4  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và cụ thể như sau:

4.1  Máy sắc ký khí, có detector bắt giữ điện tử dạng xung ⁶³Ni.

Điều kiện vận hành

- Nhiệt độ cổng bơm:

210 °C;

- Nhiệt độ detector:

320 °C;

- Nhiệt độ cột GC:

...

...

...

- Tốc độ dòng nitơ:

25 ml/min;

- Dải đo của điện kế (electrometer):

10^-10 (trên toàn thang đo).

Khí bổ trợ cho detector, nếu cần (ví dụ: 40 ml/min).

4.2  Cột sắc ký, dài 1 800 mm, đường kính trong 2 mm, bằng thủy tinh, được nhồi OV-225 3 % (50 % cyanopropylphenyl, 50 % metyl) trên Gas-Chrom Q từ 100 mesh đến 120 mesh hoặc cột mao quản tương đương.

Ổn định cột 2 h bằng dòng khí ở nhiệt độ phòng, tăng nhiệt độ từ từ (khoảng 6 °C/min) đến 240 °C và giữ trong 16 h. Thời gian lưu các dẫn xuất pentafluoropropionic của putrescine, cadaverine và hexanediamine lần lượt là 7 min, 9 min và 12 min.

4.3  Cột chiết pha rắn (SPE), dung tích 3 ml, ví dụ cột chiết pha rắn SupelClean LC-alumina-N.

Kiểm tra hoạt tính của từng lô ống SPE như sau: Cho 2 ml dung môi ete dầu mỏ-toluen (3.12), đi qua ống SPE, sau đó thêm 50 µl vào dung dịch màu sudan I (3.13). Thêm vài giọt dung môi ete dầu mỏ-toluen (3.12) để loại bỏ màu từ đỉnh ống. Cho 3 ml dung môi qua cột. Nếu lớp chất tạo màu vẫn nằm phía trên cách đỉnh ống SPE 4 mm thì lô sản phẩm đáp ứng yêu cầu về làm sạch chất hiệu chuẩn.

...

...

...

4.5  Máy cô quay, duy trì ở nhiệt độ 50 °C ± 5 °C.

4.6  Nồi cách thủy, duy trì ở nhiệt độ 50 °C ± 5°C và 60 °C ± 5 °C.

4.7  Bình định mức, dung tích 100 ml và 1 L, có nắp đậy thủy tinh.

4.8  Bình cầu đáy tròn hoặc bình cầu đáy phẳng, dung tích 100 ml.

4.9  Ống đong chia vạch, dung tích 100 ml và 500 ml (có nắp đậy bằng thủy tinh).

4.10  Máy trộn, để chuẩn bị mẫu thử.

4.11  Pipet, có thể phân phối chính xác 1, 2, 3, 5,10 và 25 ml.

4.12  Micropipet, phân phối chính xác 50, 150 và 500 µl.

4.13  Giấy lọc gấp nếp.

...

...

...

5  Cách tiến hành

5.1  Chiết

Chiết mẫu bằng metanol 75 % như sau: Chuyển 10,00 g mẫu vào bình của máy trộn (4.10) và thêm khoảng 60 ml metanol 75 % (3.8). Trộn khoảng 2 min ở tốc độ cao. Chuyển vào bình định mức 100 ml (4.7), tráng nắp và bình trộn với methanol 75 % (3.8) và cho dịch tráng vào bình. Đặt bình trong nồi cách thủy ở 60 °C (4.6) và duy trì trong 15 min. Để nguội đến nhiệt độ phòng và thêm metanol 75 % (3.8) đến vạch. Trộn đều bằng cách lật ngược bình và lọc qua giấy lọc gấp nếp (4.13). Dịch chiết bằng metanol bền ít nhất 4 tháng khi bảo quản trong tủ lạnh.

Dùng pipet (4.11) lấy 10 ml dịch chiết metanol cho vào bình cầu đáy tròn hoặc đáy phẳng (4.8), thêm 1 ml dung dịch nội chuẩn làm việc hexanediamine (3.9.3) và khoảng 0,5 ml axit clohydric 1 M (3.5). Làm bay hơi đến khô trên máy cô quay (4.5) ở khoảng 50 °C đến 60 °C (Dịch chiết phải được làm bay hơi đến khô, với điều kiện làm mát và hút chân không đầy đủ để thu được mẫu khô). Sau khi dung môi bay hơi hết, thêm 2 ml đến 3 ml nước, khuấy và làm bay hơi tiếp (quá trình này sẽ loại bỏ hết các vết axit clohydric và đảm bảo dịch chiết khô). Cặn khô của dịch chiết metanol (trước khi phản ứng với PFP anhydrit) bền ít nhất 3 ngày.

Dùng xyranh (4.14) cho 1 ml etyl axetat (3.2) và 300 µl PFP anhydrit (3.1) vào cặn khô. Đậy nắp bình, trộn đều và đun 30 min ở 50 °C trong nồi cách thủy (4.6) (áp suất tăng do phản ứng PFP phát nhiệt, phải vặn chặn nắp).

Khuấy dung dịch ít nhất một lần trong suốt quá trình phản ứng. Sau khi phản ứng, hỗn hợp phản ứng chất phân tích sẽ chuyển màu vàng với hầu hết các sản phẩm thủy sản. (Nếu hỗn hợp phản ứng không có màu chứng tỏ có nước trong cặn của dịch chiết metanol. Trong trường hợp này, lặp lại bước làm bay hơi sau đó tiến hành phân tích). Trong vòng 2 h sau khi lấy ra khỏi nồi cách thủy, tiến hành bước tiếp theo để tinh sạch hỗn hợp phản ứng bằng ống SPE.

Thêm 2 ml toluen (3.3) vào hỗn hợp phản ứng PFP-chuẩn hiệu chuẩn putrescine-cadaverine. Thêm 2 ml hexan (3.4) vào từng ống SPE và để tự chảy. Loại bỏ hexan. Thêm 150 µl hỗn hợp phản ứng toluen PFP chuẩn hiệu chuẩn putrescine-cadaverine vào phía trên ống SPE. Bắt đầu thu lấy dịch chảy ra khi bổ sung hỗn hợp. Thêm 3 hoặc 4 giọt dung môi toluen 30 % etyl axetat (3.7) vào ống. Sau khi hỗn hợp chảy qua ống, thêm 2 ml dung môi toluen 30 % etyl axetat (3.7). Bổ sung tiếp 6 ml dung môi toluen 30 % etyl axetat (3.7) (tổng số 8 ml) và thu lấy toàn bộ dịch chảy ra. Dịch thu được bền ít nhất một tuần khi bảo quản trong tủ lạnh.

5.2  Xác định bằng GC

Chỉnh hệ thống GC cho toàn bộ thang đo của máy ghi khi bơm 1 µl dung dịch chuẩn hiệu chuẩn tạo dẫn xuất putrescine-cadaverine IV (3.14). Đối với các mẫu chứa các chất phân tích ở mức thấp hơn (ví dụ, nồng độ cadaverine từ 0 µg/g đến 5 µg/g), thì pha dung dịch chuẩn hiệu chuẩn tạo dẫn xuất putrescine-cadaverine III (5 µg/g) trên toàn thang đo.

...

...

...

CHÚ THÍCH; Chỉ yêu cầu hiệu chuẩn toàn bộ hệ thống bằng GC cách bơm lặp lại từng dung dịch chuẩn hiệu chuẩn putresdne-cadaverine ngay khi bắt đầu phân tích trừ khi thiết bị tắt trong khi phân tích. Khi phân tích phần mẫu thử trong ngày tiếp theo, cho chạy lại dung dịch chuẩn hiệu chuẩn putrescine-cadaverine II và III tạo dẫn xuất qua hệ thống GC để đảm bảo việc hiệu chuẩn thiết bị là ổn định).

6  Tính kết quả

6.1  Tỷ số đáp ứng của cadaverine trong dung dịch chuẩn hiệu chuẩn

Tỷ số đáp ứng của cadaverine (RS_c) trong từng dung dịch chuẩn hiệu chuẩn putrescine-cadaverine được tính bằng Công thức (1):

                                                                                                      (1)

Trong đó

PS_c là chiều cao pic của PFP cadaverine trong dung dịch chuẩn hiệu chuẩn putrescine-cadaverine;

PS_h là chiều cao pic của PFP hexanediamine trong dung dịch chuẩn hiệu chuẩn putrescine-cadaverine.

Dựng đồ thị RS_c theo số microgam cadaverine được tạo dẫn xuất.

...

...

...

Tỷ số đáp ứng của putrescine (RS_p) trong từng dung dịch chuẩn hiệu chuẩn putrescine-cadaverine được tính bằng Công thức (2):

                                                                                                      (2)

Trong đó

PS_p là chiều cao pic của PFP putrescine trong dung dịch chuẩn hiệu chuẩn putrescine-cadaverine;

PS_h là chiều cao pic của PFP hexanediamine trong dung dịch chuẩn hiệu chuẩn putrescine-cadaverine.

Dựng đồ thị RS_p theo số microgam putrescine được tạo dẫn xuất.

6.3  Tỷ số đáp ứng của cadaverine trong dung dịch mẫu thử

Tỷ số đáp ứng của cadaverine, RT_c, trong dung dịch mẫu thử được tính bằng Công thức (3):

                                                                                                       (3)

...

...

...

PT_c là chiều cao pic của PFP-cadaverine trong dung dịch thử;

PT_h là chiều cao pic của PFP-hexanediamine trong dung dịch thử.

6.4  Tính tỷ số đáp ứng của putrescine trong dung dịch mẫu thử

Tỷ số đáp ứng của putrescine trong dung dịch thử (RT_p) được tính bằng Công thức (4), sử dụng chiều cao pic của putrescine trong dung dịch thử (PT_p).

                                                                                                       (4)

Trong đó

PT_p là chiều cao pic của PFP-putrescine trong dung dịch thử;

PT_h là chiều cao pic của PFP-hexanediamine trong dung dịch thử.

6.5  Tính hàm lượng cadaverine

...

...

...

                                                                                               (5)

Trong đó

W_c là số microgam cadaverine đã tạo dẫn xuất;

F là hệ số pha loãng, nếu có;

W_t là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam (g).

Báo cáo kết quả đến 0,1 µg/g.

6.6  Tính hàm lượng của putrescine

Hàm lượng putrescine trong phần mẫu thử, X₂, tính bằng microgam trên gam (µg/g) được tính bằng Công thức (6):

                                                                                              (6)

...

...

...

W_p là số microgam putrescine đã tạo dẫn xuất;

F là hệ số pha loãng, nếu có;

W_t là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam (g).

Báo cáo kết quả đến 0,1 µg/g.

CHÚ THÍCH  Nếu giá trị thu được đối với putrescine và cadaverine trong phần mẫu thử cao hơn so với giá trị thu được đối với putrescine và cadaverine với hầu hết dung dịch chuẩn hiệu chuẩn putrescine-cadaverine đậm đặc, thì định lượng mức putrescine và cadaverine trong phần mẫu thử bằng cách phân tích một lượng dịch chiết bằng methanol 75 % nhỏ hơn (ví dụ 1 ml) và nhân với hệ số thích hợp để tính các giá trị biểu thị bằng microgam trên gam. Có thể bơm dung dịch thử với thể tích nhỏ hơn hoặc có thể điều chỉnh thiết bị để ước tính hàm lượng putrescine và cadaverine.

7  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

...

...

...

d) mọi thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc những điều được coi là tự chọn, và bất kỳ chi tiết nào có ảnh hưởng tới kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Các kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm

Bảng A.1 - Các kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm để xác định hàm lượng putrescine trong cá ngừ đóng hộp bằng sắc ký khí^a

Mẫu thử

Giá trị trung bình

...

...

...

s_R

RSD_r

RSD_r

r

R

µg/g

µg/g

µg/g

...

...

...

%

1

0,323

0,053

0,064

16,49

19,75

...

...

...

0,179

2

0,184

0,028

0,080

15,57

43,6

0,078

0,224

...

...

...

0,524

0,089

0,141

17,09

26,86

0,249

0,395

4

0,778

...

...

...

0,072

7,51

9,23

0,162

0,202

5

2,606

0,196

0,209

...

...

...

8,03

0,549

0,585

6

4,545

0,234

0,399

5,17

8,77

...

...

...

1,117

^a Dựa trên các kết quả nhận được từ 14 phòng thử nghiệm.

s_r: Độ lệch chuẩn lặp lại

s_R: Độ lệch chuẩn tái lập

RSD_r: Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại

RSD_r: Độ lệch chuẩn tương đối tái lập

r (=2,8 x s_r): Giới hạn lặp lại

R (= 2,8 x s_R): Giới hạn tái lập

Bảng A.2 - Các kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm để xác định hàm lượng cadaverine trong cá ngừ đóng hộp và cá nục đóng hộp bằng sắc ký khí^a

...

...

...

Giá trị trung bình,

s_r,

s_r,

RSD_r,

RSD_r,

r

R

µg/g

...

...

...

µg/g

%

%

Cá ngừ đóng hộp

0,564

0,056

0,104

...

...

...

18,40

0,157

0,291

Cá ngừ đóng hộp

1,064

0,082

0,104

7,71

9,80

...

...

...

0,291

Cá ngừ đóng hộp

1,118

0,099

0,117

8,88

10,49

0,277

0,328

...

...

...

2,573

0,076

0,111

2,98

4,55

0,213

0,311

Cá ngừ đóng hộp

9,120

...

...

...

0,648

5,65

7,1

1,442

1,814

Cá ngừ đóng hộp thêm chuẩn

5,171

0,779

0,914

...

...

...

17,68

2,181

2,559

Cá nục heo

8,390

0,418

1,239

4,45

14,77

...

...

...

3,469

^a Dựa trên các kết quả nhận được từ 14 phòng thử nghiệm.

s_r: Độ lệch chuẩn lặp lại

s_R; Độ lệch chuẩn tái lập

RSD_r: Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại

RSD_r: Độ lệch chuẩn tương đối tái lập

r (=2,8 x s_r): Giới hạn lặp lại

R (= 2,8 x s_R): Giới hạn tái lập

Bảng A.3 - Độ thu hồi putrescine được bổ sung vào cá ngừ đóng hộp^a

...

...

...

Nền mẫu

Kết quả phát hiện được

Kết quả thu hồi được

Độ thu hồi

µg/g

µg/g

µg/g

%

...

...

...

0,35

4,60

4,25

86,38

4,80

4,45

90,45

...

...

...

0,31

5,35

5,04

102,44

4,82

4,51

91,67

...

...

...

0,35

4,78

4,43

90,04

4,65

4,30

87,40

...

...

...

0,32

4,88

4,56

92,68

4,83

4,51

91,67

...

...

...

0,33

4,83

4,50

91,46

4,51

4,18

84,96

...

...

...

0,42

4,00

3,58

72,76

4,15

3,73

75,81

...

...

...

0,24

4,66

4,42

89,84

4,74

4,50

91,46

...

...

...

0,31

4,71

4,40

89,43

4,59

4,28

86,99

...

...

...

0,26

4,57

4,31

87,60

3,74

3,48

70,73

...

...

...

0,40

4,61

4,21

85,57

4,42

4,02

81,71

...

...

...

87,05

^a putrescine được bổ sung vào cá ngừ với hàm lượng 4,92 µg/g.

Bảng A.4 - Độ thụ hồi cadaverine được bổ sung vào cá ngừ đóng hộp^a

Phòng thử nghiệm

Nền mẫu
µg/g

Kết quả phát hiện được
µg/g

...

...

...

Độ thu hồi,
%

A

0,53

5,10

4,57

91,95

5,40

...

...

...

97,99

B

0,54

5,33

4,79

96,38

5,48

...

...

...

99,40

C

0,46

5,35

4,89

98,39

5,33

...

...

...

97,99

D

0,57

5,40

4,83

97,18

5,30

...

...

...

95,17

E

0,50

5,33

4,83

97,18

4,58

...

...

...

82,09

F

0,58

5,38

4,80

96,58

5,32

...

...

...

95,37

G

0,59

5,43

4,84

97,38

5,50

...

...

...

98,79

H

0,72

5,38

4,66

93,76

5,66

...

...

...

99,40

I

0,60

5,52

4,92

98,99

4,41

...

...

...

76,66

J

0,71

6,13

5,42

109,05

6,27

...

...

...

111,87

Trung bình độ thu hồi, %

96,58

^a cadaverine được bổ sung vào cá ngừ với hàm lượng 4,97 µg/g.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11941:2017 về Thuỷ sản và sản phẩm thuỷ sản - Xác định hàm lượng putrescine và cadaverine - Phương pháp sắc ký khí