Trong đó

A là giá trị độ hấp thụ được ghi lại;

c là nồng độ của dung dịch NADH, tính bằng milimol trên lít (mmol/L);

d là chiều dài đường quang, tính bằng xentimet (cm).

Tính hệ số hấp thụ, ε, của NADH từ ba dung dịch và lấy giá trị trung bình.

CHÚ THÍCH Các thuốc thử có bán sẵn ở dạng kít thử:

Để xác định trong thời gian ngắn, nên sử dụng một số thuốc thử đã chuẩn bị sẵn ở dạng kít thử ví dụ từ: Boehringer Mannheim. Những bộ kít này bao gồm ba dung dịch:

dung dịch đệm pH 8,0 có chứa NADH;

huyền phù NADH-POD;

...

...

...

Việc sử dụng các thuốc thử này cần điều chỉnh nhỏ về thể tích được sử dụng trong phép thử và phép tính cuối cùng. Những thay đổi này được nêu trong hướng dẫn sử dụng kít thử.

3.7  Chất trợ lọc, ví dụ: Clarcel Flo-TR 1), sử dụng cho các loại đường dạng bột có chứa chất chống đông vón.

4  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

4.1  Máy đo quang phổ, đọc ở bước sóng 340 nm (đèn quang phổ liên tục) hoặc ở bước sóng 334 nm (đèn hơi thủy ngân).

4.2  Cuvet, chiều dài đường quang 1 cm, tốt nhất là bằng thạch anh.

4.3  Micropipet, có thể phân phối các thể tích 10, 20, 50 và 100 μL tốt nhất là pipet tự động có đầu tip tương ứng.

4.4  Đồng hồ bấm giây.

4.5  Màng lọc, cỡ lỗ 0,45 μm, đường kính 50 mm.

...

...

...

4.6  Giá đỡ và khung màng lọc, giá đỡ bộ lọc tốt nhất được gắn với bộ đỡ bằng thép không gỉ.

5  Lấy mẫu

Mẫu phòng thử nghiệm nhận được phải là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 4837^[1].

6  Cách tiến hành

6.1  Chuẩn bị mẫu thử

Đối với các loại đường, sử dụng dung dịch chứa 40 g đường, hòa tan trong nước để có thể tích cuối cùng là 100 mL. Đối với dạng xirô có hàm lượng sulfit từ 15 mg/kg đến 150 mg/kg, pha loãng mẫu với nước cất theo tỷ lệ 1 : 5, ví dụ 100 g trong 500 mL. Lượng sulfit trong cuvet khi sử dụng máy đo quang phổ nằm trong khoảng từ 3 μg đến 30 μg.

CHÚ THÍCH Với đường bột có chứa chất chống vón cục, thêm 0,2 g chất trợ lọc (3.7) vào 40 g mẫu, hòa tan, thêm nước đến 100 mL và sau đó lọc trên bộ lọc màng. Sử dụng dịch lọc cho phép thử tiếp theo.

6.2  Phép xác định

...

...

...

Dùng pipet lấy các thể tích theo Bảng 1 cho vào các cuvet 1 cm tương ứng.

Bảng 1 - Chuẩn bị dung dịch thử và dung dịch mẫu trắng

Cuvet B (mẫu trắng), mL

Cuvet S (mẫu thử), mL

Đường

Xirô

Dung dịch đệm (3.2)

1,00

...

...

...

1,00

Dung dịch NADH (3.3)

0,10

0,10

0,10

NADH peroxidase (3.4)

0,01

0,01

0,01

...

...

...

-

2,00

0,20

Nước cất

2,00

-

1,80

Làm kín các cuvet bằng màng chất dẻo và trộn nhẹ nhàng bằng cách đảo chiều cuvet. Sau khoảng 5 min, đo độ hấp thụ ở bước sóng đã chọn (334 nm hoặc 340 nm) so với không khí (không đặt cuvet trong đường quang), thu được độ hấp thụ của mẫu trắng, A_1B và của mẫu thử, A_1s.

Thêm 0,05 mL huyền phù sulfit oxidase (3.5) vào mỗi cuvet và trộn lượng chứa trong cuvet như ở trên. Sau 30 min đọc lại độ hấp thụ: độ hấp thụ của mẫu trắng, A_2B và của mẫu thử, A_2s.

...

...

...

