3.9.3  Đánh giá sự phù hợp của hệ thống

Sau khi chuẩn bị các dung dịch chuẩn gốc và dung dịch chuẩn làm việc, hiệu năng của hệ thống HPLC (4.8) được xác định như sau: Tiêm dung dịch chuẩn làm việc khoảng 0,320 µg/ml ít nhất 5 lần liên tục. Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của đáp ứng ở ít nhất 5 lần tiêm không quá 2 %. Ngoài ra, tiêm dung dịch chuẩn làm việc khoảng 0,0400 µg/ml ít nhất 3 lần và tính tỷ số tín hiệu trên nhiễu (S/N). Tỷ số tín hiệu trên nhiễu phải >10. Thời gian lưu của axit aristolochic-1 trong khoảng 21 min ± 3 min. Tốc độ dòng chảy có thể được điều chỉnh để đạt được thời gian lưu mong muốn.

Các điều kiện HPLC có thể cần được thay đổi để có được hệ thống phù hợp mong muốn.

4  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

4.1  Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,00001 g.

4.2  Máy nghiền loại nhỏ, loại dùng để nghiền cafe hoặc gia vị.

4.3  Máy lắc.

4.4  Cột sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC).

...

...

...

4.4.2  Với đầu dò sắc kí lỏng khối phổ bẫy ion, ví dụ Zorbax SB-C18, 5 µm, kích thước 15 cm x đường kính trong 3,0 mm.

4.4.3  Với sắc kí lỏng khối phổ đầu dò 3 tứ cực, ví dụ Zorbax SB-C18, 5 µm, kích thước 5 cm x đường kính trong 2.1 mm.

4.5  Sàng, cỡ lỗ 400 µm.

4.6  Hệ thống sắc kí lỏng khối phổ, bẫy ion hoặc ba tứ cực

4.7  Máy quang phổ tử ngoại-khả kiến (UV-VIS), đo độ hấp thụ ở bước sóng 390 nm.

4.8  Hệ thống HPLC, có trang bị detector tử ngoại khả kiến (UV-VIS).

4.9  Bộ lọc xyranh, 13 mm với màng lọc PTFE cỡ lỗ 0,45 µm.

4.10  Hệ thống dữ liệu cho HPLC.

4.11  Hệ thống dữ liệu cho sắc ký lỏng phổ khối lượng.

...

...

...

CHÚ THÍCH  Các thiết bị tương đương có thể được sử dụng. Tất cả các dụng cụ thủy tinh phải phù hợp loại A^[1].

5  Lấy mẫu

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình bảo quản và vận chuyển.

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nếu không có tiêu chuẩn cụ thể nào liên quan đến sản phẩm cần phân tích thì các bên tự thảo thuận về vấn đề này.

6  Cách tiến hành

Cho vật liệu nghiền qua sàng cỡ lỗ 400 µm (4.5), nếu cần và trộn kỹ. Cân khoảng 2 g mẫu thử cho vào bình có nắp đậy. Thêm 100 ml dung môi chiết (3.1). Lắc tối thiểu 30 min trên máy lắc (4.3) đặt ở chế độ lắc cố định. Pha loãng dung dịch thử với dung môi chiết cho thích hợp với đường chuẩn, nếu cần. Dung dịch thử có thể được bảo quản lạnh không quá 2 ngày. Lọc dung dịch thử bằng bộ lọc xyranh có màng lọc cỡ lỗ 0,45 µm (4.9) rồi tiến hành phân tích HPLC và định lượng. Sử dụng các thông số nêu trong Bảng 2. Tiêm từng dung dịch chuẩn làm việc (3.9.2), một bộ ở thời điểm bắt đầu và một bộ ở thời điểm kết thúc chạy. Tiêm dung dịch chuẩn sau mỗi 4 dung dịch thử, bắt đầu ở mức thấp nhất, tiếp đến 4 dung dịch thử tiếp theo, sau đó là dung dịch chuẩn cao nhất v.v... Sử dụng tất cả các giá trị đo được của dung dịch chuẩn để dựng đường chuẩn.

Bảng 2 - Thông số HPLC-UV

Cột HPLC

Zorbax SB-C18, 5 µm, đường kính 3,0 mm x 25 cm, Agilent

...

...

...

