của đường, tính bằng gam trên lít (g/L), để tạo ra 1 % (thể tích) etanol.

6.1.2  Lên men nước quả

Cho 0,6 L nước quả (loại chưa cô đặc) hoặc nước quả cô đặc đã hoàn nguyên, đã xác định trước độ Brix, vào bình lên men (5.2), thêm 3 g nấm men khô (4.1). Đậy nắp bình lên men để tránh không khí xâm nhập. Để nước quả lên men ở nhiệt độ khoảng 20 °C cho đến khi tất cả lượng đường được chuyển hóa thành etanol. Sử dụng hệ thống máy tính (5.3) để kiểm soát quá trình lên men, nếu cần. Kiểm tra sự kết thúc quá trình lên men đường bằng cách đo lượng đường còn lại, sử dụng máy sắc ký lỏng hoặc quan sát phản ứng tạo màu (ví dụ: Clinitest). Quá trình lên men của nước táo hoặc nước dứa kéo dài khoảng 2 ngày (có thể kéo dài 4 ngày đến 5 ngày đối với nước táo). Ly tâm (5.4) dịch lên men khoảng 2 min ở tốc độ 4 000 r/min.

Xác định hàm lượng etanol của dịch lên men (C_s, %, thể tích) như sau: Dùng pipet (5.12) lấy 20 ml phần nổi phía trên sau khi ly tâm, cho vào bình định mức 200 ml (5.16) và pha loãng bằng nước cất (độ pha loãng 10 lần). Chuyển 200 ml dịch huyền phù đã pha loãng vào bình cầu đáy tròn (5.17) và chưng cất bằng hệ thống chưng cất hơi nước (5.5). Thu lấy dịch chưng cất vào bình định mức 200 ml (5.16), pha loãng bằng nước cất và đo hàm lượng etanol bằng máy đo tỷ trọng (5.6) ở 20 °C ± 0,01 °C (độ không đảm bảo đo tuyệt đối đối với dung dịch etanol 5 % là 0,05 %). Ngoài ra, có thể xác định hàm lượng etanol của dịch lên men bằng cốc đo tỷ trọng.

6.1.3  Lên men xirô cây phong

Xác định hàm lượng chất rắn hòa tan (độ Brix) của mẫu thử. Pha loãng mẫu thử trong bình lên men (5.2) bằng nước đến thể tích 0,6 L hoặc nhiều hơn một chút để thu được mẫu pha loãng đạt khoảng 12 °Bx (tốc độ lên men tối ưu khi độ Brix đạt 12 °Bx ± 1 °Bx). Thêm 3 g nấm men khô (4.1) và đồng hóa bằng cách lắc. Đóng bộ phận bẫy của bình lên men để tránh không khí xâm nhập. Để dịch lên men ở 20 °C cho đến khi tất cả lượng đường được chuyển hóa thành etanol. Kiểm tra sự kết thúc quá trình lên men đường bằng cách đo lượng đường còn lại bằng máy sắc ký lỏng hoặc quan sát phản ứng tạo màu. Ly tâm (5.4) dịch lên men. Xác định hàm lượng etanol của dịch lên men như trong 6.1.2.

6.1.4  Lên men đường mía

...

...

...

Bảo quản dịch lên men trong tủ lạnh, trước khi chưng cất, nếu cần. Bắt đầu chưng cất trong vòng 24 h sau khi kết thúc quá trình lên men.

6.2  Chưng cất etanol trong dịch lên men

Đặt 3 viên đá bọt (4.5) (để tránh tạo bọt) vào bình chưng cất của thiết bị chưng cất (5.7). Cân bình rỗng (W_B0). Cho ít nhất 400 ml dịch lên men (V) đã đồng hóa vào bình và cân lại (W_B1). Tính khối lượng của dịch lên men được thêm vào bình, W_J, biểu thị bằng gam (g), theo Công thức (2) như sau:

W_J = W_B1 - W_B0

(2)

Trong đó:

W_B0  là khối lượng bình rỗng, tính bằng gam (g);

W_B1  là khối lượng bình chứa dịch lên men đã đồng hóa, tính bằng gam (g).

Bật máy tuần hoàn nước trong bình ngưng của thiết bị chưng cất (5.7). Lắp bình nón có khớp nối cổ thủy tinh mài 125 ml đã được cân trước (W_E0) để thu dịch chưng cất. Gắn bình cầu đáy tròn chứa dịch lên men với cột cadiot và gia nhiệt đến sôi. Khi dịch lỏng sôi hồi lưu, bật môtơ quay và đợi 5 min để đạt được trạng thái cân bằng.

...

...

...

CHÚ THÍCH: Quá trình chưng cất kéo dài khoảng 4 h. Thông thường, có thể thu hồi 98 % đến 98,5 % etanol trong dịch lên men, dịch chưng cất có hàm lượng etanol trong dải từ 91 % đến 93 % (khối lượng) [93 % đến 95 % (thể tích)].

Cân bình chứa dịch chưng cất (W_E1) và tính khối lượng chính xác của dịch chưng cất, W_D, biểu thị bằng gam (g), theo Công thức (3) như sau:

W_D = W_E1 - W_E0

(3)

Trong đó:

W_B0  là khối lượng bình định mức rỗng, tính bằng gam (g);

W_B2  là khối lượng bình chứa dịch chưng cất, tính bằng gam (g).

Làm nguội bình cầu đáy tròn chứa phần còn lại của dịch lên men và cân (W_B2). Tính khối lượng phần còn lại của dịch lên men (phần nước trong dịch lên men), W_R, biểu thị bằng gam (g), theo Công thức (4) như sau:

W_R = W_B2 - W_B0

...

...

...

Trong đó:

W_B0  là khối lượng bình cầu rỗng, tính bằng gam (g).

W_B2  là khối lượng bình cầu chứa phần còn lại của dịch lên men, tính bằng gam (g).

Bảo quản dịch chưng cất trong chai thủy tinh (khoảng trống trong chai càng ít càng tốt) có nắp đậy Teflon. Bình phải được đậy kín khí để tránh phân tách đồng vị (do bay hơi). Sau mỗi lần chưng cất, làm sạch cột cadiot của thiết bị chưng cất bằng cách thổi khí nitơ hoặc không khí khô trong 10 min để loại bỏ etanol dư.

6.3  Xác định hàm lượng etanol của dịch chưng cất

6.3.1  Tính hàm lượng etanol của dịch chưng cất

Cân khoảng 0,25 ml dịch chưng cất (m₂), chính xác đến 0,1 mg. Xác định lượng nước trong dịch chưng cất (m₁) bằng bộ chuẩn độ Karl Fischer (5.8).

Hàm lượng etanol của dịch chưng cất, t, biểu thị bằng phần trăm khối lượng, tính theo Công thức (5) như sau:

...

...

...

Trong đó:

m₁  là khối lượng nước trong dịch chưng cất đo được, tính bằng gam (g);

m₂  là khối lượng dịch chưng cất sử dụng trong phương pháp Karl Fisher, tính bằng gam (g).

6.3.2  Tính khối lượng hao hụt trong quá trình chưng cất

Hao hụt khối lượng trong quá trình chưng cất, W_L, biểu thị bằng gam (g), tính theo Công thức (6) như sau:

W_L = W_J - (W_D + W_R)

(6)

Trong đó:

W_J  là khối lượng của dịch lên men đem chưng cất tính theo Công thức (2), tính bằng gam (g);

...

...

...

W_R  là khối lượng phần còn lại của dịch lên men tính theo Công thức (4), tính bằng gam (g).

6.3.3  Tính hiệu suất chưng cất

Hiệu suất chưng cất, C, biểu thị bằng phần trăm khối lượng, tính theo Công thức (7) như sau:

(7)

Trong đó:

t  là hàm lượng etanol của dịch chưng cất tính theo Công thức (5), tính bằng phần trăm khối lượng (%):

t_Q  là hàm lượng etanol của dịch lên men (xem 6.1.2), tính bằng phần trăm thể tích (%).

W_D  là khối lượng chính xác của dịch chưng cất tính theo Công thức (3), tính bằng gam (g);

...

...

...

Hiệu suất chưng cất phải ≥ 96 %, trong khi đó tỷ số đồng vị của etanol trong dịch chưng cất bị thay đổi do có sự phân tách đồng vị đáng kể trong quá trình chưng cất. Cần tuân thủ nghiêm ngặt các điều kiện để đạt hiệu suất chưng cất cao và hàm lượng etanol cao nhằm giữ cho sự phân tách đồng vị ở mức tối thiểu. Có thể đạt được các yêu cầu này bằng cách sử dụng hệ thống chưng cất (6.7) tự động hóa.

6.3.5  Tính hao hụt khối lượng tương đối

Hao hụt khối lượng tương đối, R_WL, biểu thị bằng phần trăm khối lượng, theo Công thức (8) như sau:

(8)

Trong đó:

W_L  là khối lượng hao hụt của dịch chưng cất tính theo Công thức (6), tính bằng gam (g);

W_J  là khối lượng của dịch lên men tính theo Công thức (2), tính bằng gam (g).

Hao hụt khối lượng tương đối > 0,5 % cho thấy hao hụt bất thường trong bước chưng cất (ví dụ: rò rỉ trong hệ thống chưng cất hoặc sai số khi cân).

...

...

...

6.4.1  Khái quát

Đồng vị ¹³C của etanol được xác định bằng hai phương pháp (6.4.2 và 6.4.3), các phương pháp này đốt cháy mẫu etanol trước khi phân tích đồng vị cacbon bền. Các phương pháp được sử dụng cần đảm bảo mẫu etanol được chuyển đổi hoàn toàn thành cacbon dioxit mà không bị hao hụt etanol do bay hơi, phù hợp cho việc chuẩn bị cacbon dioxit để phân tích đồng vị.

6.4.2  Phương pháp dòng chảy liên tục dựa trên việc sử dụng máy phân tích nguyên tố kết hợp máy đo khối phổ

Cho chạy chất chuẩn làm việc thể rắn (dạng viên) ở các khoảng đều nhau trong dãy xác định, nên dùng axit glutamic làm chất chuẩn. Thực hiện với chất chuẩn làm việc dạng viên vào thời điểm bắt đầu và kết thúc dãy phép xác định. Kiểm tra độ sạch của viên chất chuẩn, kìm và khay. Dùng đầu cong của kìm lấy một viên có kích thước vừa đủ. Sử dụng pipet 20 μl (5.12) đưa một lượng dịch lỏng cần thiết vào trong viên chất chuẩn, giữ bằng kìm chuyên dụng. Chuẩn bị hai viên chất chuẩn cho mỗi mẫu thử và mẫu chuẩn. Nếu nghi ngờ về độ kín của viên chất chuẩn thì phải chuẩn bị lại. Etanol là hợp chất dễ bay hơi, do vậy cần cẩn thận trong quá trình làm kín viên chất chuẩn có chứa etanol. Đặt viên chất chuẩn vào khoang mẫu tự động của máy phân tích vi mô ở vị trí thích hợp được đối chiếu theo số thứ tự.

CHÚ THÍCH 1: Lấy khoảng 3,8 mg etanol tuyệt đối hoặc 4,2 mg dịch chưng cất có hàm lượng etanol 92 % (khối lượng) cần để thu được 2 mg cacbon. Tính lượng dịch chưng cất thích hợp bằng cách tương tự theo lượng cacbon cần thiết (phụ thuộc vào đặc tính của máy đo khối phổ).

CHÚ THÍCH 2: Khi sử dụng bộ bơm chất lỏng, thì không cần xem xét đến quy trình nén chất rắn.

Kiểm tra áp suất của máy đo điện áp, bằng cách chỉnh đầu ra của bình khí nén, kiểm tra nhiệt độ lò theo quy định kỹ thuật của nhà sản xuất.

