7.2.4  Đọc kết quả

Gen sau khi nhân được nhuộm bằng chất nhuộm (thường là Loading dye) sau đó được chạy điện di trong gel agarose 2 %.

Mẫu dương tính cho kích thước đoạn gen 733 kb.

8  Báo cáo kết quả

Mẫu giám định được kết luận là loài Xylella fastidiosa Wells et al. khi:

- Phương pháp ELISA cho kết quả là dương tính.

hoặc

- Phương pháp PCR cho kết quả là dương tính.

Sau khi khẳng định kết quả giám định, người giám định hoặc cơ quan giám định trả lời kết quả bằng phiếu. Nội dung phiếu kết quả giám định gồm những thông tin sau:

...

...

...

- Tên loài

- Phương pháp giám định

- Người giám định/cơ quan giám định

Phiếu giám định chi tiết có thể tham khảo phụ lục E.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Thông tin chung

A.1  Tên khoa học và vị trí phân loại

...

...

...

Tên khoa học: Xylella fastidiosa (Wells et al., 1987)

Vị trí phân loại

Ngành: Proteobacteria

Lớp: Gammaproteobacteria

Bộ: Xanthomonadales

Họ: Xanthomonadaceae

Giống: Xylella

A.2  Phân bố

Trong nước: Bệnh chưa có ở Việt Nam

...

...

...

A.3  Ký chủ

Ký chủ chính: Carya illinoinensis, Citrus latifolia, Citrus reticulata (quýt), Citrus reticulata x paradisi, Citrus sinensis (cam), Medicago sativa (cỏ linh lăng), Morus alba (dâu tằm), Vitis labrusca (nho chồn), Vitis rupestris, Vitis vinifera (nho)

Ký chủ khác: Acer, Acer rubrum, Acer saccharum, Brachiaria, Coffee (cà phê), Coffea arabica (cà phê arabica), Conium maculatum, Cynodon, Cyperus, Digitaria, Echinochloa frumentacea, Fragaria vesca, Liquidambar styraciflua, Lolium, Lolium multiflorum, Medicago, Nerium oleander, Paspalum, Paspalum dilatatum (san dẹp), Passiflora foetida, Persea americana (bơ), Platanus occidentalis, Poaceae (họ hòa thảo), Prunus angustifolia, Prunus dulcis (hạnh nhân), Prunus persica (đào), Prunus salicina (mận Nhật bản), Pyrus (chi lê), Quercus rubra, Quercus velutina, Rubus (chi mâm xôi), Sambucus, Taraxacum officinale complex, Trifolium, Ulmus, Ulmus americana, Olea europaea, Vaccinium, Vinca minor...

A.4  Đặc điểm sinh học

Vi khuẩn chỉ nhân lên trong mạch gỗ trong rễ, thân và lá. Mạch dẫn bị bít tắc bởi các cụm vi khuẩn và các sẹo và khối nhầy tạo ra bởi cây mặc dù tác hại của bệnh không chỉ ở khía cạnh làm nghẽn nguồn cung cấp nước. Bệnh rụng lá nho có thể truyền bởi côn trùng môi giới, không có giai đoạn tiềm dục và tồn tại trong cơ thể côn trùng vĩnh viễn. Trong các thí nghiệm tiến hành trong những năm 1940 tại California, USA, 75 trên 100 loài cây thí nghiệm có thể nhiễm bệnh từ côn trùng môi giới. Những nghiên cứu khác trên môi trường và công nghệ PCR đã tìm thấy các kí chủ khác không biểu hiện triệu chứng, Phần lớn các kí chủ này chỉ biểu hiện sinh trưởng kém hơn một chút hoặc không có triệu chứng khi lây nhiễm.

