Chuyển phần mẫu thử sang lọ phù hợp (6.8) tương ứng với hệ thống sắc ký (6.6).

Bơm các chất chuẩn vào hệ thống sắc ký (6.6). Đưa vào cùng một thể tích đối với mỗi chất chuẩn. Nên bơm thể tích bằng nhau đối với mẫu. Ghi lại thể tích bơm V_c tính bằng µl.

Vẽ nồng độ crom (VI) tính bằng microgam Cr trên mililít (µg/ml) tương ứng với các diện tích pic cromat đo được. Vẽ nồng độ crom (VI) trên trục X và diện tích trên trục y.

7.5  Xác định tỉ lệ thu hồi

Việc xác định tỉ lệ thu hồi đóng vai trò quan trọng để cung cấp thông tin về hiệu ứng của chất nền có thể ảnh hưởng đến kết quả.

Pha một phần dung dịch thu được trong 7.2 với một thể tích dung dịch crom(VI) thích hợp để làm tăng nồng độ crom(VI) đến 10 mg/kg. Bơm dung dịch này với thể tích bằng với thể tích được bơm trong quá trình hiệu chuẩn (ghi diện tích này là A_s).

Pha một phần dung dịch chiết (5.1) [bằng thể tích dung dịch thu được trong (7.2) được lấy trước đó] với một thể tích dung dịch crom(VI) thích hợp để làm tăng nồng độ crom(VI) đến 10 mg/kg, sao cho thể tích cuối của dung dịch bằng thể tích được pha với dung dịch Crom(VI) ở trên. Bơm dung dịch này với thể tích bằng với thể tích được bơm trong quá trình hiệu chuẩn (ghi diện tích là A_st).

Diện tích pic cromat của dung dịch này phải nằm trong phạm vi đường cong hiệu chuẩn, nếu không, phải thực hiện lại quy trình đo sử dụng lượng thể tích ít hơn. Tỷ lệ thu hồi phải nằm trong khoảng từ 80 % đến 120 %.

CHÚ THÍCH Nếu không phát hiện được crom(VI) đã thêm vào, điều này cho thấy da có thể chứa các tác nhân khử. Có thể kết luận mẫu da này không chứa crom(VI) (dưới giới hạn phát hiện).

...

...

...

8.1  Tính hàm lượng crom(VI)

 (1)

trong đó

w_Cr(VI) là phần khối lượng của Cr(VI) được chiết từ da, tính bằng miligam trên kilôgam (mg/kg);

A là diện tích pic của cromat trong đồ thị sắc ký của dung dịch chiết mẫu;

F là gradient của đường cong hiệu chuẩn (y/x), tính bằng mililít trên microgam (ml/µg)

b là giao điểm của đường cong hiệu chuẩn (y/x)

m là khối lượng của mẫu da được lấy, tính bằng gam (g);

V₀ là thể tích chiết của mẫu, tính bằng mililít (ml);

...

...

...

V_M là thể tích bơm khi phân tích mẫu, tính bằng microlít (µl).

Kết quả tính theo chất khô:

w_Cr(VI)-khô = w_Cr(VI) x D (2)

trong đó

D là hệ số chuyển đổi thành chất khô: 100

 (3)

w là phần khối lượng của chất dễ bay hơi được xác định theo TCVN 10048 (ISO 4684) với các mảnh mẫu khác, tính bằng phần trăm.

8.2  Tỷ lệ thu hồi (theo 7.5)

 (4)

...

...

...

η là tỉ lệ thu hồi, tính bằng phần trăm (%);

V₁ là thể tích của dung dịch mẫu trong dung dịch pha, tính bằng mililit (ml)

V₂ là thể tích của chất chuẩn cromat trong dung dịch pha, tính bằng mililit (ml);

A_s là diện tích pic cromat của dung dịch mẫu sau khi thêm crom(VI) khi xác định theo (7.5);

A là diện tích pic của mẫu ban đầu khi xác định theo (7.3);

A_st là diện tích pic cromat của dung dịch chiết sau khi cho thêm crom(VI) khi xác định theo (7.5).

8.3  Biểu thị kết quả

Hàm lượng crom(VI) tính bằng miligam trên kilôgam (mg/kg), được làm tròn đến 0,1 mg. Hàm lượng được tính theo chất khô. Các chất dễ bay hơi được xác định theo TCVN 10048 (ISO 4684), tính bằng phần trăm (%), được làm tròn đến 0,1 %.

Việc chiết chất nền đối với da là phức tạp và các kết quả nhỏ hơn 3 mg/kg chỉ ra sự dao động lớn và có độ tin cậy hạn chế, do đó giới hạn phát hiện phải là 3 mg/kg.

...

...

...

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm các thông tin sau:

a) hàm lượng crom(VI) thu được từ 8.1 được làm tròn đến 0,1 mg/kg;

b) viện dẫn tiêu chuẩn này:

c) mô tả mẫu thử và chi tiết về cách lấy mẫu (7.1), nếu cần thiết;

d) mô tả kỹ thuật sắc ký (nghĩa là kỹ thuật phát hiện trực tiếp hoặc có sử dụng phản ứng sau khi qua cột không)

e) các chất dễ bay hơi của da tính bằng phần trăm (%), được làm tròn đến 0,1 %;

f) tỉ lệ thu hồi tính bằng phần trăm (%);

g) chi tiết của bất kỳ sai khác nào so với quy trình quy định.

...

...

...

(tham khảo)

Độ chụm

Các kết quả thu được từ phép thử liên phòng thí nghiệm được tiến hành vào tháng bảy năm 2015 trên hai loại mẫu da, được tổng hợp trong Bảng A.1, Bảng A.2 và Bảng A.3.

Bảng A.1 - Kết quả đối với một loại da (Da A)

Phòng thí nghiệm

Hàm lượng crom(VI)

mg/kg

Giá trị trung bình

mg/kg

...

...

...

6,41

6,43

6,09

6,31

02

6,20

6,70

6,40

6,43

...

...

...

3,57

3,92

3,89

3,79

04

5,90

6,34

5,98

6,07

...

...

...

7,10

7,40

6,90

7,13

06

3,86

3,83

4,01

3,90

...

...

...

5,80

4,60

5,60

5,33

10

4,20

4,70

4,60

4,50

...

...

...

4,10

4,20

3,90

4,07

Giá trị trung bình: 5,28

Độ không đảm bảo: ±0,97, k = 2,31 (P 95 %)

Bảng A.2 - Kết quả đối với một loại da (Da B)

Phòng thí nghiệm

...

...

...

mg/kg

Giá trị trung bình

mg/kg

01

30,12

29,48

29,89

29,83

02

...

...

...

28,90

29,20

29,30

03

26,40

25,40

27,30

26,37

04

...

...

...

28,64

30,03

29,32

05

30,80

31,00

30,50

30,77

06

...

...

...

22,61

23,03

23,27

07

24,40

23,80

25,50

24,57

09

...

...

...

29,40

28,50

29,17

10

21,90

23,70

23,80

23,13

11

...

...

...

25,10

24,60

25,43

Giá trị trung bình: 27,1

Độ không đảm bảo: ±2,1 k = 2,26 (P 95 %)

Bảng A.3 - Dữ liệu độ chụm từ thử nghiệm liên phòng với hai loại da

Giá trị tính bằng miligam trên kilôgam

Hàm lượng crom(VI)^a

...

...

...

Độ tái lập^b

5,28

0,68

2,96

27,1

1,60

6,67

a Giá trị trung bình

b P 95 %, lần lượt hệ số 2,31 đối với dòng đầu tiên và 2,26 đối với dòng thứ hai.

...

...

...

Phụ lục B

(tham khảo)

Điều kiện sắc ký đối với phương pháp trực tiếp

B.1  Nguyên tắc chung

Vì thiết bị dụng cụ của các phòng thí nghiệm là khác nhau, nên không có hướng dẫn cụ thể cho quy trình này. Các thông số sau đã được thử nghiệm và sử dụng thành công.

Phương pháp sử dụng phải được xác nhận lại bằng cách xác định tỷ lệ thu hồi (7.5) và các kết quả quan sát được phải nằm trong giới hạn được liệt kê trong Phụ lục A.

B.2  Ví dụ các điều kiện sắc ký ion

B.2.1  Hóa chất pha động

Các hóa chất được sử dụng phải ít nhất có độ tinh khiết cấp phân tích.

...

...

...

B.2.1.1  Natri hydroxit, NaOH (CAS : 1310-73-2).

B.2.1.3  Dung dịch gốc pha động

Hòa tan 33,00 g amoni sulfat khan và 0,40 g natri hydroxit trong bình định mức và làm đầy đến vạch mức 1 000 ml bằng nước (5.7). Dung dịch này chứa 250 mmol trong amoni sulfat và 10 mmol trong natri hydroxit. pH dung dịch là 8,2. Từ dung dịch này chuẩn bị dung dịch rửa giải mới hàng tuần để sắc ký (B.2.1.4). Dung dịch bảo quản được trong bốn tháng tại nhiệt độ 4 °C.

