7  Cách tiến hành

7.1  Chiết mẫu và làm sạch mẫu

Thêm vào mẫu thử (6.1) 20 ml đệm phosphat 0,1 M (3.11);

Lắc 1 min bằng máy vortex (4.4) ở tốc độ cao nhất. Để yên 20 min ở nhiệt độ phòng;

Hoạt hóa cột HLB bằng 10 ml metanol (3.7), 10 ml nước cất, 10 ml NaCI 2 % (3.12) và 2 ml đệm phosphat 0,1 M (3.11);

Ly tâm mẫu ở 4000 r/min trong 5 min (4.3);

Chuyển dung dịch qua cột chảy chậm, không quá 2 giọt/s;

Rửa cột bằng 5 ml nước cất chảy tốc độ tối đa 2 ml/min, để khô cột 5 min bằng bơm chân không;

Rửa giải bằng 3 ml axetonitril (3.6) tốc độ 1 ml/min đến 2 ml/min thu vào ống nghiệm 8 ml (4.12);

...

...

...

Hòa tan cặn bằng 2 ml dung dịch amoni axetat 0,05 M (3.14)

Lọc bằng màng lọc nylon (4.17), đưa dịch chiết vào lọ đựng mẫu 1,5 ml (4.16);

Tiến hành phân tích trên hệ thống LC-MS/MS (4.1).

7.2  Tiến hành thử nghiệm trên LC-NIS/MS

7.2.1  Yêu cầu chung

Chuẩn hóa các điều kiện của sắc ký lỏng như tốc độ dòng, thành phần pha động, nhiệt độ cột và các điều kiện của đầu dò MS/MS như điện thế mao quản, điện thế đầu công, năng lượng va chạm, tốc độ khi va chạm...để mỗi chất phân tích thu được tỉ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N) lớn hơn 3 cho các phân mảnh ion và luôn tồn tại 4 điểm nhận dạng (IP) bao gồm 1 ion mẹ, 2 ion con; không có píc nhiễu tại vị trí của píc phân tích.

7.2.2  Điều kiện trên LC (tham khảo)

Cột sắc ký: RP C18, đường kính trong 2,1 mm, dài cột 150 mm, kích thước hạt 5 μm

Nhiệt độ cột: (40 ±5)°C

...

...

...

Thể tích bơm mẫu: 5 μl

Thời gian phân tích: 9 min

Pha động: Chạy theo chương trình gradient thể hiện theo Bảng 2.

Bảng 2 - Điều kiện gradient cho hệ thống LC

Thời gian (min)

Kênh B

Nước + 0,01 % axít formic

Kênh A

Axetonitril + 0,01 % axít formic

...

...

...

90

10

0,5

90

10

5

10

90

6

...

...

...

90

6,5

90

10

9

90

10

7.2.3  Điều kiện trên MS (tham khảo)

Kiểu ion hóa: ESI (+)/MRM

...

...

...

Nhiệt độ hóa hơi dung môi: 400 °C

Tốc độ dòng khí làm bay hơi dung môi: 600 l/h

Tốc độ dòng khí qua đầu cone: 20 l/h

Áp suất khí va chạm: Argon, p = 2,93x10^-3 mbar

Điện thế mao quản: 2,0 kV

Bảng 3 - Điều kiện phân mảnh MS/MS

Kháng sinh

lon mẹ (m/z)

lon con (m/z)

...

...

...

Năng lượng (Sample Cone) (V)

Ampicillin

349,7

160,1*

106,1

10

20

22

Amocicillin

...

...

...

114,0*

208,0

20

15

20

Penicillin G

334,7

217,1*

160,0

...

...

...

18

40

Amoxicillin d₄

370,7

115,0

20

16

Penicillin d₇

341,7

...

...

...

12

18

* dùng để định lượng.

7.3  Trình tự bơm mẫu (tùy chọn)

- Bơm dung môi kiểm tra máy:axetonitril (3.5);

- Bơm các dung dịch để dựng đường chuẩn;

- Bơm mẫu trắng;

- Bơm mẫu kiểm soát;

- Bơm mẫu thử.

...

...

...

8.1  Hệ số tín hiệu, RF, tính theo công thức:

Trong đó:

Sp là diện tích pic của ion định lượng chất cần phân tích;

Sp_IS là diện tích pic của ion thứ cấp của chất nội chuẩn.

8.2  Xây dựng đường chuẩn

Xây dựng phương trình bậc nhất giữa hệ số tín hiệu RF với nồng độ chất chuẩn bổ sung vào mẫu x theo phương trình đường chuẩn: RF = ax + b. Trong đó:

b là điểm cắt của đường chuẩn với trục tung;

a là hệ số góc của đường chuẩn.

...

...

...

Hàm lượng chất phân tích trong mẫu, C, microgam trên kilogam (μg/kg) được tính theo công thức sau:

Trong đó:

C_x là nồng độ chất phân tích được suy ra từ đường chuẩn, tính bằng microgam trên lit (μg/l);

V là thể tích cuối cùng của mẫu thử, tính bằng mililit (ml);

F là hệ số pha loãng mẫu khi đo (nếu không pha loãng, F = 1);

m là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam (g).

8.4  Biểu thị kết quả

Kết quả được biểu thị bằng đơn vị μg/kg (ppb) được làm tròn đến hai chữ số sau dấu phẩy.

...

...

...

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

- Thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử;

- Phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu có;

- Phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

- Các chi tiết bất thường khác có thể ảnh hưởng tới kết quả thử nghiệm;

- Kết quả thử nghiệm thu được.

Thư mục tài liệu tham khảo

[1]  Quy trình nội bộ VS1/QT/90/TD “Mật ong - Xác định dư lượng β-lactam bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ”

...

...

...

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12284:2018 về Mật ong - Phương pháp xác định dư lượng ß-lactam (amoxicillin, ampicollin, penicillin G) bằng sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS)