Nồng độ của aflatoxin phải xấp xỉ 10 µg/ml.

3.15.2  Dung dịch chuẩn AF trung gian, 400 ng/ml (hỗn hợp của AFB₁, AFB₂, AFG₁, AFG₂ ở nồng độ lần lượt 200, 50, 100 và 50 ng/ml)

Thêm một lượng tương ứng thích hợp của các dung dịch chuẩn gốc (3.15.1) vào bình định mức và pha loãng đến vạch bằng axetonitril.

Dùng dung dịch chuẩn AF trung gian 400 ng/ml làm dung dịch thêm chuẩn trong nghiên cứu độ thu hồi Bảo quản các dung dịch chuẩn gốc ở âm 18 °C. Đưa về nhiệt độ phòng trước khi sử dụng.

3.15.3  Dung dịch AF chuẩn làm việc

Chuẩn bị sáu dung dịch chuẩn làm việc trong bình định mức 10 ml theo Bảng 2. Pha loãng với hỗn hợp metanol - nước (1+1, phần thể tích). Bảo quản trong tủ lạnh và đưa về nhiệt độ phòng trước khi sử dụng. Chuẩn bị dung dịch chuẩn làm việc trong ngày sử dụng.

Bảng 2 - Chuẩn bị các dung dịch aflatoxin chuẩn làm việc

Dung dịch chuẩn làm việc

Thể tích dung dịch chuẩn AF trung gian (3.15.2) cần lấy, µl

...

...

...

AFB₁

AFB₂

AFG₁

AFG₂

AF

1

0

0

0

...

...

...

0

0

2

12,5

0,25

0,0625

0,125

0,0625

0,5

...

...

...

25

0,5

0,125

0,25

0,125

1

4

50

1

...

...

...

0,5

0,25

2

5

100

2

0,5

1

0,5

...

...

...

6

200

4

1

2

1

8

3.16  Dung dịch chuẩn OTA

3.16.1  Dung dịch chuẩn gốc OTA, 30 µg/ml

...

...

...

Lấy 1 ml dung dịch OTA 100 µg/ml vừa chuẩn bị, cho vào bình định mức 3 ml và pha loãng đến vạch bằng metanol. Xác định độ hấp thụ ở 333 nm. Sử dụng hệ số hấp thụ mol là 6 330 để tính nồng độ tương tự 3.15.1. Nồng độ của dung dịch phải xấp xỉ 30 µg/ml. Bảo quản dung dịch chuẩn gốc ở -18 °C. Đưa về nhiệt độ phòng trước khi sử dụng.

3.16.2  Dung dịch chuẩn OTA trung gian, 200 ng/ml

Thêm một lượng thích hợp dung dịch chuẩn gốc OTA (3.16.1) vào bình định mức 25 ml và pha loãng đến vạch với metanol.

3.16.3  Dung dịch chuẩn OTA làm việc

Chuẩn bị 6 dung dịch chuẩn làm việc trong bình định mức 10 ml theo Bảng 3. Pha loãng với metanol- nước (1 + 1, phần thể tích). Bảo quản trong tủ lạnh và đưa về nhiệt độ phòng trước khi sử dụng. Chuẩn bị dung dịch chuẩn làm việc trong ngày sử dụng.

Bảng 3 - Chuẩn bị dung dịch ochratoxin A chuẩn làm việc

Dung dịch chuẩn làm việc

Thể tích dung dịch chuẩn OTA trung gian (3.16.2) cần lấy, µl

Nồng độ ochratoxin A của dung dịch chuẩn làm việc, ng/ml

...

...

...

0

0

2

12,5

0,25

3

25

0,5

4

...

...

...

1

5

100

2

6

200

4

3.17  Pha động của AF cho dẫn xuất sau cột với bộ PHRED

Hỗn hợp nước - metanol - axetonitril (600+250+150, phần thể tích). Đẳng dòng, tốc độ 0,8 ml/min.

...

...

...

