5.2  Xác định

Dùng máy đo quang phổ (4.1) chỉnh đến bước sóng 340 nm, thực hiện các phép đo sử dụng không khí (không có cuvet trong đường quang) hoặc dùng nước để so sánh.

Cài đặt nhiệt độ từ 20 °C đến 25 °C.

Cho vào hai cuvet có chiều dài đường quang 1 cm (4.2) các dung dịch sau:

Bảng 2 - Thể tích dung dịch cho vào hai cuvet

Dung dịch

Thể tích cho vào cuvet so sánh (mẫu trắng), ml

Thể tích cho vào cuvet mẫu thử, ml

Dung dịch đệm trietanolamin ở 20 °C (3.1)

...

...

...

2,50

Dung dịch nicotinamit adenin dinucleotit phosphat (3.2)

0,10

0,10

Dung dịch adenosine-5'-triphosphat (3.3)

0,10

0,10

Mẫu thử đã chuẩn bị (xem 5.1)

-

...

...

...

Nước

-

0,20

Trộn đều, sau 3 min đọc độ hấp thụ của dung dịch (A₁). Bắt đầu cho phản ứng bằng cách bổ sung:

Dung dịch hexokinase/glucose-6-phosphat-dehydrogenase (3.4)

0,02

0,02

Trộn đều, sau 15 min đọc độ hấp thụ (A₂) và sau mỗi 2 min tiếp theo kiểm tra xem phản ứng đã dừng hay chưa. Khi phản ứng dừng, bổ sung ngay:

Dung dịch phosphoglucose-isomerase (3.5)

...

...

...

0,02 ml

Trộn đều, sau 10 min đọc độ hấp thụ (A₃) và sau mỗi 2 min tiếp theo kiểm tra xem phản ứng đã dừng hay chưa.

CHÚ THÍCH  Thời gian cần thiết để kết thúc quá trình hoạt động của enzym có thể thay đổi giữa các mẻ. Giá trị trên đưa ra chỉ để hướng dẫn và được khuyến cáo khi xác định cho mỗi mẻ.

6  Tính kết quả

Hàm lượng glucose và fructose của mẫu thử, C, tính bằng gam trên lít (g/l) được tính theo Công thức (1):

(1)

Trong đó

V₁

...

...

...

đối với phép xác định glucose: V = 2,92 ml

đối với phép xác định fructose: V = 2,94 ml;

V₂

là thể tích của dung dịch mẫu bổ sung vào cuvet, tính bằng mililit (V₂ = 0,02 ml);

M

là khối lượng phân tử glucose hoặc fructose, tính bằng gam trên mol (M = 180,16 g/mol);

F

là hệ số pha loãng mẫu (xem Bảng 1);

ɛ

...

...

...

ở bước sóng 340 nm: ɛ = 6,3 mmol־¹ x l x cm־¹

ở bước sóng 365 nm: ε = 3,5 mmol־¹ x l x cm־¹

ở bước sóng 334 nm: ɛ = 6,18 mmol־¹ x l x cm־¹;

d

là chiều dài đường quang của cuvet, tính bằng xentimet (d = 1 cm);

∆A

là chênh lệch độ hấp thụ (5.2)

đối với phép xác định glucose: ∆A_glucose = (A₂ - A₁)_mẫu - (A₂ - A₁)_{mẫu trắng}

đối với phép xác định fructose: ∆A_fructose = (A₃ - A₂)_mẫu - (A₃ - A₂)_{mẫu trắng}.

...

...

...

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc những điều được coi là tự chọn, và bất kỳ chi tiết nào có ảnh hưởng tới kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được.

Phụ lục A

(Tham khảo)

...

...

...

A.1  Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử độc lập, riêng rẽ, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp, trên vật liệu thử giống hệt nhau, trong một phòng thử nghiệm, do cùng một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, trong một thời gian ngắn, không quá 5 % các trường hợp lớn hơn giới hạn lặp lại (r) sau đây:

r = 0,056 x x_i

Trong đó: x_i là nồng độ của glucose hoặc fructose, tính bằng gam trên lít (g/l).

A.2  Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử riêng rẽ, thu được khi sử dụng cùng phương pháp trên vật liệu thử giống hệt nhau trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do những người khác nhau thực hiện, sử dụng các thiết bị khác nhau, không quá 5 % các trường hợp lớn hơn giới hạn tái lập (R) sau đây:

R = 0,12 + 0,076 x x_i

Trong đó: x_i là nồng độ của glucose hoặc fructose, tính bằng gam trên lít (g/l).

...

...

...

[1] TCVN 10693:2015 (EN 1140:1994), Nước rau, quả - Xác định hàm lượng D-glucose và D-frutose sử dụng enzym - Phương pháp đo phổ NADPH

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12084:2017 về Rượu vang - Xác định glucose và fructose - Phương pháp enzym