B.2.1.4  Pha động

Chuyển 100 ml dung dịch gốc rửa giải (B.2.1.3) vào bình định mức 1 000 ml và làm đầy đến vạch mức bằng nước (5.7). Dung dịch này chứa 25 mmol amoni sulfat và 1 mmol natri hydroxit. Kiểm tra pH dung dịch là 8,2 ± 0,2. Lọc dung dịch qua màng lọc. Dung dịch bảo quản được trong một tuần tại nhiệt độ phòng.

B.2.2  Điều kiện thiết bị

- Nhiệt độ cột: 30 °C

- Pha động: 25 mmol amoni sulfat và 1 mmol natri hydroxit (B.2.1.4)

- Cột: Cột trao đổi anion (nhựa polymetacrylat có nhóm amoni bậc bốn), 4,6 x 75 mm, với cột điều chế 1 mm

...

...

...

- Bước sóng của đồ thị sắc ký dung dịch chiết: 372 nm

- Lưu lượng dòng: 0,9 ml/min

- Thể tích bơm: 50 µl

- Thời gian chạy sắc ký: 5 min

- Cân bằng giữa các lần bơm: 6 min.

Detector mảng diot DAD cho phép xác nhận sự tin cậy trong việc nhận dạng cromat bằng cách so sánh phổ UV của pic phát hiện với phổ cromat chuẩn. Hình B.1 minh họa đồ thị sắc ký thu được từ một mẫu có chứa 3,9 mg/kg Cr(VI). Hình B.2 minh họa phổ UV của anion cromat được tìm thấy trong một mẫu.

B.3  Ví dụ về đồ thị sắc ký và phổ UV khi phân tích một mẫu da thương phẩm

CHÚ DẪN

...

...

...

Y AU

CHÚ THÍCH Pic cromat, 3,755 min.

Hình B.1 - Đồ thị sắc ký thu được từ một mẫu chứa 3,9 mg/kg Cr (VI)

CHÚ DẪN

X nm

Y AU

Hình B.2 - Phổ tia cực tím của ion cromat thu được từ đồ thị sắc ký mẫu của Hình B.1 tại 3 757 min với detector DAD

...

...

...

Phụ lục C

(tham khảo)

Điều kiện sắc ký đối với phương pháp phản ứng sau khi qua cột

C.1  Nguyên tắc chung

Vì thiết bị dụng cụ của các phòng thí nghiệm có thể khác nhau, do đó không có hướng dẫn áp dụng chung cho phân tích sắc ký ion. Các thông số sau đã được thử và sử dụng thành công.

Phương pháp sử dụng phải được xác nhận lại bằng cách xác định tỷ lệ thu hồi (7.5) và các kết quả phải nằm trong phạm vi được liệt kê trong Phụ lục A.

C.2  Hệ thống sắc ký và thiết bị cần thiết

Phương pháp sắc ký ion với phản ứng sau khi qua cột được tóm tắt trong Hình C.1.

...

...

...

1 pha động

2 bơm LC

3 vòng bơm

4 cột phân tích

5 khớp nối chữ T có thể tích chết zezo

6 hóa chất sau khi qua cột

7 bơm hóa chất sau khi qua cột

8 cuộn phản ứng

9 detector (MWD hoặc DAD)

...

...

...

Phép phân tích crom (VI) sử dụng cột phân tích nhồi pha tĩnh trao đổi ion.

Hóa chất sau khi qua cột có chứa 1,5-diphenylcacbazit, được thêm vào giữa cột và cuộn phản ứng với sự trợ giúp của khớp nối chữ T có thể tích chết zezo.

Cuộn phản ứng đảm bảo sự pha trộn thích hợp của dung dịch rửa giải từ cột và hóa chất sau khi qua cột và crom(VI) trong dung dịch oxy hóa 1,5-diphenylcacbazit thành 1,5-diphenylcacbazon. Phản ứng tạo thành phức chất crom đỏ/tím, có thể được định lượng tại 540 nm kết hợp detector nhiều bước sóng (MWD) hoặc detector mảng diot (DAD).

C.2.1  Hai máy bơm sắc ký lỏng (LC) thích hợp. Một máy được sử dụng để phân phối pha động trong hệ thống, máy còn lại được sử dụng để phân phối tác nhân sau khi qua cột trước cuộn cảm ứng.

C.2.2  Van lấy mẫu tự động hoặc bơm thủ công được trang bị vòng mẫu để bơm mẫu.