Pha 1 L hỗn hợp gồm nước - metanol - axetonitril (3.17) với 350 µl dung dịch axit nitric 4 M (nồng độ axil nitric đặc là 15,9 M) và 120 mg kali bromua, trộn đều. Đẳng dòng, tốc độ 0,8 ml/min

3.19  Pha động của OTA

Axetonitril - nước - axit axetic (500+500+10, phần thể tích). Đẳng dòng, tốc độ 1,0 ml/min.

4  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

4.1  Máy lắc ngang, có thể lắc đến 400 r/min, ví dụ sử dụng loại VWR DS-500E (VWR International, Bridgeport, NJ, Hoa Kỳ) hoặc tương đương.

4.2  Ong ly tâm bằng nhựa polypropylen, dung tích 50 ml.

4.3  Máy ly tâm, ví dụ: loại Allegra X-22R (VWR International) hoặc tương đương.

4.4  Giấy lọc vi sợi thủy tinh, ví dụ: loại Whatman số 934AH, 11 cm (Whatman, Inc., Clifton, NJ) hoặc tương đương.

...

...

...

Cột ái lực miễn nhiễm AF/OTA có chứa các kháng thể đơn dòng liên kết được với aflatoxin B₁, B₂, G₁, G₂ và các kháng thể đơn dòng liên kết được với OTA. Các cột ái lực miễn nhiễm cần có dung lượng tối thiểu không nhỏ hơn 100 ng đối với aflatoxin tổng số và 100 ng đối với OTA và cần cho độ thu hồi của aflatoxin B₁, B₂, G₁, G₂ và OTA không nhỏ hơn 80 % khi thêm 5 ng của mỗi độc tố vi nấm vào 10 ml dung dịch metanol 10 % (thể tích) trong PBS (3.11). Các cột cần có hạn sử dụng là 18 tháng ở 4 °C và 12 tháng ở nhiệt độ phòng.

4.6  Phễu cột bằng polypropylen, có dung tích 50 ml với đầu gắn vào cột hoặc bơm thủy tinh 25 ml có đầu gắn với cột, hoặc tương đương.

4.7  Giá cột, ví dụ Vicam G1104 có 12 vị trí hoặc tương đương.

4.8  Hệ thống LC, hệ thống Waters 2690 Alliance Separation (Waters, Milford, MA), với detector huỳnh quang Waters 2475 hoặc các hệ thống LC tương đương.

Điều kiện phân tích như dưới đây cho thấy thích hợp:

Bảng 4 - Điều kiện phân tích các aflatoxin và ochratoxin A

Chất phân tích

Tốc độ dòng, ml/min

Bước sóng kích thích Ex, nm

...

...

...

Cột

AF

0,8

362

440

YMC ODS-AQ S-3, 4,6 mm x 150 mm (Waters) hoặc tương đương

OTA

1,0

333

...

...

...

Ultrasphere, 4,6 mm x 250 mm, 5 µm (Beckman Instruments) hoặc tương đương

4.9  Hệ thống dẫn xuất sau cột (PCD) dùng cho AF, có thể sử dụng một trong hai bộ dẫn xuất sau:

4.9.1  Bộ dẫn xuất PHRED: Bộ dẫn xuất quang hóa sau cột (ví dụ: của AURA Industries, New York, NY hoặc tương đương).

CHÚ THÍCH: Tránh nhìn vào đèn UV.

4.9.2  Bộ dẫn xuất Kobra: Bộ dẫn xuất điện hóa, dẫn xuất brom hóa sau cột (ví dụ của R-Biopharm Inc., Marshall, MI hoặc tương đương).

CHÚ THÍCH: Đặt dòng điện ở 100 µA, không bật điện trước khi bơm LC hoạt động để tránh quá nhiệt.

4.10  Bình định mức, dung tích 3 ml, 10 ml, 25 ml và 100 ml.

4.11  Ống đong, dung tích 25 ml.

4.12  Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg.

...

...

...

5  Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này.

Mẫu phòng thử nghiệm nhận được phải đúng là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc bị biến đổi chất lượng trong suốt quá trình bảo quản và vận chuyển.