Thời tiết vào mùa đông là nhân tố chính trong việc loại bỏ các vùng mà vi khuẩn có khả năng tồn tại từ mùa này sang mùa khác. Bệnh rụng lá nho và những bệnh tương tự chỉ xuất hiện ở các vùng có mùa đông không quá lạnh vì bệnh có thể tồn dư trong các cây trồng. Thí nghiệm nhiệt độ thấp với bệnh này gợi ý rằng nhiệt độ đóng băng có thể loại trừ vi khuẩn trực tiếp trong cây. Mùa đông ẩm ướt có thể khuyến khích sự tồn tại của các môi giới truyền bệnh và làm cho bệnh lây lan mạnh khi khí hậu mùa hè khô. Ở vùng khí hậu ôn đới với khoảng thời gian đóng băng hàng năm vi khuẩn thiết lập quần thể trên cây nho trong thời kì đầu của vụ và sau đó ở trạng thái bảo tồn thời gian cồn lại của năm. Tại California, USA không ghi nhận thấy hiện tượng lây bệnh từ cây qua cây có thể vi khí vi khuẩn xâm nhập vào bộ lá non khả năng thiết lập quần thể lây nhiễm có khả năng qua đông là thấp. Vì lý do này môi giới có khả năng qua đông là nguồn lây lan bệnh quan trọng trong vụ tiếp theo. Do không có các môi giới tiềm năng có thể qua đông ở pha trưởng thành nên tại các vùng ôn đới như châu Âu bệnh không có khả năng lây lan tự nhiên

Phụ lục B

(Quy định)

...

...

...

B.1  Cách hấp, sấy khử trùng

B.1.1  Sấy khử trùng

Dùng phương pháp này để khử trùng hộp lồng và dụng cụ thủy tinh. Dụng cụ phải được rửa sạch và gói riêng rẽ bằng giấy nhôm rồi đặt vào hộp bằng chất liệu phù hợp để có thể sấy được. Tránh không nên sử dụng giấy để gói vì sẽ làm dính kết vào dụng cụ và có thể gây cháy trong quá trình sấy. Dụng cụ thủy tinh có thể được sấy trong tủ sấy bằng không khí nóng, các đồ sấy không nên xếp quá chật để đảm bảo không khí nóng đối lưu, khí nóng phải đảm bảo tiếp xúc đều tất cả các phần của dụng cụ để quá trình sấy đạt hiệu quả tốt.

Có thể sử dụng các nhiệt độ và cách sấy sau:

Nhiệt độ

Thời gian

120 °C

140 °C

160 °C

...

...

...

8 giờ

3 giờ

1 giờ

20 phút

CHÚ THÍCH: thời gian được tính từ khi nhiệt độ lên tới nhiệt độ yêu cầu

B.1.2  Hấp khử trùng bằng nồi hấp

Dùng phương pháp này để khử trùng môi trường nhân tạo. Các nồi hấp vô trùng tự động (autoclave) hoặc các nồi áp suất đều có thể sử dụng để hấp vô trùng. Các môi trường nhân tạo sau khi điều chế được đựng trong các bình thủy tinh có nắp. Các bình này được đặt trong các lồng, hộp của nồi hấp vô trùng và đặt vào nồi hấp. Không nên để nghiêng hay rót môi trường quá đầy tránh làm trào môi trường trong quá trình khử trùng. Không nên xếp chồng chéo hoặc quá đầy ảnh hưởng tới luồng không khí đối lưu trong nồi hấp. Hấp khử trùng thường ở nhiệt độ 121 °C trong thời gian 30 phút.

Khi vận hành nồi hấp vô trùng cần sự giám sát cẩn thận và tuân thủ hướng dẫn sử dụng máy.

B. 2  Phương pháp điều chế môi trường nhân tạo

...

...

...

Thành phần

Aces Buffer (Sigma)

10 g

KOH 1M

40 ml

Yeast extract

10 g

Than hoạt tính

2 g

...

...

...

17 g

Nước

940 ml

Hòa tan các thành phần, đun tới khi hòa tan hoàn toàn

CHÚ THÍCH: Hiện nay, trên thị trường có rất nhiều loại môi trường nhân tạo để nuôi cấy vi khuẩn có thể mua các loại môi trường này sau đó điều chế theo hướng dẫn của nhà sản xuất hoặc tự điều chế theo phương pháp nêu trên.

Phụ lục C

(Quy định)

Thành phần và chuẩn bị dung dịch xử lý mẫu

...

...

...

Có thể sử dụng một trong những dung dịch bảo tồn sau:

Dung dịch 1:

CuSO₄

H₂SO₃

Nước

85 g

...

...

...

2.485 ml

Dung dịch 2:

H₂SO₃

Nước

284 ml

3.785 ml

...

...

...

Muối bão hòa

Fomalin

Nước

1.000 ml

500 ml

870 ml

...

...

...

Formalin

Cồn

Nước

450 ml

540 ml

1.810 ml

...

...

...

Hòa tan muối trong nước nóng đến mức độ bão hòa.

Để dung dịch nguội trong 3 giờ.

Lọc bỏ phần không tan hết

Phụ lục D

(Quy định)

Các dịch chiết mẫu

D.1  PBS

Thành phần

...

...

...

KCI

Na₂HPO₄

KH₂PO₄

Nước

8g

0,2g

2,9g

0,2g

1.000ml

...

...

...

Thành phần

CTAB

Tris HCl 1M

EDTA 0,5M

NaCl 5M

PVP 40

Nước

2g

10ml

...

...

...

28ml

1g

100ml

D.3  TE

Thành phần

Tris HCl 1M

EDTA 0,5M

Nước

1ml

...

...

...

100ml

Phụ lục E

(Tham khảo)

Mẫu phiếu kết quả giám định

Cơ quan Bảo vệ và Kiểm dịch thực vật

……………………………

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc
---------------

...

...

...

………., ngày ... tháng ... năm 20...

PHIẾU KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH

1. Tên hàng hoá:

2. Nước xuất khẩu:

3. Xuất xứ:

4. Phương tiện vận chuyển:

Khối lượng:

5. Địa điểm lấy mẫu:

...

...

...

7. Người lấy mẫu:

8. Tình trạng mẫu:

9. Ký hiệu mẫu:

10. Số mẫu lưu:

11. Người giám định:

12. Phương pháp giám định: Theo TCVN 12371-2-2:2018, Quy trình giám định vi khuẩn, virus, phytoplasma gây bệnh thực vật. Phần 2-2: yêu cầu cụ thể đối với vi khuẩn Xylella fastidiosa Wells et al.

13. Kết quả giám định:

Tên tiếng Việt: Bệnh vi khuẩn rụng lá nho

Tên khoa học: Xylella fastidiosa (Wells et al., 1987)

...

...

...

Ngành: Proteobacteria

Lớp: Gammaproteobacteria

Bộ: Xanthomonadales

Họ: Xanthomonadaceae

Giống: Xylella

TRƯỞNG PHÒNG KỸ THUẬT
(hoặc người giám định)
(ký, ghi rõ họ và tên)

THỦ TRƯỞNG ĐƠN VỊ
(ký, ghi rõ họ và tên, đóng dấu)

...

...

...

[1] CABI, (2017), Crop Protection Compedium.

[2] Commonwealth Mycologycal Institute, (1983), Plant Pathologist’s Pocketbook.

[3] IPPC, (2006), ISPM 27 Diagnostic protocols for regulated pests.

[4] Hopkins, D.L. and Purcell, A.H., 2002. Xylella fastidiosa: cause of Pierce's disease of grapevine and other emergent diseases. Plant disease, 86(10), pp. 1056-1066.

[5] Minsavage GV, Thompson CM, Hopkins DL & Leite RMVBC and stall RE, (1994), Development of a polymerase chain reaction protocol for detection of Xylella fastidiosa in plant tissue, Phytopathology 84, 456-461.

[6] Simpson, A.J.G., Reinach, F.C., Arruda, P., Abreu, F.A., Acencio, M., Alvarenga, R., Alves, L.C., Araya, J.E., Baia, G.S., Baptista, C.S. and Barros, M.H., 2000. The genome sequence of the plant pathogen Xylella fastidiosa. Nature, 406(6792), p.151.

[7] Viện Bảo vệ thực vật, (1997), Tập 1: Phương pháp điều tra cơ bản dịch hại nông nghiệp và thiên địch của chúng, Phương pháp nghiên cứu bảo vệ thực vật, NXB Nông nghiệp.

[8] https://gd.eppo.int/taxon/XYLEFA/photos.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12371-2-2:2018 về Quy trình giám định vi khuẩn, virus, phytoplasma gây bệnh thực vật - Phần 2-2: Yêu cầu cụ thể đối với khuẩn Xylella fastidiosa Wells et al.