3.14  Thuốc thử dùng cho LC/UV

3.14.1  Pha động A đối với LC/UV, trietylamin 20 mM trong nước được điều chỉnh đến pH 3 bằng hỗn hợp axit phosphoric-metanol (95 + 5).

3.14.2  Pha động B đối với LC/UV, metanol.

3.14.3  Pha động đối với sắc ký lỏng ghép khối phổ (đẳng dòng).

Hỗn hợp metanol-amoni format 20 mM trong axit formic 0,1 % (45 + 55).

4  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

4.1  Hệ thống LC/UV, có detector quang phổ tử ngoại khả kiến, bơm bốn kênh, bộ lấy mẫu tự động, bộ phận gia nhiệt cho cột, bộ thu nhận và xử lý số liệu.

4.2  Hệ thống sắc ký lỏng ghép khối phổ

...

...

...

4.3  Cột sắc ký (dùng cho hệ thống LC/UV), ví dụ: Zorbax Eclipse XDB-C8, 5 µm, 4.6 x 150 mm với cột bảo vệ.

4.4  Cột sắc ký (dùng cho hệ thống LC/MS/MS) ví dụ: Xterra MS C8, 3.5 µm, 2.1 x 150 mm.

4.5  Bộ chiết pha rắn, ví dụ: Gilson Inc.

4.6  Cột chiết, ví dụ: Oasis MCX SPE, 3 ml, 60 mg.

4.7  Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg.

4.8  Bể siêu âm.

4.9  Máy ly tâm, có tốc độ tối đa 5 000 r/min với bán kính của roto là 15 cm.

4.10  Ống ly tâm, dung tích 50 ml.

4.11  Pipet, có thể phân phối từ 100 µl đến 1000 µl.

...

...

...

4.13  Bình định mức, dung tích 10 ml.

4.14  Máy lắc ngang, có thể đạt tốc độ đến 300 r/min.

5  Lấy mẫu

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình bảo quản và vận chuyển.

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nếu không có tiêu chuẩn cụ thể nào liên quan đến sản phẩm cần phân tích thì các bên tự thỏa thuận về vấn đề này.

6  Cách tiến hành

6.1  Chiết

Dùng cân (4.7), cân chính xác khoảng 1,0 g mẫu cho vào ống ly tâm dung tích 50 ml (4.10). Thêm 1 ml dung dịch amoni hydroxit 10 % (3.7.2). Khuấy đều để làm ẩm toàn bộ mẫu. Sau đó thêm 25 ml dietyl ete (3.5) vào ống. Lắc ống trên máy lắc ngang (4.14) trong 1 h ở tốc độ 300 r/min. Ly tâm mẫu ở 4 000 r/min trong 10 min để chất rắn lắng xuống.

CẢNH BÁO: Để tránh thất thoát ete bay hơi và nguy cơ nổ, ống phải có khả năng chịu được lực và phải được đậy kín để tránh rò rỉ.

...

...

...

6.2  Làm sạch cột chiết pha rắn trao đổi cation hỗn hợp

Ổn định cột chiết pha rắn với 1 ml metanol (3.1) và 1 ml nước. Sau khi nạp 4 ml dung dịch mẫu vào cột chiết pha rắn, rửa cột liên tiếp với 1 ml dung dịch axit axetic 0,1 % (3.3), 1 ml metanol (3.1), 1 ml nước và 1 ml dung dịch rửa giải cột chiết pha rắn (3.10). Làm khô cột và rửa giải các chất phân tích ra khỏi cột bằng 2 ml dung dịch rửa giải chiết pha rắn. Tốc độ dòng chảy cho việc nạp dung dịch mẫu là 0,2 ml/min, tốc độ dòng chảy cho các bước khác là 0,5 ml/min. Thu dung dịch rửa giải vào ống nghiệm của hệ thống chiết pha rắn. Làm bay hơi dung môi đến khô ở nhiệt độ nhỏ hơn hoặc bằng 40 °C dưới dòng khí nitơ.

CHÚ THÍCH Các chất phân tích sẽ bị phân hủy dần với chu kỳ bán rã là 4 ngày đến 5 ngày khi được giữ trong dung dịch rửa giải chiết pha rắn.

Hòa tan lại lượng cặn trong 1 ml hỗn hợp axetonitril-axit axetic 0,1 % (3.11) và siêu âm trong 20 min. Dung dịch sẵn sàng để phân tích sắc ký sau khi cho qua bộ lọc màng cỡ lỗ 0,45 µm (4.12). Dùng hỗn hợp axetonitril-axit axetic 0,1 % để pha loãng thích hợp nếu các tín hiệu của các chất phân tích trong dịch chiết mẫu nằm ngoài dải hiệu chuẩn.

6.3  Xác định các aconitum alkaloid bằng LC/UV

6.3.1  Điều kiện hoạt động LC/UV

Các điều kiện vận hành sau đây được coi là thích hợp:

Nhiệt độ cột:

25 °C;

...

...

...

1,0 ml/min;

Thể tích tiêm:

10 µl;

Bước sóng phát hiện:

235 nm;

Thời gian chạy:

56 min.

Chương trình gradient được nêu trong Bảng 2. Sắc ký đồ điển hình của dung dịch chuẩn được thể hiện trong Hình 1.

Bảng 2 - Chương trình gradient để xác định LC/UV

...

...

...

min

Pha động A

%

Pha động B

%

Tốc độ dòng

ml/min

0

70

...

...

...

1,0

20

70

30

1,0

25

60

40

1,0

...

...

...

60

40

1,0

50

30

70

1,0

51

70

...

...

...