6  Cách tiến hành

6.1  Chuẩn bị mẫu sơ bộ

Mẫu được xay nhỏ, trộn đều. Nên xay lượng mẫu đủ lớn (tối thiểu 0,5 kg) để đảm bảo tính đồng nhất.

6.2  Chiết

Cân 5 g mẫu thử vào ống ly tâm 50 ml (4.2). Thêm 1 g NaCl (3.4) và 25 ml dung môi chiết (3.14). Lắc bằng máy lắc xoáy (4.13) đến khi mẫu và dung môi được trộn đều. Sau đó, lắc bằng máy lắc ngang với tốc độ 400 r/min trong 10 min. Ly tâm trong 10 min ở tốc độ 7 000 r/min hoặc ở tốc độ có thể thu được cặn chắc. Hút ngay 7 ml cho vào ống ly tâm 50 ml, thêm 28 ml dung dịch PB 0,1 M (3.13), lắc và lọc qua giấy lọc vi sợi thủy tinh (4.4). Thu lấy 25 ml dịch lọc (tương đương với 1 g mẫu thử) vào ống đong 25 ml (4.11) và thực hiện ngay sắc ký ái lực miễn nhiễm (IAC) theo 6.3

6.3  Tách bằng cột ái lực miễn nhiễm

...

...

...

Tháo nắp đầu cột và nối với phễu (4.6). Tháo nắp cuối cột và nối với bộ hứng (phần nối phải chặt). Để chất lỏng trong cột chảy qua đến khi còn khoảng 2 mm đến 3 mm phía trên lớp nhồi cột. Cho 25 ml dịch lọc (xem 6.2) vào phễu. Để dịch lọc tự chảy qua cột đến khi cót khô. Để quá trình chảy qua cột dễ dàng, cần bỏ cột ra, thêm khoảng 2 ml dung dịch PBS 10 mM (3.11) vào cột, gắn lại phễu, rửa cột với 3 ml dung dịch PBS 10 mM nữa và sau đó rửa với 5 ml nước (có thể cho 5 ml dung dịch PBS 10 mM trực tiếp vào phễu nếu dùng kỹ thuật khác để loại bỏ bọt khí ở đầu cột cho dòng chảy dễ dàng). Để cột khô, sau đó đẩy 3 ml không khí qua cột bằng kim tiêm. Đặt bình định mức 3 ml (4.10) phía dưới cột. Rửa giải và thu lấy AF, OTA vào bình 3 ml với 1 ml metanol loại dùng cho HPLC (3.1). Để cột chảy tự do đến khô. Để yên 1 min và rửa giải thêm với 1 ml metanol, sau đó thu dịch vào cùng bình định mức trên. Để cột chảy đến khô vá đẩy 10 ml không khí qua cột. Pha loãng dịch rửa giải đến thể tích bằng nước và phân tích AF ngay bằng LC. Sau đó phân tích OTA bằng LC.

6.4  Phân tích sắc ký

6.4.1  Phân tích aflatoxin

Bơm 50 µl mẫu trắng thuốc thử (dung dịch chuẩn làm việc 1, xem Bảng 2), các dung dịch chuẩn làm việc (xem Bảng 2), hoặc dung dịch mẫu thử (xem 6.3) vào cột LC (4.8). Xác định các pic AF trong dịch chiết mẫu bằng cách so sánh thời gian lưu trong mẫu so với chuẩn. Các AF được rửa giải theo thứ tự AFG₂, AFG₁, AFB₂ và AFB₁. Sau khi qua bộ dẫn xuất PHRED (4.9.1) hoặc Kobra (4.9.2), AFG₁ và AFB₁ được dẫn xuất tạo thành AFG_2a (dẫn xuất của AFG₁) và AFB_2a (dẫn xuất của AFB₁). Cấu trúc hóa học của các dẫn xuất do quá trình brom hóa điện hóa và quá trình quang hóa là khác nhau. Thời gian lưu của AFG₂, AFG_2a, AFB₂ và AFB_2a từ 14 min đến 27 min nếu dùng bộ PHRED (Hình B.1) và thời gian lưu ngắn hơn nếu dùng bộ Kobra. Các píc cần phân giải khỏi nhau đến đường nền.

