Hoà tan các thành phần trên trong nước. Trộn đều và chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,0 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần. Khử trùng bằng nồi hấp áp lực ở 121 °C ± 1 °C trong 15 min. Dịch pha loãng có thể được bảo quản ở nhiệt độ 4 °C ± 1 °C, tối đa hai tuần

A.2.4  Môi trường thạch dinh dưỡng (NA) (không chọn lọc)

Sản phẩm thủy phân casein bằng enzym

5,0 g

Muối natri clorua

5,0 g

Chất chiết nấm men

2,0 g

Chất chiết thịt

...

...

...

Thạch

Từ 9 g đến 18 g^a

Nước

1 000 ml

^a Phụ thuộc vào sức đông của thạch

Hoà tan các thành phần trên trong nước bằng cách đun sôi. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,4 ± 0,2 ở 20 °C đến 25 °C. Khử trùng bằng nồi hấp áp lực ở 121 °C ± 1 °C trong 15 min. Để nguội đến nhiệt độ từ 45 °C đến 50 °C và phân phối các lượng khoảng 10 ml môi trường vào các đĩa Petri vô trùng.

A.2.5  Môi trường thạch chọn lọc gram âm

A.2.5.1  Môi trường cơ bản

Thạch sữa (ví dụ: Oxoid CM213))

...

...

...

Nisin

40,0 mg^a

(40 000 đơn vị quốc tế/lít)

Nước

997 ml

^a Có thể cần để điều chỉnh phù hợp với hoạt độ của chất chuẩn nisin có sẵn.

Hoà tan các thành phần trên trong nước bằng cách đun sôi. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,1 ± 0,2 ở 20 °C đến 25 °C. Phân phối vào vật chứa cuối cùng. Khử trùng ở 121 °C ± 1 °C trong 15 min. Để nguội đến nhiệt độ từ 45 °C đến 50 °C.

...

...

...

Tím tinh thể

10 mg

Nước

10 ml

Hòa tan tím tinh thể trong nước. Lọc để khử trùng dung dịch qua màng lọc cỡ lỗ 0,22 µm. Dung dịch tím tinh thể có thể được bảo quản ở nhiệt độ từ 4 ^oC đến 6 ^oC, đến hai tuần

A.2.5.3  Dung dịch Penicillin-G

Penicilin G

100 mg^a

(20 000 đơn vị quốc tế/lít)

...

...

...

10 ml

^a Có thể cần để điều chỉnh phù hợp với hoạt độ của chất chuẩn penicillin có sẵn.

Hoà tan penicillin-G trong nước. Lọc để khử trùng qua bộ lọc cỡ lỗ 0,22 µm. Dung dịch penicillin-G có thể được bảo quản ở nhiệt độ từ 4 °C đến 6 °C, không quá một tuần.

A.2.5.4  Môi trường chọn lọc gram âm hoàn chỉnh

Dung dịch Penicilin-G

1,2 ml^a

Dung dịch tím tinh thể

2 ml

...

...

...

997 ml

^a Có thể cần đề điều chỉnh phù hợp với hoạt độ của chất chuẩn penicillin có sẵn.

Bằng kỹ thuật vô trùng cho các dung dịch tím tinh thể và penicillin-G vào môi trường cơ bản nóng chảy đã làm nguội đến nhiệt độ 45 °C ± 1 °C. Trộn đều và phân phối theo yêu cầu.

A.3  Thiết bị

A.3.1  Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm vi sinh thông thường và cụ thể như sau:

A.3.2  Dụng cụ thủy tinh không chứa nội độc tố

Để dụng cụ thủy tinh không còn chứa nội độc tố, cần gia nhiệt dụng cụ ở 180 °C ± 2 °C trong 4 h. Ngoài ra, dụng cụ bằng chất dẻo vô trùng thường không chứa nội độc tố có thể được sử dụng thay cho dụng cụ thủy tinh.

A.3.3  Túi trộn nhu động và túi chất dẻo

A.3.4  Lọ đa năng bằng chất dẻo vô trùng (khoảng 30 ml)

...

...

...

A.3.6  Tủ sấy phòng thử nghiệm, có khả năng duy trì nhiệt độ 180 °C ± 2 °C.