7  Tính và biểu thị kết quả

Tính chênh lệch độ hấp thụ của mẫu trắng, A_B, theo Công thức (2):

A_B = A_1B - A_2B

(2)

trong đó:

A_1B là độ hấp thụ của mẫu trắng trước khi bổ sung sulfit oxidase;

A_2B là độ hấp thụ của mẫu trắng sau khi bổ sung sulfit oxidase.

Tính chênh lệch độ hấp thụ của mẫu thử, A_s, theo Công thức (3):

A_s = A_1s - A_2s (3)

...

...

...

A_1S là độ hấp thụ của mẫu thử trước khi bổ sung sulfit oxidase;

A_2S là độ hấp thụ của mẫu thử sau khi bổ sung sulfit oxidase.

Tính chênh lệch độ hấp thụ của mẫu thử sau khi hiệu chỉnh theo mẫu trắng, A theo Công thức (4):

A = A_S - A_B

(4)

Tính nồng độ sulfit của dung dịch thử, dưới dạng lưu huỳnh dioxit (SO₂), biểu thị theo miligam trên mililit (mg/mL) theo Công thức (5):

(5)

trong đó:

...

...

...

MW là khối lượng phân tử của lưu huỳnh dioxit, tính bằng gam (ở đây là 64,06 g);

ε là hệ số tắt phân tử ở bước sóng đã chọn, cụ thể là:

6,18 Lmmol^-1.cm^-1 ở bước sóng 334 nm;

6,30 L.mmol^-1.cm^-1 ở bước sóng 340 nm

(các giá trị này có thể được kiểm tra bằng một mẫu sulfit);

d là chiều dài đường quang của cuvet, tính bằng cm (d = 1 cm);

v là thể tích mẫu thử trong cuvet, tính bằng mililit (mL), v = 2,00 mL đối với đường hoặc v = 0,20 mL đối với xirô.

Đối với mẫu đường, nồng độ sulfit của dung dịch thử được tính theo Công thức (6):

...

...

...

Đối với mẫu xirô, nồng độ sulfit của dung dịch thử được tính theo Công thức (7):

(7)

Để thu được kết quả cuối cùng, nhân các kết quả trên với hệ số pha loãng được sử dụng khi chuẩn bị mẫu thử.

CHÚ THÍCH Việc sử dụng các bộ kít chuẩn bị sẵn có thể cần thay đổi thể tích và phép tính nêu trên. Các thay đổi này sẽ được quy định trong hướng dẫn sử dụng kít thử.

8  Độ chụm

Các giá trị độ chụm dưới đây được xác định từ dữ liệu phân tích liên phòng thử nghiệm đối với đường trắng chứa hàm lượng sulfit từ 4,02 mg/kg đến 23,84 mg/kg. Các giá trị độ chụm này có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ và nền mẫu khác với dải nồng độ và nền mẫu đã sử dụng.

8.1  Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm độc lập, đơn lẻ, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp, trên vật liệu thử giống hệt nhau, trong cùng một phòng thử nghiệm, do cùng một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, trong cùng một khoảng thời gian ngắn, không quá 5 % các trường hợp lớn hơn giới hạn lặp lại rtừ 1,17 mg/kg đến 6,49 mg/kg, với độ lặp lại trung bình là 4,46 mg/kg.

...

...

...

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm đơn lẻ, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp, trên vật liệu thử giống hệt nhau, trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do những người khác nhau thực hiện, sử dụng thiết bị khác nhau, không quá 5 % các trường hợp lớn hơn giá trị giới hạn tái lập R từ 1,74 mg/kg đến 14,58 mg/kg, với độ tái lập trung bình là 7,32 mg/kg.

9  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ít nhất bao gồm các thông tin sau:

- mọi thông tin cần thiết cho việc nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

- phương pháp lấy mẫu, nếu biết;

- phương pháp thử, viện dẫn tiêu chuẩn này;

- mọi điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được xem là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả;

- kết quả thử nghiệm thu được hoặc nếu kiểm tra độ lặp lại, thì nêu kết quả cuối cùng thu được.

...

...

...

[1] TCVN 4837, Đường - Lấy mẫu

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 13610:2023 về Đường và sản phẩm đường - Xác định hàm lượng sulfit trong các sản phẩm đường tinh luyện bằng phương pháp enzym