Dựng đường chuẩn cho từng aflatoxin theo diện tích pic (trục Y) của mỗi độc tố (từng AF) so với nồng độ (trục X, tính bằng ng/ml), sử dụng các dung dịch chuẩn aflatoxin làm việc (3.15.3). Đường chuẩn được dựng trước khi phân tích trên mẫu thử, sau đó kiểm tra lại độ tuyến tính. Nếu các tín hiệu diện tích nằm ngoài (cao hơn) dải hiệu chuẩn thì pha loãng dịch chiết đã làm sạch với hỗn hợp metanol- nước (1 + 1, phần thể tích) và bơm lại vào cột LC.

6.4.2  Phân tích ochratoxin

Bơm 50 µl mẫu trắng thuốc thử (dung dịch hiệu chuẩn 1), các dung dịch chuẩn làm việc hoặc mẫu thử vào cột LC. Xác định píc OTA trong dịch chiết mẫu bằng cách so sánh thời gian lưu với chất chuẩn. OTA rửa giải từ 10 min đến 11 min (Hình B.2). Có 1 píc nhỏ trước pic OTA khoảng 0,5 min trong nhân sâm.

Dựng đường chuẩn từ các dung dịch chuẩn OTA làm việc (3.16.3) theo diện tích pic (trục Y) của OTA so với nồng độ (trục X, tính bằng ng/ml). Đường chuẩn được dựng trước khi phân tích mẫu thử, sau đó kiểm tra lại độ tuyến tính. Nếu các tín hiệu diện tích nằm ngoài (cao hơn) dải hiệu chuẩn thì thực hiện pha loãng dịch chiết đã làm sạch với metanol-nước (1 + 1, phần thể tích) và bơm lại vào cột LC.

6.4.3  Định lượng các aflatoxin và ochratoxin

...

...

...

7  Tính kết quả

Tính hàm lượng của từng độc tố trong mẫu thử, X, biểu thị bằng microgam trên kilogam (µg/kg) theo Công thức (2):

                    (2)

Trong đó:

R  là diện tích píc thu được từ dung dịch mẫu thử;

S và a tương ứng là độ đốc và hệ số chặn của các đường chuẩn đã dựng (6.4.1 hoặc 6.4.2);

V  là thể tích cuối của dung dịch mẫu thử (xem 6.3), tính bằng mililit (ml);

F  là hệ số pha loãng. F = 1 khi V = 3 ml;

W  là khối lượng mẫu thử cho qua cột ái lực miễn nhiễm (1 g).

...

...

...

8  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin sau đây

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu, nếu biết;

c) phương pháp thử, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được xem là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được.

Phụ lục A

...

...

...

Kết quả thử nghiệm liên phòng

Bảng A.1 - Kết quả thử nghiệm liên phòng thử nghiệm đối với các aflatoxin và ochratoxin A trong mẫu bột nhân sâm bằng sắc ký lỏng có làm sạch bằng cột ái lực miễn nhiễm

Độc tố vi nấm^a

Nồng độ, µg/kg

Trung bình, µg/kg

Thu hồi trung bình, %

s_r, µg/kg

s_r, µg/kg

RSD_r, %

...

...

...

HorRat

0,22c

HorRat^b

Số phòng thử nghiệm

Số phòng có kết quả lạc

AFB₁

1

0,72

72

...

...

...

0,10

3,24

13,78

0,29

0,16

0,63

9

2

AFB₂

...

...

...

0,21

85

0,02

0,03

10,51

13,76

0,24

0,05

0,63

...

...

...

0

AFG₁

0,5

0,33

67

0,02

0,11

7,35

31,55

...

...

...

0,07

1,43

11

0

AFG₂

0,25

0,19

78

0,01

...

...

...

5,40

12,49

0,22

0,04

0,57

10

1

AF

2

...

...

...

74

0,04

0,20

2,64

13,91

0,33

0,32

0,63

9

...

...

...

OTA

1

0,92

92

0,06

0,09

6,76

9,37

0,20

...

...

...

0,43

10

1

AFB₁

2

1,37

68

0,14

0,31

...

...