A.4  Cách tiến hành

A.4.1  Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu

Bằng kỹ thuật vô trùng lấy bốn phần da khác nhau, mỗi phần khoáng 2,5 g để tạo thành 10 g mẫu da hỗn hợp. Đối với toàn bộ thân thịt lấy các phần cổ, hậu môn và dưới nách, mỗi phần 2,5 g. Đối với các phần thịt gà lấy các mẫu da từ các vùng khác nhau. Nếu kiểm tra các miếng thịt gà không da thì sử dụng 10 g thịt đã được cắt bằng kỹ thuật vô trùng. Đặt da hoặc các phần thịt trong túi chất dẻo và thêm 90 ml nước không chứa nội độc tố (A.2.2). Đồng hóa trong túi trộn nhu động (A.3.3) từ 1 min đến 2 min. Bằng kỹ thuật vô trùng chuyển một lượng thích hợp (ví dụ: 30 ml) huyền phù ban đầu vào lọ vô trùng (A.3.4) và giữ chai ở nhiệt độ từ 1 °C đến 4 °C để thực hiện các quy trình dưới đây (quy trình GNB cần 1 ml và quy trình LAL cần 30 µl). Quy trình LAL phải được thực hiện trong vòng 2 h. Huyền phù ban đầu này tương đương với dung dịch pha loãng 10^-1 của mẫu ban đầu.

A.4.2  Chuẩn bị dung dịch pha loãng

Tốt nhất là, số đếm trên mỗi đĩa phải nằm trong dải từ 15 đến 300 đơn vị hình thành khuẩn lạc (cfu). Chuẩn bị các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo cho các lần đếm bằng cách cho 1 ml huyền phù ban đầu (A.4.1) vào 9 ml dung dịch muối pepton (A.2.3) để thu được dung dịch pha loãng 10^-2 và lặp lại cho đến khi mẫu được pha loãng đủ (thường là ít nhất 10^-5). Thời gian giữa việc chuẩn bị các dung dịch pha loãng và trải đĩa không được quá 15 min.

A.4.3  Đổ đĩa

Dàn đều hai lần trên hai đĩa thạch dinh dưỡng, đã làm khô (A.2.4), mỗi đĩa 0,1 ml các dung dịch. Để yên ở nhiệt độ môi trường (từ 20 °C đến 25 °C) trong 90 min, sau đó phủ lên khoảng 10 ml thạch chọn lọc GNB (A.2.5.4) ở nhiệt độ 45 °C ± 1 °C. Tiến hành cẩn thận để tránh rót lớp phủ quá dày. Để yên và ủ đĩa ở tư thế lật ngược ở 21 °C ± 1 °C trong 24 h ± 1 h.

A.4.4  Đếm GNB/g

...

...

...

N =

Σc

(A.1)

V x [n₁ + (0,1 x n₂) x d]

Trong đó:

Σc là tổng số các khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa được giữ lại từ hai dung dịch pha loãng liên tiếp và trong đó ít nhất có một đĩa chứa tối thiểu 15 khuẩn lạc;

V là thể tích dịch cấy được cấy vào mỗi đĩa, tính bằng mililit (ở đây là 0,1 ml);

n₁ là số lượng đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ nhất;

n₂ là số lượng đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ hai;

...

...

...

Ví dụ:

Độ pha loãng

Số khuẩn lạc trên đĩa đếm lặp lại hai lần

10^-3

271

240

10^-4

30

32

...

...

...

N =

573

=2,6x10⁶cfu GNB / g

0,1x(2+0,2)x10^-3

A.5  Biểu thị kết quả

Ghi lại số lượng đơn vị khuẩn lạc hình thành GNB/g da hoặc thịt tính được trong A.4.4. Biểu diễn kết quả theo log₁₀ cfu GNB/g. Nếu có ít hơn 15 khuẩn lạc có trong độ pha loãng thấp nhất 10^-1 thì báo cáo kết quả là số khuẩn lạc ước lượng được (E). Nếu không có khuẩn lạc GNB nào có mặt trong độ pha loãng thấp nhất 10^-1 thì báo cáo kết quả là "GNB không phát hiện được".

A.6  Quy trình kiểm soát chất lượng

Tất cả các môi trường nuôi cấy phải được thử nghiệm sử dụng các chủng so sánh kiểm soát dương tính và âm tính thích hợp bằng các quy trình nêu trong TCVN 8128-1 (ISO/TS 11133-1).

...

...

...

(Quy định)

Xác định nồng độ nội độc tố bằng thử nghiệm Limulus amoebocyte lysate (LAL)

B.1  Nguyên tắc

Thử nghiệm Limulus amoebocyte lysate (LAL) là phương pháp phân tích bán định lượng sử dụng các đĩa vi giếng có chứa các tế bào amit dạng đông khô được lấy từ máu con sam biển, trong đó có phản ứng tạo gel với sự có mặt của nội độc tố (còn gọi là lipopolysaccharid) được lấy từ các thành tế bào vi khuẩn Gram âm còn sống hoặc đã chết [7].

Việc xác định nồng độ nội độc tố có trong mẫu thử được tiến hành theo ba giai đoạn liên tiếp:

- Chuẩn bị các dung dịch pha loãng trong các đĩa vi giếng LAL, sử dụng huyền phù mẫu thử ban đầu đã được chuẩn bị trong A.4.1.

- Ủ các đĩa vi giếng LAL ở 37 °C trong 1 h.

- Quan sát các khối gel hình thành và tính nồng độ nội độc tố.

B.2  Thuốc thử

...

...

...

B.2.2  Chất chuẩn đối chứng dạng đông khô (LPS)5) khoảng 500 đơn vị nội độc tố (EU).

B.2.3  Thuốc nhuộm tế bào xanh toluidin

Polysorbat 20 (ví dụ: Tween 20^®)6)

1,0 g

Xanh toluidin

0,2 g

Nước

100 ml

Hòa tan các thành phần trên trong nước và trộn kỹ

...

...

...

B.3.1  Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm vi sinh và cụ thể như sau:

B.3.2  Nồi cách thủy không tuần hoàn nước

Nồi cách thủy tĩnh có khả năng duy trì nhiệt độ 37 °C ± 0,5 °C.

B.3.3  Các đĩa vi giếng dùng cho thử nghiệm LAL⁷⁾ (có độ nhạy từ 1 EU đến 2 EU)

Sử dụng các đĩa 96 giếng chuẩn (12 cột x 8 hàng) có các cột giếng dung dịch pha loãng rỗng và các cột giếng mẫu thử hấp phụ lysat xen kẽ nhau (Hình C.2). Các đĩa vi giếng phải được xử lý cẩn thận vì chuyển động quá mức có thể gây nhiễu lysat được hấp phụ và gây ra kết quả âm tính giả.

B.3.4  Pipet tự động, có khả năng phân phối các lượng 65 µl và 30 µl.

B.3.5  Giấy Parafilm®7)

B.3.6  Bơm hút (nước hoặc cơ học)

B.3.7  Bộ đồng hóa cô quay

...

...

...

B.4.1  Yêu cầu chung

Sử dụng huyền phù ban đầu được chuẩn bị trong A.4.1 để đo nồng độ nội độc tố.

B.4.2  Dung dịch pha loãng mẫu trong đĩa vi giếng dùng cho thử nghiệm LAL (xem Hình C.3).

Cho 65 µl nước (B.3.4) không chứa nội độc tố (A.2.2) vào từng giếng dung dịch pha loãng của đĩa vi giếng (B.3.3). Thêm 30 µl huyền phù mẫu thử ban đầu (A.4.1) vào giếng dung dịch pha loãng thứ nhất chứa 65 µl nước không chứa nội độc tố (hỗn hợp này có độ pha loãng của huyền phù ban đầu là 10^-0,5) và trộn kỹ các lượng chứa trong giếng bằng cách rót đầy và xả đầu tip pipet cẩn thận không để các bọt khí lọt vào trong vi giếng.

Sử dụng đầu tip pipet sạch, chuyển 30 µl từ giếng dung dịch pha loãng thứ nhất vào giếng mẫu thử thứ nhất (giếng có lysat được hấp phụ ở đáy) và 30 µl khác từ giếng dung dịch pha loãng thứ nhất vào giếng dung dịch pha loãng thứ hai (hỗn hợp này có độ pha loãng của huyền phù ban đầu là 10^-1). Sử dụng đầu tip pipet sạch, trộn kỹ các lượng chứa của giếng dung dịch pha loãng thứ hai.

Chuyển 30 µl từ giếng dung dịch pha loãng thứ hai sang giếng mẫu thử thứ hai và 30 µl khác từ giếng dung dịch pha loãng thứ hai sang giếng mẫu thử thứ ba (hỗn hợp này có độ pha loãng của huyền phù ban đầu là 10^-1,5). Sử dụng đầu tip pipet sạch, trộn kỹ.

Tiếp tục pha loãng các vật liệu thử trong đĩa vi giếng như trên cho đến khi tất cả tám giếng mẫu thử theo hàng dọc được rót đầy mẫu.

Bốn mẫu có thể được kiểm tra trên một đĩa cùng với các mẫu kiểm soát (B.4.3)

B.4.3  Kiểm soát dương tính và âm tính

...

...

...

Ngoài các mẫu thử, các mẫu kiểm soát dương tính và âm tính cũng phải được kết hợp trên mỗi đĩa.

B.4.3.2  Mẫu kiểm soát dương tính

Huyền phù lại chất chuẩn đối chứng dạng đông khô (B.2.2) trong nước không chứa nội độc tố để chuẩn bị dung dịch nồng độ 50 EU/ml. Đồng hóa trong 2 min. Kiểm tra các mẫu thử như mô tả trong B.4.2.