C.2.3  Khoang cột ổn nhiệt

C.2.4  Cột phân tích được nhồi pha tĩnh trao đổi anion

C.2.5  Khớp nối chữ T có thể tích chết zezo

C.2.6  Cuộn phản ứng thích hợp

...

...

...

CHÚ THÍCH Để duy trì tính trơ của hình dạng, cột và tất cả các mao quản (kể cả vòng bơm) đều có trong PEEK.

Việc sử dụng cột bảo vệ được khuyến nghị để kéo dài tuổi thọ của cột. Sử dụng cột bảo vệ trong PEEK nhồi hạt polystyren-divinylbenzen.

C.3  Ví dụ về điều kiện phân tích

C.3.1  Hóa chất pha động và sau khi qua cột

Tất cả các hóa chất được sử dụng phải ít nhất đạt cấp độ tinh khiết phân tích.

C.3.1.1  Amoni sulfat, (NH₄)₂SO₄ (CAS: 7783-20-2).

C.3.1.2  Amoni hydroxit, NH₄OH (CAS: 1336-21-6), 28% NH₃ trong nước.

C.3.1.3  1,5-Diphenylcacbazit, C₁₃H₁₄N₄O (CAS: 140-22-7).

C.3.1.4  Metanol, CH₃OH (CAS: 67-56-1).

...

...

...

C.3.2  Chuẩn bị pha động

Hòa tan (33,0 ± 0,1) g amoni sunfat (C.3.1.1) và 8,0 ml amoni hydroxit (C.3.1.2) trong bình định mức 1 000 ml, làm đầy đến vạch mức bằng nước cất (5.7).

C.3.3  Chuẩn bị hóa chất sau khi qua cột

Trong bình định mức 1 000 ml, hòa tan 28 ml axit sulfuric (C.3.1.5) với khoảng 500 ml nước cất (5.7) và để nguội.

Trong thời gian này, hòa tan (0,50 ± 0,01) g 1,5-diphenylcacbazit (C.3.1.3) trong 100 ml metanol (C.3.1.4).

Khi dung dịch axit nguội, khuấy bằng máy khuấy từ và trộn dung dịch diphenylcacbazit với dung dịch axit và làm đầy đến vạch bằng nước (5.7).

C.3.4  Điều kiện thiết bị

- Cột phân tích: Cột trao đổi anion với với nhóm chức amoni bậc bốn. Chiều dài: 250 mm. Đường kính trong: 4 mm

- Cột bảo vệ, chiều dài 35 mm và đường kính trong 4 mm

...

...

...

- Thể tích bơm: 100 µl

- Lưu lượng dòng pha động: 1ml/min

- Tốc độ hóa chất sau khi qua cột: 0,33 ml/min

- Thời gian chạy: 10 min

C.4  Ví dụ về đồ thị sắc ký

Hình C.2 minh họa đồ thị sắc ký của chất chuẩn 5 µg/l và Hình C.3 minh họa đồ thị sắc ký của một mẫu da thật tại mức 3 mg/kg.

CHÚ DẪN

1 Crom(VI)-4,608

...

...

...

Y mAU

Hình C.2 - Đồ thị sắc ký của chất chuẩn 5 µg/l (tương ứng với mức đầu tiên của đường cong hiệu chuẩn)

CHÚ DẪN

1 Crom(VI)-4,707

X min

Y mAU

Hình C.3 - Đồ thị sắc ký của mẫu da thật tại mức 3 mg/k

...

...

...

(tham khảo)

So sánh phương pháp chuẩn độ [TCVN 12275-1 (ISO 17075-1)] và phương pháp sắc ký ion [TCVN 12275-2 (ISO 17075-2)]

Dữ liệu trong Bảng D.1 thu được từ thử nghiệm liên phòng (tháng chín năm 2015) gồm 13 phòng thí nghiệm. Thử nghiệm được tiến hành trên mẫu da có hàm lượng crom(VI) chưa biết.

Bảng D.1 - Kết quả thử nghiệm liên phòng từ mẫu da sử dụng phương pháp chuẩn độ [TCVN 12275-1 (ISO 17075-1)] và phương pháp sắc ký ion [TCVN 12275-2 (ISO 17075-2)]

Phương pháp chuẩn độ

TCVN 12275-1 (ISO 17075-1)

Phương pháp sắc ký ion

TCVN 12275-2 (ISO 17075-2)

Giá trị trung bình

...

...

...

Trung bình

Độ lệch chuẩn

mg/kg

mg/kg

3,71

0,93

2,56

1,17

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12275-2:2018 (ISO 17075-2:2017) về Da - Xác định hàm lượng crom (VI) - Phần 2: Phương pháp sắc ký