1,0

60

70

30

1,0

Hình 1 - Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn hỗn hợp (10 µg/ml)

6.3.2  Dựng đường chuẩn

Dựng đường chuẩn của diện tích pic của từng chất phân tích trong dung dịch chuẩn làm việc theo nồng độ chất phân tích.

...

...

...

Xác định nồng độ của từng chất phân tích trong dung dịch chiết mẫu từ đường hiệu chuẩn. Nếu nồng độ của chất phân tích trong dịch chiết mẫu vượt quá dải hiệu chuẩn, tiến hành pha loãng thích hợp và lặp lại việc xác định.

6.4  Khẳng định bằng sắc kí lỏng khối phổ

6.4.1  Khái quát

Khi một aconitum alkaloid được phát hiện ở nồng độ ≥ 1 mg/kg bằng LC/UV, đặc điểm nhận dạng của chất được khẳng định lại bằng LC/MS/MS. Để khẳng định, cường độ của tín hiệu cặp ion kiểm soát đa phản ứng tương ứng MRM phải ≥ 400 cps (Bảng 4).

Bảng 4 - Cặp ion MRM để khẳng định

Alkaloid

Ion mẹ, m/z

Ion con, m/z

Aconitin

...

...

...

586

Hypaconitin

616

556

Mesaconitin

632

572

6.4.2  Điều kiện hoạt động LC/MS/MS

Các điều kiện vận hành sau đây được coi là thích hợp:

...

...

...

Khí chắn:

8 đơn vị;

Bộ phận tạo sol khí:

15 đơn vị;

Điện thế nguồn phun ion:

5000 V;

Nhiệt độ:

350 °C.

Tốc độ dòng chảy của pha động được đặt ở mức 200 µl/min.

...

...

...

Tính nồng độ của mỗi chất phân tích trong mẫu thử, C, biểu thị bằng miligam trên kilogam (mg/kg), theo công thức sau:

(1)

Trong đó:

A là nồng độ chất phân tích trong dung dịch thử (xem 6.3.3), tính bằng miligam trên lít (mg/l);

W là khối lượng của mẫu đã sử dụng, tính bằng gam (g);

V là thể tích cuối của dung dịch mẫu, tính bằng mililit (ml);

D là hệ số pha loãng, nếu có;

5/4 là hệ số để tính phần chất chiết lấy ra để làm sạch.

8  Báo cáo thử nghiệm

...

...

...

- mọi thông tin cần thiết cho việc nhận biết đầy đủ về mẫu;

- phương pháp lấy mẫu, nếu biết;

- phương pháp thử, viện dẫn tiêu chuẩn này;

- mọi điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được xem là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả;

- kết quả thử nghiệm thu được hoặc nếu kiểm tra độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được.

Phụ lục A

(tham khảo)

Kết quả thử nghiệm liên phòng

...

...

...

Mẫu^a

Trung bình mg/kg

S_r

RSD_r, %

S_r

RSD_r, %

Số phòng thử nghiệm ngoại lệ

Chỉ số HorRat

Số phòng thử nghiệm tham gia

...

...

...

A

0,73

0,13

16,7

0,25

33,0

2

1,98

9

...

...

...

6,28

0,22

3,5

1,80

28,8

1

2,37

10

C

...

...

...

0,14

3,4

0,63

15,3

2^b

1,18

8

D

8,37

...

...

...

6,0

1,58

18,8

0

1,62

11

E

0,89

0,04

...

...

...

0,20

23,1

1

1,42

10

F

ND^c

-

-

...

...

...

-

-^d

-

9

G

ND

-

-

-

...

...

...

-

-

11

Mesaconitin

A

3,11

0,20

6,5

0,82

...

...

...

1

1,93

10

B

33,2

2,05

6,2

4,44

13,4

...

...

...

1,42

10

C

4,08

0,15

3,7

0,98

24,3

2^b

...

...

...

8

D

8,64

0,42

4,9

1,16

13,4

0

1,16

...

...

...

E

0,98

0,06

6,1

0,18

18,5

1

1,15

10

...

...

...

ND

-

-

-

-

-^d

-

9

G

...

...

...

-

-

-

-

1

-

10

Hypaconitin

A

...

...

...

0,16

13,9

0,31

27,3

2

1,74

9

B

85,2

...

...

...

1,9

5,57

6,5

2

0,80

9

C

4,48

0,17

...

...

...

0,55

12,5

3^b

0,97

7

D

8,85

0,21

2,4

...

...

...

13,2

1

1,14

10

E

0,90

0,06

6,5

0,16

...

...

...

1

1,06

10

F

ND

-

-

-

-

...

...

...

-

8

G

ND

-

-

-

-

-

...

...

...

11

Trong đó:

^a Mẫu

A là thức ăn bổ sung;

B là R. aconiti đã chế biến;

C là thức ăn bổ sung đã thêm 5 mg/kg kiểm chứng âm;

D là bổ sung lượng cao 10 mg/kg nguyên liệu thực vật kiểm chứng âm;

E là bổ sung lượng thấp 1 mg/kg nguyên liệu thực vật kiểm chứng âm;

F là nguyên liệu thực vật kiểm chứng âm;

...

...

...

^b Thêm một phòng thử nghiệm đã được loại bỏ vì các dữ liệu nghi ngờ bị lẫn với những mẫu khác.

^c ND là không phát hiện.

^d Hai phòng thử nghiệm đã được loại bỏ vì các dữ liệu nghi bị lẫn với những mẫu khác.

S_r Độ lệch chuẩn lặp lại

RSD_r Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại

S_r Độ lệch chuẩn tái lập

RSD_r Độ lệch chuẩn tương đối tái lập.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11937:2017 về Thực phẩm bổ sung và nguyên liệu thực vật - Xác định aconitum alkaloid - Phương pháp sắc kí lỏng với detector UV (LC-UV)