B.4.3.3  Mẫu kiểm soát âm tính

Thêm 30 µl nước không chứa nội độc tố (B.2.1) vào hai giếng mẫu thử thay thế trong đĩa vi giếng.

B.4.4  Nuôi cấy chất thử LAL

Phủ giấy Parafilm® (B.3.5) lên các đĩa vi giếng ngay sau khi chuẩn bị và để nổi trên nồi cách thủy ở 37 °C ± 0,5 °C trong 1 h.

B.4.5  Sự hình thành của các khối gel

Sau giai đoạn ủ, lấy đĩa ra khỏi nồi cách thủy và cẩn thận làm khô vết nước. Tháo giấy Parafilm® ra và thêm 1 giọt thuốc nhuộm xanh toluidin (B.2.3) vào từng giếng dung dịch thử. Đề phát hiện sự hình thành gel, hút nhả từng giếng dung dịch thử sử dụng pipet Pasteur được gắn với một bơm hút nhẹ (B.3.6). Cắm nhẹ đầu tip pipet xuống đáy giếng và hút (cẩn thận để không quét pipet Pasteur qua đáy giếng vì sẽ làm vỡ khối gen bất kỳ đã được hình thành khi rút pipet ra). Ghi lại phản ứng dương tính (+) khi gel hình thành trong giếng (khi một lỗ nhỏ trong gel hình thành, nơi có thể nhìn thấy pipet Pasteur chạm vào). Ghi lại phản ứng âm tính (-) nếu lượng chứa trong giếng được hút hết. Ghi lại phản ứng từng phần (+/-) khi có bằng chứng hình thành gel nhẹ ở đáy giếng, nghĩa là các giếng không rỗng hoàn toàn.

...

...

...

Hàm lượng nội độc tố của mẫu thử được báo cáo là EU trên gam mẫu. Xác định độ chuẩn của giếng dương tính cuối cùng trong dãy các giếng dung dịch pha loãng.

Ví dụ để xác định độ chuẩn:

VÍ DỤ 1:

Giếng thử

Phản ứng LAL

Độ pha loãng

1

+

10^-0,5

...

...

...

+

10^-1,0

3

+

10^-1,5

4

-

10^-2,0

Độ chuẩn = 1,5

...

...

...

VÍ DỤ 2:

Giếng thử

Phản ứng LAL

Độ pha loãng

1

+

10^-0,5

2

...

...

...

10^-1,0

3

+/- ở đây là tạo gel một phần

10^-1,5

4

-

10^-2,0

5

-

...

...

...

Độ chuẩn = 1,25

Tính số EU trên gam mẫu thử sử dụng Công thức (B.1) và (B.2):

EU/ml = 10^{(độ chuẩn)} x độ nhạy của lysat (được cho bởi nhà sản xuất đĩa vi giếng)   (B.1)

EU/g = EU/ml x 10                                                                                            (B.2)

B.6  Biểu thị kết quả

Biểu thị kết quả theo log₁₀ EU/g.

B.7  Quy trình kiểm soát chất lượng

Các mẫu kiểm soát nội độc tố dương tính (B.4.3.2) và âm tính (B.4.3.3) được đưa vào từng đĩa vi giếng. Nếu kiểm soát âm tính cho thấy dương tính thì tất cả phép thử phải được lặp lại với một mẻ nước không chứa nội độc tố mới. Nếu kiểm soát dương tính khác nhau quá 0,25 độ chuẩn của độ chuẩn đối chứng được cho bởi nhà sản xuất (B.2.2) thì mẫu phải được thử nghiệm lại sử dụng đĩa vi giếng khác.

...

...

...

(Tham khảo)

Sơ đồ

Hình C.1 - Sơ đồ mô tả phương pháp LAL/GNB

Hình C.2 - Sơ đồ mô tả đĩa vi giếng LAL hoàn chỉnh8) (xem B.3.3)

 Giếng dung dịch pha loãng

 Giếng mẫu thử lysat

...

...

...

Bước 1

Bước 2

Bước 3

Cho 65 µl nước không chứa nội độc tố vào từng giếng dung dịch pha loãng (bên trái các dãy)

Thêm 30 µl mẫu ban đầu đồng nhất vào giếng dung dịch pha loãng thứ nhất trong các dãy

Trộn kỹ lượng chứa trong giếng dung dịch pha loãng

...

...

...