Kiểm tra độ rò rỉ trong hệ thống EA-IRMS (ví dụ: bằng cách theo dõi dòng ion m/z 28 tương ứng với N₂).

Chỉnh máy IRMS (5.9) để đo cường độ của dòng ion m/z 44, m/z 45 và m/z 46.

...

...

...

Đặt các mẫu chất chuẩn dạng viên vào máy phân tích và bắt đầu đo (đốt cháy thành cacbon dioxit và phân tích).

Thao tác máy đo khối phổ theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

6.4.3  Phương pháp gián tiếp dựa trên việc đốt cháy gián tiếp etanol và đo hai ống dẫn

Sử dụng máy phân tích nguyên tố tự động và dùng hệ thống hộp bẫy mẫu tự động trong cùng một quy trình làm việc nêu trong 6.4.2.

Chuyển hàm lượng cacbon của mẫu thành cacbon dioxit như sau:

- Hệ thống đốt cháy khép kín được làm đầy khí ôxy đối lưu;

- Bật máy phân tích nguyên tố có dòng khí heli/ôxy;

- Đậy kín ống thủy tinh đã được làm đầy đồng ôxit làm chất ôxy hóa, nhưng cẩn thận để tránh hình thành đồng cacbonat.

Sau khi etanol chuyển thành cacbon dioxit, cố định vật chứa mẫu vào hệ thống dẫn và tiến hành phân tích đồng vị cacbon. Đưa cacbon dioxit vào máy đo khối phổ bằng hệ thống dẫn kép sao cho dòng ion của mẫu có thể được so sánh với dòng ion của cacbon dioxit chuẩn đã hiệu chuẩn trước bằng chuẩn cacbonat. Vận hành máy đo khối phổ theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

...

...

...

Trước tiên, kiểm tra hệ thống bằng cách đốt cháy chất chuẩn quốc tế (4.4) và chỉnh các kết quả tiếp theo về giá trị δ¹³C được chấp nhận hoặc cho các kết quả thu được đối với ba phép xác định độc lập của chuẩn quốc tế, để chuẩn hóa các kết quả. Tỷ lệ khối lượng/diện tích của cacbon dioxit có thể được xác định bằng cách sử dụng thiết bị (như máy tích phân) để đo diện tích của pic cacbon dioxit tương ứng [thường đo được bằng máy phân tích khí (catharometer)].

CHÚ THÍCH 1: Kiểm tra để đảm bảo giá trị δ¹³C đối với chất chuẩn làm việc không lệch quá 0,5 ‰ giá trị chuẩn, nếu lệch, bật lại máy đo khối phổ.

CHÚ THÍCH 2: Đối với từng mẫu thử, kiểm tra lặp lại hai giá trị trong mỗi lần chạy liên tiếp. Nếu chênh lệch giữa hai mẫu ≤ 0,3 ‰ thì chấp nhận phép đo, kết quả cuối cùng cho một mẫu nhất định là trung bình của hai mẫu dạng viên. Nếu độ chệch > 0,3 ‰ thì lặp lại phép đo.

CHÚ THÍCH 3:C kiểm tra chất chuẩn làm việc và các mẫu etanol, biên độ tín hiệu được duy trì trong dải thích hợp theo hướng dẫn của nhà sản xuất máy đo khối phổ (biên độ thấp hơn có thể cho thấy sự bay hơi của etanol do chưa hàn kín mẫu).

CHÚ THÍCH 4: Trong trường hợp đo trực tiếp, hiệu chỉnh giá trị δ¹³C của mẫu theo chênh lệch giữa giá trị δ¹³C của chuẩn làm việc và giá trị thực, được xác định trước theo chuẩn gốc. Hiệu chỉnh độ chệch thường được tiến hành tự động bằng phần mềm của thiết bị. Độ trôi có thể được coi là độ tuyến tính giữa hai phép đo chuẩn làm việc δ¹³C. Đo chuẩn làm việc ở thời điểm bắt đầu và thời điểm kết thúc dãy mẫu. Tiến hành hiệu chỉnh từng mẫu theo phép nội suy tuyến tính giữa hai giá trị của chênh lệch (giữa giá trị khác biệt của chuẩn làm việc và của các phép đo). Ví dụ về hiệu chỉnh nêu trong Hình 2. Giá trị tham chiếu với giá trị δ¹³C (‰). Trong ví dụ này, giá trị thực chấp nhận được của chuẩn làm việc (WS) là - 20,2 ‰.