0,1% (thể tích) axit trifluoroacetic - nước

Pha động B

0,1% (thể tích) axit trifluoroacetic - axetonitril

Chương trình tiêm

Thời gian, min

% A

% B

Đường gradient

0

...

...

...

20

Không áp dụng

25

30

70

1^b

30

0

100

...

...

...

31

80

20

1

40

80

20

Không áp dụng

Detector

...

...

...

Nhiệt độ cột, °C

40

Tốc độ dòng

Khoảng 0.5 ml/min; tốc độ dòng phải điều chỉnh được sao cho có thể thu được thời gian lưu mong muốn

Thể tích tiêm, µl

25

...

...

...

Thời gian tiêm, min

40

^b đường gradient cho thấy sự chuyển đổi tuyến tính.

7  Khẳng định bằng sắc kí lỏng khối phổ

Khi xác định bằng LC-UV, axit aristolochic-1 xác định được ở nồng độ > 2 µg/g, được khẳng định bằng LC/MS/MS. Phổ của chất chuẩn được sử dụng để khẳng định sự có mặt của axit aristolochic-1 so với phổ của mẫu ở thời gian lưu tương tự. Mỗi diện tích pic được phát hiện của chuẩn hoặc mẫu với các ion con được chia bằng diện tích pic của một ion con với diện tích pic lớn nhất. Nếu nhiều mẫu và chuẩn được tiêm vào thì tính trung bình tất cả các tỷ lệ tương ứng. Để khẳng định, tỷ lệ mẫu nên bằng ± 10 % tỷ lệ chuẩn trung bình (chênh lệch số học). Ví dụ, tỷ lệ trung bình của chuẩn là 50 %, thì tỷ lệ mẫu là từ 40 % đến 60 %.

Các điều kiện sắc kí và ion hóa được kiểm soát đối với ba tứ cực nêu trong Bảng 3 và đối với bẫy ion nêu trong Bảng 4.

Bảng 3 - Các điều kiện sắc ký đối với sắc ký lỏng khối phổ ba tứ cực

Cột HPLC

...

...

...

Pha động A

Metanol 5,0 %, axit formic 0,1 %, và amoni axetat 10 mM trong nước đã khử ion

Pha động B

Axetonitril-metanol (1+1) chứa axit formic 0,1 % (thể tích) và amoni axetat 10 mM trong nước đã khử ion

Chương trình tiêm

Thời gian, min

A %

B %

Gradient

...

...

...

70

30

Không áp dụng

13

30

70

1^b

15

0

...

...

...

1

16

70

30

1

20

70

30

Không áp dụng

...

...

...

40

Tốc độ dòng, ml/min

0.2

Thể tích tiêm, µl

25

Đưa mẫu

...

...

...

Chế độ

Dải khối lượng

Quét các ion con đặc trưng,

dwell = 0,25 s

Nhiệt độ nguồn, °C

150

...

...

...

350

Tốc độ khí hóa hơi, l/h

600

Lưu lượng khí cone, l/h

60

Các ion được kiểm soát trong phép khẳng định khối phổ LC/MS

...

...

...

Ion mẹ (m/z)

Ion con (m/z)

Cone, V

Năng lượng bắn phá, eV

[axit aristolochic-1 + NH₄]⁺

359,1

265, 281, 296

18

40, 40, 30

...

...

...

Cột HPLC

Zorbax SB-C18, đường kính 3 mm x 150 mm, Agilent

Pha động A

axit formic 0,1 % (thể tích) và amoni axetat 0,1 % (khối lượng/thể tích) trong nước đã khử ion

Pha động B

axit formic 0,1 % (thể tích) và amoni axetat 0,1 % (khối lượng/thể tích) trong metanol

Chương trình tiêm

Thời gian, min

% A

...

...

...

gradient

0

80

20

Không áp dụng

20

0

100

1^b

...

...

...

80

20

1

25

80

20

Không áp dụng

Nhiệt độ cột, °C

40

...

...

...

Tốc độ dòng, mL/min

0.5

Thể tích tiêm, µL

30

...

...

...

Bẫy ion

Chế độ

Scan dải nồng độ

m/z 80 to 370

Dòng phóng điện, µA

...

...

...

Nhiệt độ mao quản đã gia nhiệt, °C

150

Nhiệt độ hóa hơi, °C

450

...

...

...