Bước 4

Bước 5

Bước 6

Sử dụng đầu tip pipet sạch, chuyển 30 µl dung dịch từ giếng dung dịch pha loãng vào giếng mẫu thử bên cạnh (bên phải các dãy được phân biệt bằng lysat được hấp thụ vào đáy giếng

Chuyển 30 µl từ giếng dung dịch thử vào giếng dung dịch pha loãng tiếp theo (bên dưới) trong các dãy. Tháo đầu tip

Lặp lại các bước 3,4 và 5 cho đến khi hết các dãy

Hình C.3 - Sơ đồ mô tả các dãy giếng dung dịch pha loãng và mẫu thử trong một đĩa vi giếng 96 giếng có LAL (xem B.4.2)

...

...

...

[1] TCVN 7408 (EN 1784) Thực phẩm - Phát hiện thực phẩm chiếu xạ đối với loại thực phẩm có chứa chất béo - Phân tích hydrocacbon bằng sắc kí khí.

[2] TCVN 7409 (EN 1785) Thực phẩm - Phát hiện thực phẩm chiếu xạ có chứa chất béo - Phân tích 2-alkylcyclobutanon bằng phương pháp sắc kí khí/phổ khối lượng.

[3] TCVN 7410 (EN 1786) Thực phẩm - Phát hiện thực phẩm chiếu xạ đối với loại thực phẩm có chứa xương - Phương pháp quang phổ ESR.

[4] Scotter, S.L., Holley, P., and Wood, R., 1990, Co-operative trial of methods of analysis to detect irradiation treatment of chicken samples: initial trial, Int. J. Food Sci. Technol., 25, 512-518.

[5] Scotter, S.L. Wood, R., and McWeeny, D., 1990, Evaluation of the Limulus amoebocyte lysate test in conjunction with a Gram negative bacterial count for detecting irradiation of chicken. Radiat. Phys. Chem., 36, 629-638.

[6] Scotter, S.L, Beardwood, K., and Wood, R., 1995, Detection of irradiation of poultry meat using the Limulus amoebocyte lysate test in conjunction with a Gram negative bacteria Count: Collaborative Trial. J. Assoc. Publ. Analysts. 31 (4), 163-178.

[7] Sudi, J., Suhren, G., Heeschen, W. and Tolle, A., 1981, Entwicklung eines miniaturisierten Limulus-Tests im Mikrotitier-System zum quantitativen Nachweis gram-negativer Bakterien in Milch und Milchprodukten (Development of a miniaturised Limulus assay using the microtitre system for the quantitative determination of Gram negative bacteria in milk and milk products). Milchwissenschaft, 36 (4), 193.

*) TCVN 8128-1:2009 (ISO/TS 11133-1:2000) hiện nay đã hủy và được thay thế bằng TCVN 8128:2015 (ISO 11133:2014), Vi sinh vật trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và nước - Chuẩn bị, sản xuất, bảo quản và thử hiệu năng của môi trường nuôi cấy.

1) Liều kế bằng chất dẻo persex tối màu là ví dụ về sản phẩm thích hợp có được từ Harwell, Vương quốc Anh đã được sử dụng cho thử nghiệm liên phòng. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm này. Các sản phẩm tương tự có thể được sử dụng nếu cho các kết quả tương đương.

...

...

...

3) Oxoid CM21 là ví dụ về sản phẩm thích hợp có bán sẵn trên thị trường. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm này. Các sản phẩm tương tự có thể được sử dụng nếu cho các kết quả tương đương.

4) Nước không chứa nội độc tố (pyrogen) thường có thể có được từ các nhà sản xuất cung cấp cho ngành dược phẩm.

5) Chất chuẩn đối chứng LPS là ví dụ về sản phẩm thích hợp có bán sẵn trên thị trường. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm này. Các phương pháp khác để xác định nồng độ LPS là có sẵn và có thể được thay thế nếu được chứng minh là cho các kết quả tương đương với kết quả phép phân tích vi lượng.

6) Tween 20^® là ví dụ về sản phẩm thích hợp có bán sẵn trên thị trường. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm này.

7) Đĩa vi giếng LAL và giấy Paraflim® là ví dụ về các sản phẩm thích hợp có bán sẵn trên thị trường. Thông tin này đưa ra ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng các sản phẩm này.

8) Đĩa vi giếng LAL là ví dụ về các sản phẩm thích hợp có bán sẵn trên thị trường. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng các sản phẩm này.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12077:2017 (EN 14569:2004) về Thực phẩm - Phát hiện thực phẩm chiếu xạ bằng kỹ thuật sàng lọc vi sinh vật sử dụng các quy trình xác định nồng độ nội độc tố/định lượng tổng vi khuẩn gram âm (LAL/GNB)