4  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

4.1  Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao, gồm bộ phận bơm dung môi, bộ bơm mẫu tự động, detector UV-Vis.

4.2  Cột phân tích, C18 (4,6 mm x 150 mm, cỡ hạt 3,5 µm, cỡ lỗ 80 Ǻ) và tiền cột tương ứng hoặc loại tương đương.

4.3  Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,01 mg.

4.4  Bể rung siêu âm

4.5  Máy trộn Vortex.

4.6  Máy đo pH, được hiệu chuẩn ở khoảng 4,1 và 7,0.

4.7  Máy ly tâm, có thể đạt tốc độ 5 000 r/min và ống ly tâm 50 ml, bằng nhựa có nắp kín.

...

...

...

4.9  Màng lọc xyranh, bằng PTFE, kích thước 13 mm, cỡ lỗ 0,2 µm.

4.10  Lọ đựng mẫu cho HPLC, dung tích 2 ml, có nắp vặn được phủ teflon.

4.11  Xyranh, dung tích 3 ml.

4.12  Máy nghiền

5  Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này.

Mẫu phòng thử nghiệm nhận được phải đúng là mẫu đại diện và không thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

6  Cách tiến hành

6.1  Chuẩn bị mẫu thử

...

...

...

Đối với các mẫu rễ cây: nghiền nhỏ thành bột có thể qua sàng cỡ lỗ 80 mesh.

Đối với các mẫu viên nang cứng gộp riêng phần bột bên trong 20 viên, trộn đều.

Đối với các mẫu viên nén: lấy 20 viên, nghiền nhỏ thành bột mịn và trộn đều.

Cân khoảng 250 mg (± 20 mg) mẫu đã đồng nhất như trên, cho vào ống ly tâm 50 ml (4.7), thêm chính xác 20 ml dung môi chiết (3.8), đậy kín nắp và trộn Vortex trong 10 s rồi đem rung siêu âm trong 10 min, trộn Vortex thêm 10 s. Sau đó, cho ly tâm ở tốc độ 5 000 r/min trong 5 min. Pha loãng 200 µl dịch lỏng phía trên với 800 µl dung môi pha loãng (3.9) trong lọ đựng mẫu HPLC (4.10).

6.1.2  Đối với các mẫu dạng lỏng

Lấy chính xác 1,00 ml mẫu dạng lỏng đã lắc đều, cho vào bình định mức 10 ml (4.8), thêm dung môi pha loãng (3.9) đến vạch và lắc đều. Dịch thu được đem lọc qua màng lọc 0,2 µm (4.9) cho vào lọ đựng mẫu HPLC (4.10).

6.2  Điều kiện vận hành HPLC

- Pha động: Phối hợp kênh A và B

- Detector: PDA hoặc UV-Vis, bước sóng 230 nm;

...

...

...

- Tốc độ dòng: 0,75 ml/min;

- Nhiệt độ buồng cột: 40 °C.

CHÚ THÍCH: Các thông số về tỷ lệ pha động, thể tích mẫu bơm, tốc độ dòng, nhiệt độ buồng cột có thể được điều chỉnh tùy thuộc vào điều kiện thực tế của thiết bị HPLC được sử dụng.

6.3  Kiểm tra sự ổn định của hệ thống

Cân bằng hệ thống bằng dung môi pha động (3.7) ít nhất 10 min đến khi đường nền ổn định, sau đó bơm lặp lại năm lần, mỗi lần 10 µl dung dịch chuẩn làm việc số 5 (3.10.6). Hệ thống được cho là thích hợp nếu:

- Hệ số dung lượng (k’) đối với hydrastin là không nhỏ hơn 1,0:

- Độ phân giải giữa palmatin và berberin là ≥ 1,0;

- Độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic cho hydrastin và berberin ≤ 2,0 %;

- Hệ số kéo đuôi T của canadin ≤ 2,0;

...

...

...

6.4  Dựng đường chuẩn

Sau khi thiết bị đã ổn định, tiến hành bơm lần lượt các dung dịch chuẩn làm việc (3.10.6) vào hệ thống HPLC (trừ dung dịch chuẩn làm việc số 6).

Xác định diện tích pic, dựng đường chuẩn dựa vào diện tích pic và nồng độ của dung dịch chuẩn làm việc tương ứng, với hệ số R² ≥ 0,995.

6.5  Xác định

Bơm mẫu thử đã chuẩn bị (xem 6.1) vào hệ thống HPLC với cùng điều kiện như bơm dung dịch chuẩn, xác định diện tích các pic.

7  Tính kết quả

Hàm lượng chất phân tích trong mẫu thử, X, biểu thị bằng phần trăm khối lượng, được tính theo Công thức (1):

                   (1)

Trong đó:

...

...

...

D  là hệ số pha loãng;

V  là thể tích dung môi chiết, tính bằng mililit (ml);

W  là khối lượng mẫu phân tích đã cân, tính bằng miligam (mg).

8  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin sau đây:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu, nếu biết;

c) phương pháp thử, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được xem là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả;

...

...

...

f) nếu kiểm tra độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm

Bảng A.1 - Kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm xác định hydrastin và berberin trong các mẫu nguyên liệu và thực phẩm bảo vệ sức khỏe chứa Hydrastis canadensis

Mẫu ^a

Hydrastin

Berberin

...

...

...

s_R

RSD_R
(%)

HorRat

g/100g

s_R

RSD_R
(%)

HorRat

LPP-01-E01

3,03

...

...

...

4,38

1,29

2,86

0,196

6,86

2,01

LPP-01-E02

2,63

0,0703

...

...

...

0,44

2,71

0,153

5,66

1,64

LPP-01-E03

0,181

0,0103

5,75

...

...

...

0,175

0,0118

6,86

1,32

LPP-01-E04

2,45

0,0931

3,80

1,09

...

...

...

0,195

6,22

1,85

LPP-01-E05

3,01

0,176

5,86

1,73

3,05

...

...

...

7,17

2,12

LPP-01-E06

3,58

0,180

5,03

1,53

2,83

0,205

...

...

...

2,12

LPP-01-E07

2,32

0,154

6,65

1,89

3,09

0,204

6,62

...

...

...

LPP-01-E08

4502 ^b

203

4,52

1,00

6021

462

7,68

1,78

...

...

...

LLP-01-E02: dạng nang cứng chứa cao chiết rễ Hydrastis canadensis 250 mg/viên

LLP-01-E03: dạng nang cứng chứa cao chiết rễ cây Echinacea purpurea (680 mg) và cao chiết rễ Hydrastis canadensis (100 mg)

LLP-01 -E04: Bột rễ Hydrastis canadensis

LLP-01-E05 và LLP-01-E06: Bột rễ Hydrastis canadensis được nghiền rây qua sàng cỡ lỗ 80 mesh

LLP-01-E07: Bột rễ Hydrastis canadensis

LLP-01-E08: Dạng dịch chiết Hydrastis canadensis trong etanol

^b Đơn vị là µg/g. Kết quả ban đầu của phòng thử nghiệm được tính dưới dạng µg/mL và được chuyển đổi thành µg/g với tỉ trọng là 0,908 g/ml.

s_r là độ lệch chuẩn lặp lại;

s_R là độ lệch chuẩn tái lập;

...

...

...

RSD_R là độ lệch chuẩn tương đối tái lập.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12626:2019 về Thực phẩm bảo vệ sức khỏe có chứa Hydrastis canadensis - Xác định hàm lượng hydrastin và berberin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector UV