Hình 2 - Ví dụ về hiệu chỉnh độ trôi

7  Tính kết quả

Giá trị của thành phần đồng vị cacbon 13 (δ¹³C) biểu thị bằng phần nghìn (‰) theo chuẩn gốc V.PDB, được tính theo Công thức (9) như sau:

...

...

...

(9)

Trong đó:

R₁  là tỷ số đồng vị ¹³C/¹²C của mẫu thử (xem 6.4);

R₀  là tỷ số đồng vị ¹³C/¹²C của chuẩn V.PDB (trong trường hợp này, R₀ = 0,0112372).

8  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo kết quả phải bao gồm các thông tin sau:

- mọi thông tin cần thiết để nhận biết mẫu thử (loại mẫu, nguồn gốc mẫu, ký hiệu);

- viện dẫn tiêu chuẩn này;

- ngày và loại quy trình lấy mẫu (nếu có);

...

...

...

- ngày thử nghiệm;

- các kết quả thử và đơn vị biểu thị;

- mọi thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc tùy chọn có thể ảnh hưởng đến kết quả.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm xác định δ¹³C của etanol trong nước quả và xirô cây phong bằng phương pháp IRMS

Các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm về độ chụm của phương pháp được nêu trong Bảng A.1.

Bảng A.1 - Kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm về giá trị δ¹³C

...

...

...

Nước cam^a

Nước cam và đường mía

Nước táo và đường mía

Xirô cây phong và đường mía

Nước dứa và đường từ củ cải đường

Đường mía

Đường được bổ sung, %

_b

16^c

...

...

...

26^c

41^c

_b

Giá trị δ¹³C trung bình^a, ‰

- 26,67

- 24,36

- 20,44

- 20,73

- 20,0

...

...

...

Số phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ

12

12

10

12

11

12

Độ lệch chuẩn lặp lại, s_r, ‰

0,10

...

...

...

0,06

0,12

0,08

0,16

Độ lệch chuẩn tái lập, s_R, ‰

0,22

0,22

0,23

0,17

...

...

...

0,26

Độ lặp lại, r (= 2,8 × s_r)

0,28

0,21

0,17

0,32

0,22

0,46

Độ tái lập, R (= 2,8 × s_R)

...

...

...

0,62

0,65

0,49

0,65

0,73

^a tỷ số ¹³C/¹²C của etanol thu được từ nước quả và xirô cây phong xác định bằng IRMS, biểu thị bằng δ¹³C so với chuẩn cacbonat V.PDB.

^b cặp mẫu mù.

^c cặp Youden.

...

...

...

[1] AOAC International (2004), AOAC 2004.01, Carbon stable Isotope Ratio of Ethanol Derived from Fruit Juices and Maμle Syrups. Isotope Ratio Mass Spectrometry (IRMS)

[2] International Fruit Juice Union (2001), Method No. 8, Determination of Soluble Solids (Indirect Method by Refractometry), IFU, Paris, France

[3] Craig, H. (1957) Geochim. Cosmochim. Acta 12, 133-149

1) V.PDB: Vienna Pee Dee Belemnite.

2) NBS 22 là chất chuẩn NIST 8539 của Viện Tiêu chuẩn và Công nghệ quốc gia Hoa Kỳ hoặc chất chuẩn tương đương của Cơ quan Năng lượng Nguyên từ Quốc tế (IAEA). Thông tin đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng chúng. Có thể sử dụng các sản phẩm khác nếu cho các kết quả tương đương.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 13815:2023 về Nước quả - Xác định tỷ số đồng vị cacbon bền (13c/12c) của etanol - Phương pháp đo khối phổ tỷ số đồng vị