Cài đặt khí bay hơi

70

Cài đặt khí bổ trợ

20

Các ion được kiểm soát trong phép khẳng định khối phổ bẫy ion

...

...

...

Ion mẹ (m/z)

Ion

Độ rộng phân tách (m/z)

Năng lượng va chạm tương đối, %

Axit aristolochic-1

359

298

2

30

...

...

...

298,0 (từ ion con ở trên)

251, 252, 268

2

35

8  Tính kết quả

Đường chuẩn thu được từ hồi quy tuyến tính của tất cả diện tích pic và nồng độ của chuẩn làm việc. Hệ số tương đối (r) phải ≥ 0,99500. Xác định nồng độ axit aristolochic-1 của mẫu đã tiêm từ phân tích hồi quy.

Hàm lượng chất phân tích trong mẫu thử, X, được tính bằng microgam trên gam (µg/g), theo Công thức (3):

                                                                                                   (3)

Trong đó:

...

...

...

V là thể tích dung môi chiết, tính bằng mililit (ml);

D là hệ số pha loãng, nếu có;

W là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam (g).

9  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ít nhất bao gồm các thông tin sau:

- mọi thông tin cần thiết cho việc nhận biết đầy đủ về mẫu;

- phương pháp lấy mẫu, nếu biết;

- phương pháp thử, viện dẫn tiêu chuẩn này;

- mọi điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được xem là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả;

...

...

...

Phụ Lục A

(tham khảo)

Kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm đối với axit aristolochic-1

Bảng A.1 - Kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm đối với axit aristolochic-1

Tên mẫu

Trung bình, µg/g

S_r^a

RSD_r^b, %

...

...

...

RSD_r^d, %

Số PTN ngoại lệ

Chỉ số HorRat

Số PTN sử dụng

Aristolochia manschuriensis, thân

2610

44,9

1,72

222

...

...

...

2

1,7

8

Clematis armandii, thân

6,94

0,654

9,42

0,850

12,3

...

...

...

1,0

9

Viên nén bổ sung liều cao, rễ Aristolochia spp. 20 µg/g

12,8

2,08

16,3

2,53

19,8

0

...

...

...

10

Aristolochia spp., rễ

1290

23,8

1,85

69,7

5,42

0

1,0

...

...

...

Clematis armandii, thân, bổ sung liều thấp Aristolochia spp. 10 µg/g, rễ

206

0,754

7,31

0,875

8,48

0

0,8

10

...

...

...

10,0

1,18

11,8

1,82

18,2

0

1,6

10

Akebia trifoliata, thân, bổ sung ít Aristolochia spp. 10 µg/g, rễ

...

...

...

0,518

6,61

0,807

10,3

0

0,9

10

Viên nén bổ sung liều thấp Aristolochia spp. 10 µg/g, rễ

6,58

...

...

...

13,3

0,875

13,3

2

1,1

8

Stephania tetrandra, rễ, bổ sung liều cao Aristolochia spp. 20 µg/g, rễ

16,7

0,844

...

...

...

1,16

6,92

3

0,7

7

Akebia trifoliata, thân, bổ sung liều cao Aristolochia spp. 20 µg/g, rễ

15,0

0,790

5,25

...

...

...

13,7

0

1,3

10

Clematis armandii, thân, bổ sung liều cao Aristolochia spp. 20 µg/g, rễ

20,5

0,849

4,14

1,68

...

...

...

0

0,8

10

Akebia trifoliata, thân

< 2,00

NA^e

NA

NA

NA

...

...

...

NA

9

Stephania tetrandra, rễ

< 2,00

NA

NA

NA

NA

0

...

...

...

10

^a S_r là độ lệch chuẩn lặp lại.

^b RSD_r là độ lệch chuẩn tương đối lặp lại.

^c S_R là độ lệch chuẩn tái lập.

^d RSD_R độ lệch chuẩn tương đối tái lập.

^e NA là không áp dụng.

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] TCVN 7153 (ISO 1042), Dụng cụ thí nghiệm bằng thủy tinh - Bình định mức.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11940:2017 về Thực phẩm bổ sung và nguyên liệu thực vật - Xác định axit aristolochic-1 - Phương pháp sắc ký lỏng với detector UV (LC-UV) và khẳng định bằng sắc ký lỏng phổ khối lượng