...

22,51

0,52

0,30

1,02

11

0

AFB₂

0,5

0,38

...

...

...

0,02

0,03

6,39

8,93

0,17

0,08

0,41

10

1

...

...

...

1

0,67

67

0,07

0,19

10,10

28,87

0,60

0,15

...

...

...

11

0

AFG₂

0,5

0,36

72

0,01

0,06

3,79

...

...

...

0,33

0,08

0,79

10

1

AF

4

2,80

70

...

...

...

0,59

8,31

21,22

0,55

0,61

0,96

11

0

OTA

...

...

...

1,82

91

0,05

0,12

2,50

6,49

0,16

0,40

0,30

...

...

...

0

AFB₁

4

2,81

70

0,19

0,57

6,93

20,17

...

...

...

0,62

0,92

11

0

AFB₂

1

0,78

78

0,05

...

...

...

5,93

14,14

0,30

0,17

0,64

11

0

AFG₁

2

...

...

...

69

0,09

0,34

6,84

24,47

0,57

0,30

1,11

11

...

...

...

AFG₂

1

0,73

73

0,04

0,11

5,42

14,98

0,32

...

...

...

0,68

11

0

AF

8

5,65

71

0,34

1,08

...

...

...

19,04

0,55

1,24

0,87

11

0

OTA

4

3,42

...

...

...

0,15

0,19

4,46

5,53

0,15

0,75

0,25

11

0

...

...

...

8

5,54

69

0,21

1,09

3,84

19,76

0,57

1,22

...

...

...

10

1

AFB₂

2

1,62

81

0,07

0,14

4,43

...

...

...

0,20

0,36

0,39

10

1

AFG₁

4

2,74

69

...

...

...

0,69

6,71

25,34

0,65

0,60

1,15

10

1

AFG₂

...

...

...

1,45

73

0,11

0,25

7,64

17,25

0,40

0,32

0,78

...

...

...

0

AF

16

11,27

71

0,49

2,29

4,31

20,29

...

...

...

2,48

0,92

10

1

OTA

8

6,99

87

0,25

...

...

...

3,56

8,99

0,27

1,54

0,41

11

0

^a AF = aflatoxin (tổng của AFB₁ AFB₂ AFG₁ AFG₂); OTA = ochratoxin A

^b được tính dựa trên độ lệch chuẩn ước định của 0,22c

...

...

...

s_R là độ lệch chuẩn tái lập;

RSD_r là độ lệch chuẩn tương đối lặp lại;

RSD_R là độ lệch chuẩn tương đối tái lập;

Chú thích: Mẫu trắng được thấy có chứa < 0 1 µg/kg AF và OTA

Bảng A.2 - Kết quả thử nghiệm liên phòng thử nghiệm đối với các aflatoxin và ochratoxin A trong mẫu bột gừng bằng sắc ký lỏng sau làm sạch với cột ái lực miễn nhiễm

Độc tố vi nấm^a

Nồng độ, µg/kg

Trung bình, µg/kg

Thu hồi trung bình, %

...

...

...

s_R, µg/kg

RSD_r, %

RSD_R, %

HorRat

0,22c

HorRat^b

Số phòng thử nghiệm

Số phòng có kết quả lạc

AFB₁

...

...

...

0,88

88

0,06

0,07

6,39

7,71

0,17

0,19

0,35

...

...

...

1

AFB₂

0,25

0,22

90

0,02

0,02

7,55

7,94

...

...

...

0,05

0,36

10

1

AFG₁

0,5

0,41

82

0,03

...

...

...

6,46

21,80

0,42

0,09

0,99

11

0

AFG₂

0,25

...

...

...

86

0,01

0,03

4,79

12,30

0,22

0,05

0,56

10

...

...

...

AF

2

1,74

87

0,10

0,24

5,70

13,76

0,33

...

...

...

0,63

11

0

OTA

1

0,93

93

0,08

0,10

...

...

...

10,72

0,23

0,20

0,49

10

1

AFB₁

2

1,65

...

...

...

0,07

0,10

4,51

5,79

0,14

0,36

0,26

9

2

...

...

...

0,5

0,45

89

0,03

0,04

7,05

8,60

0,17

0,10

...

...

...

11

0

AFG₁

1

0,69

69

0,05

0,14

7,97

...

...

...

0,44

0,15

0,95

11

0

AFG₂

0,5

0,40

79

...

...

...

0,05

8,07

13,17

0,25

0,09

0,60

11

0

AF

...

...

...

3,11

78

0,16

0,47

5,10

15,07

0,40

0,69

0,68

...

...

...

0

OTA

2

1,86

93

0,08

0,16

4,31

8,56

...

...

...

0,41

0,39

11

0

AFB₁

NC^c

8,44

NAd

0,65

...

...

...

7,69

8,06

0,25

1,86

0,37

9

2

AFB₂

NC

...

...

...

NA

0,07

0,13

7,79

15,89

0,34

0,18

0,72

10

...

...

...

AFG₁

NC

6,33

NA

0,76

2,82

11,96

44,56

1,30

...

...

...

2,03

11

0

AFG₂

NC

1,03

NA

0,13

0,31

...

...

...

30,58

0,68

0,23

1,39

11

0

AF

NC

16,22

...

...

...

1,46

4,64

9,00

28,60

0,96

3,57

1,30

11

0

...

...

...

NC

7,27

NA

0,39

0,52

5,36

7,20

0,21

1,60

...

...

...

10

1

AFB₁

8

6,47

81

0,19

0,46

2,96

...

...

...

0,21

1,42

0,32

11

0

AFB₂

2

1,74

87

...

...

...

0,10

3,00

5,81

0,14

0,38

0,26

11

0

AFG₁

...

...

...

2,60

65

0,09

0,68

3,34

26,00

0,66

0,57

1,18

...

...

...

0

AFG₂

2

1,52

76

0,05

0,23

3,61

15,19

...

...

...

0,33

0,69

11

0

AF

16

12,85

80

0,29

...

...

...

2,22

5,74

0,19

2,83

0,26

9

2

OTA

8

...

...

...

113

0,46

0,93

5,15

10,31

0,32

1,99

0,47

10

...

...

...

^a AF = aflatoxin (tổng của AFB₁ AFB₂ AFG₁ AFG₂); OTA = ochratoxin A

^b được tính dựa trên độ lệch chuẩn ước định của 0,22c

^c NC - Nhiễm tự nhiên

^d NA - Không áp dụng

s_r là độ lệch chuẩn lặp lại;

s_R là độ lệch chuẩn tái lập;

RSD_r là độ lệch chuẩn lương đối lặp lại;

RSD_R là độ lệch chuẩn tương đối tái lập;

CHÚ THÍCH: Mẫu trắng được thấy có chứa < 0,1 µg/kg AF và OTA.

...

...

...

Phụ lục B

(Tham khảo)

Một số sắc ký đồ

Hình B.1 - Sắc đồ của các aflatoxin trong chuẩn và trong sản phẩm gừng

Hình B.2 - Sắc đồ chuẩn ochratoxin A và ochratoxin A trong sản phẩm gừng

Thư mục tài liệu tham khảo

...

...

...

 [2] MARY W. TRUCKSESS, CAROL M. WEAVER, CAROLYN J. OLES, FREDERICK S. FRY, JR, GREGORY O. NOONAN, JOSEPH M. BETZ and JEANNE I. RADER (2008), “Determination of Aflatoxins B1, B2, G1 and G2 and Ochratoxin A in Gineng and Ginger by Multitoxin Immunoaffinity Column Cleanup and Liquid Chromatographic Quantitation: Collaborative study”, Journal of AOAC international, 91(3), pp 511-524.

[3] AOAC 971.22, Standards for Aflatoxins. Thin-Layer Chromatographic Method, Revised First Action 1998 (Modified)

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12625:2019 về Thực phẩm - Xác định hàm lượng các aflatoxin B1, B2, G1, G2, aflatoxin tổng số và ochratoxin A trong nhân sâm và gừng - Phương pháp sắc ký lỏng có làm sạch bằng cột ái lực miễn nhiễm