7  Cách tiến hành

7.1  Chiết mẫu và làm sạch mẫu

Thêm vào mẫu thử (6.1) 20 ml dung dịch đệm phosphat 0,1 M (3.11);

Lắc 30 min bằng máy lắc ngang (4.8) cho tan hoàn toàn;

Hoạt hóa cột HLB bằng 5 ml metanol (3.7), 5 ml nước cất, 5 ml NaCI 2 % (3.12) và 5 ml dung dịch đệm phosphat 0,1 M (3.11);

Ly tâm mẫu (4.3) ở 4000 r/min trong 5 min;

Chuyển dung dịch qua cột chảy chậm, không quá 2 giọt/s;

Rửa cột bằng 5 ml nước cất, để khô cột 10 min;

Rửa giải bằng 5 ml metanol (3.7) thu vào ống nghiệm 8 ml (4.12);

...

...

...

Hòa tan cặn bằng 2 ml dung dịch 0,1 % axit formic (3:10):metanol (3:7) theo tỷ lệ 3:1;

Lọc bằng màng lọc nylon (4.17), đưa dịch chiết vào lọ đựng mẫu 1,5 ml (4.15);

Tiến hành phân tích trên hệ thống LC-MS/MS (4.1).

7.2  Tiến hành thử nghiệm trên LC-MS/MS

7.2.1  Yêu cầu chung

Chuẩn hóa các điều kiện của sắc ký lỏng như tốc độ dòng, thành phần pha động, nhiệt độ cột và các điều kiện của đầu dò MS/MS như điện thế mao quản, điện thế đầu cone, năng lượng va chạm, tốc độ khi va chạm...để mỗi chất phân tích thu được tỉ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N) lớn hơn 3 cho các phân mảnh ion và luôn tồn tại 4 điểm nhận dạng (IP) bao gồm 1 ion mẹ, 2 ion con; không có píc nhiễu tại vị trí của píc phân tích.

7.2.2  Điều kiện trên LC (tham khảo)

Cột sắc ký: RP C18, đường kính trong 2,1 mm, chiều dài cột 150 mm, kích thước hạt 5 μm

Nhiệt độ cột: (40 ± 5) °C

...

...

...

Thể tích bơm mẫu: 5 μl

Thời gian phân tích: 16 min

Pha động: Chạy theo chương trình gradient thể hiện theo Bảng 2.

Bảng 2 - Điều kiện gradient cho hệ thống LC

Thời gian (min)

Kênh B

Nước + 0,01 % axit formic

Kênh A

Axetonitril + 0,01 % axit formic

...

...

...

95

5

1

95

5

10

5

95

11

...

...

...

95

12

95

5

16

95

5

7.2.3  Điều kiện trên MS (tham khảo)

Kiểu ion hóa: ESI (+)/MRM

...

...

...

Nhiệt độ hóa hơi dung môi: 400 °C

Tốc độ dòng khí làm bay hơi dung môi: 600 l/h

Tốc độ dòng khí qua khối nón: 20 l/h

Áp suất khí va chạm: Argon, p = 2,93x10^-3 mbar

Điện thế mao quản: 2,0 kV

Bảng 3 - Điều kiện phân mảnh MS/MS

Kháng sinh

lon mẹ (m/z)

lon con (m/z)

...

...

...

Năng lượng (Sample Cone) (V)

Lincomycin

407,2

126,1*

359,2

26

18

32

Tylosin

...

...

...

174,0*

772,5

35

30

48

Lincomycin-d3

410,0

129,1

26

...

...

...

* dùng để định lượng.

7.3  Trình tự bơm mẫu (tham khảo)

- Bom dung môi kiểm tra máy: axetonitril (3.5);

- Bơm các dung dịch để dựng đường chuẩn;

- Bơm mẫu trắng;

- Bơm mẫu kiểm soát;

- Bơm mẫu thử;

8  Tính toán và biểu thị kết quả

8.1 Hệ số tín hiệu, RF, tính theo công thức:

...

...

...

Trong đó:

Sản phẩm là diện tích pic của ion định lượng chất cần phân tích;

Sp_IS là diện tích pic của ion thứ cấp của chất nội chuẩn.

8.2  Xây dựng đường chuẩn

Xây dựng phương trình bậc nhất giữa hệ số tín hiệu RF với nồng độ chất chuẩn bổ sung vào mẫu x theo phương trình đường chuẩn:

RF = ax + b.

Trong đó:

x là nồng độ chất chuẩn, tính theo đơn vị microgam trên lít (μg/l);

b là điểm cắt của đường chuẩn với trục tung;

...

...

...

8.3  Tính kết quả

Hàm lượng chất phân tích trong mẫu, C, microgam trên kilogam (μg/kg) được tính theo công thức sau:

Trong đó:

C_x là nồng độ chất phân tích được suy ra từ đường chuẩn, tính bằng microgam trên lít (μg/l);

V là thể tích cuối cùng của mẫu thử, tính bằng mililit (ml);

F là hệ số pha loãng mẫu khi đo (nếu không pha loãng, F = 1);

m là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam (g).

8.4  Biểu thị kết quả

...

...

...

9  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

- Thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử;

- Phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu có;

- Phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

- Các chi tiết bất thường khác có thể ảnh hưởng tới kết quả thử nghiệm;

- Kết quả thử nghiệm thu được.

Thư mục tài liệu tham khảo

...

...

...

[2] Phương pháp phân tích dư lượng macrolid trong mật ong bằng sắc ký lỏng hai lần khối phổ, mã # M-H239, 2007- JT laboratories Inc.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12285:2018 về Mật ong - Phương pháp xác định dư lượng tylosin, lincomycin bằng sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS)