B.1.2.2.2  Phép thử độ chọn lọc ngoại trừ

Độ chọn lọc ngoại trừ của phép phân tích PCR được thử nghiệm trên 51 chủng không phải đích, cho kết quả độ chọn lọc ngoại trừ là 100 % (xem bảng B.2). Các chủng thử nghiệm được phân lập từ người, động vật và nguồn gốc thực phẩm.

Bảng B.2 - Phép thử độ chọn lọc ngoại trừ sử dụng 51 chủng không phải đích

Các loài bio/serotyp
(số lượng chủng)

Số lượng chủng thu được trong khuếch đại đoạn gen đích

Y. enterocolitica 1A/O:5

(2)

0

Y. enterocolitica 1A/O:6, 30

...

...

...

0

Y. enterocolitica 1A/O:10

(1)

0

Y. frederiksenii

(2)

0

Y. kristensenii

(2)

...

...

...

Y. intermedia

(2)

0

Y. aldovae

(1)

0

Y. mollaretii

(1)

0

...

...

...

(3)

0

Các loài vi khuẩn gây bệnh liên quan đến thực phẩm

(34)

0

Saccharomyces cerevisiae

(1)

0

Aspergillus niger

...

...

...

0

Tổng số

(51)

0

B.1.2.2.3  Độ chọn lọc phân tử

Theo nghiên cứu BLAST (16/05/2011) mồi và đầu dò đã được đánh giá xác nhận in silico.

B.1.2.3  Độ nhạy

B.1.2.3.1  Độ nhạy phản ứng

Giới hạn phát hiện là 5 gen tương đồng (genome equivalent) [25 femtogam (fg)] trên một phản ứng. Tất cả các phép phân tích được thực hiện với sự có mặt của khoảng 25 bản sao kiểm soát khuếch đại bên trong (IAC).

...

...

...

Mức phát hiện LOD₉₅^[17] của phương pháp PCR là 10,7 cfu trên 25 g thực phẩm. Giới hạn phát hiện của phương pháp này đã được đánh giá bằng cách đo bốn nền mẫu thực phẩm khác nhau, ở đây là xúc xích Mortadella, bắp cải, sữa thanh trùng và cá sống, được nuôi cấy ở mức nhiễm 5 cfu và 50 cfu trong 25 g với sáu lần lặp lại cho mỗi mức nhiễm. Sau 48 h tăng sinh trong PSB, giới hạn phát hiện trong xúc xích Mortadella, cá sống và sữa thanh trùng là 5 cfu trong 25 g và trong bắp cải là 50 cfu trong 25 g.

B.1.2.3.3  Các thông số hiệu năng liên quan đến độ chính xác tương đối, độ nhạy tương đối và độ đặc hiệu tương đối

Độ chính xác tương đối

AC

89,5 %

Độ nhạy tương đối

SE

100 %

Độ đặc hiệu tương đối

...

...

...

76,7 %

Các thông số hiệu năng đã được đánh giá bằng cách so sánh với phương pháp nuôi cấy theo Điều 5 của TCVN 8127:2009 (ISO 10273:2003).

CHÚ THÍCH: Các dữ liệu này thu được bằng cách phân tích các mẫu nhiễm nhân tạo.

B.1.2.4  Độ chắc chắn

Độ chắc chắn của PCR đã được thử nghiệm bằng cách áp dụng các thay đổi sau đây trong việc thiết lập phản ứng,

- Tăng và giảm nồng độ mồi và đầu dò khoảng ± 20 % với sự có mặt của 25 bản sao kiểm soát khuếch đại bên trong.

- Sử dụng hai công thức khác nhau của mastermix Taq-polymerase từ hai nhà cung cấp.

Các thay đổi không ảnh hưởng đến hiệu năng phản ứng.

B.1.2.5  Thiết bị

...

...

...

Các thiết bị real-time PCR khác nhau ít ảnh hưởng đến hiệu năng của phương pháp.

B.1.3  Cách tiến hành

B.1.3.1  Nguyên tắc

Một đoạn ADN đặc hiệu của locus ail Yersinia enterocolitica được khuếch đại và phát hiện bằng real-time PCR. Hệ thống real-time PCR dựa trên đầu dò thủy giải đặc hiệu được đánh dấu bằng Carboxyfluorescein (FAM) làm phân tử phát huỳnh quang và Dabcyl làm phân tử dập tắt huỳnh quang.

B.1.3.2  Thuốc thử

B.1.3.2.1  Yêu cầu chung

Đối với chất lượng của thuốc thử được sử dụng, xem TCVN 11134 (ISO 22174).

B.1.3.2.2  Thuốc thử dùng cho PCR

Xem TCVN 11133 (ISO 22119) và TCVN 7682 (ISO 20838).

...

...

...

B.1.3.2.3.1  Oligonucleotid, Y. enterocolitica gây bệnh

Bảng B.3 - Trình tự của các oligonucleotid

Mồi và đầu dò

Trình tự ADN của oligonucleotid (5' - 3')

Kích thước sản phẩm PCR

ye-ail-F2

5'-GGT TAT GCA CAA AGC CAT GTA AA -3'

93 bp

ye-ail-R2

...

...

...

Đầu dò ye-ail-tmp

5'-FAM-AAC CTG AAG TAC CGT TAT GAA CTC GAT GA-DB-3'a

^a FAM: 6 Carboxytluorescein, DB: Dabcyl.

B.1.3.2.3.2  Oligonucleotid, kiểm soát khuếch đại bên trong, IAC

Bảng B.4 - Trình tự các oligonucleotid

Tên

Trình tự DNA của oligonucleotide (5' - 3')

Kích thước sản phẩm PCR

...

...

...

pUC 18-R

Đầu dò Tm-pUC18

5'-TGT CGT GCC AGC TGC ATT A-3'

5'-GAG CGA GGA AGC GGA AGA G-3'

5'-TexasRed - AAT CGG CCA ACG CGC GG -BHQ2-3'a

83 bp

^a TexasRed: Sulforhodamin-101-Sulfonylchlorid, BHQ2:N-Nitrophenylazo-dimethoxy-phenylazo-phenyl-N-dimethoxytrityloxy-etyl-2-aminoethyl-l-oxyglycolat (Black-Hole Quencher 2^TM).

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng phân tử phát và/hoặc phân tử tắt tương đương.

B.1.4  Quy trình chạy phân tử

...

...

...

Chuyển 1 ml từng dung dịch mẫu được liệt kê ở trên vào ống phản ứng 1,5 ml và ly tâm 10 min ở 13 000 x g. Cặn vi khuẩn được rửa hai lần trong 1 ml NaCl 0,9 % và cuối cùng hòa vào 200 μl nước dùng cho sinh học phân tử. Sau khi ủ 10 min ở 95 °C, dùng 2,5 μl làm khuôn mẫu cho real-time PCR.

B.1.4.2  Cài đặt PCR

Tổng thể tích thuốc thử dùng cho mỗi phản ứng PCR là 25 μl. Các loại thuốc thử được liệt kê trong Bảng B.5.

Bảng B.5 - Bổ sung các thuốc thử

Thuốc thử (nồng độ gốc)

Nồng độ cuối cùng

Thể tích/phản ứng (μl)

LightCycler® 480 Probes Master^a (chứa Fast Start Taq ADN polymerase, đệm phản ứng, dNTP-mix với dUTP thay cho dTTP và 6,4 mmol/1 MgCl₂)

1 x

...

...

...

ye-ail-F2 (10 μmol/l)

300 nmol/l

0,75

ye-ail-R2 (10 μmol/l)

300 nmol/l

0,75

ye-ail-tmp (10 μmol/l)

125 nmol/l

0,312

...

...

...

250 nmol/l

0,625

pUC 18-R (10 μmol/l)

250 nmol/l

0,625

Tm-pUC18 (10 μmol/l)

100 nmol/l

0,25

IAC plasmid pUC19

...

...

...

1

Mẫu thử

2,5

Nước cất vô trùng

Chỉnh đến 25 μl

5,687

^a Roche LC 480 Probes Master là ví dụ về sản phẩm phù hợp có bán sẵn của Roche Diagnostics. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng sản phẩm. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

B.1.4.3  Kiểm chứng PCR

...

...

...

B.1.4.3.1  Kiểm chứng PCR âm tính

Sử dụng nước không có ADN làm kiểm chứng âm.

B.1.4.3.2  Kiểm chứng PCR dương tính

Sử dụng dung dịch có chứa một lượng xác định và/hoặc số lượng bản sao ADN đích làm kiểm chứng dương.

B.1.4.3.3  Kiểm soát khuếch đại

Một ví dụ của IAC được nêu trong Bảng B.4. IAC này được dựa trên ADN E. coli plasmid pUC19 làm phân tử đích. Ngoài ra, có thể sử dụng các công cụ kiểm soát khuếch đại bán sẵn.

CHÚ THÍCH: Các vectơ plasmid pUC18 và pUC19 (số L08752; 2686 Bp) giống hệt nhau ngoại trừ việc chúng có chứa các vị trí đa tách dòng (polycloning site) được sắp xếp theo hướng ngược lại.

B.1.4.4  Chương trình nhiệt độ - thời gian

Chương trình nhiệt độ - thời gian quy định trong Bảng B.6 đã được chứng minh phù hợp.

...

...

...

Hoạt hóa/biến tính ban đầu

95 °C trong 10 min

Biến tính

95 °C trong 10 s

Khuếch đại

60 °C trong 30 s

Số lượng chu trình

45

B.1.4.5  Hạn chế của phép phân tích

...

...

...

B.2  Phát hiện Y. enterocolitica gây bệnh bằng real-time PCR - Phương pháp 2

B.2.1  Yêu cầu chung

Đây là phương pháp phát hiện Yersinia enterocolitica gây bệnh bằng cách khuếch đại một trình tự đặc hiệu đối với đoạn gen ail của Yersinia enterocolitica. Gen này là một phần cơ chế gây bệnh của Yersinia enterocolitica.

Hệ thống phát hiện được xây dựng là real-time PCR lặp lại kết hợp với kiểm soát khuếch đại bên trong khác loại dựa trên plasmid PUC 19.

B.2.2  Đặc tính hiệu năng

B.2.2.1  Yêu cầu chung

Phương pháp đã được công bố này^{[13] [14]} có thể áp dụng để phát hiện các chủng Y. enterocolitica thuộc bioserotyp liên quan đến khả năng gây bệnh ở người.

Phương pháp này

B.2.2.2  Độ chọn lọc

...

...

...

B.2.2.2.1  Phép thử độ chọn lọc mục tiêu

Độ chọn lọc mục tiêu của phép phân tích PCR được thử nghiệm trên 102 chủng, cho kết quả độ chọn lọc mục tiêu là 100 %, xem Bảng B.7.

Các chủng thử nghiệm đã phân lập được từ người (n = 70), động vật (n = 15), thực phẩm (n = 8) và nguồn chưa xác định (n = 9).

Bảng 7 - Phép thử độ chọn lọc mục tiêu sử dụng 102 chủng

Các loài và bio/serotyp
(số lượng chủng)

Số lượng các chủng thu được trong khuếch đại đoạn gen đích

Y. enterocolitica 4/O:3

(81)

81

...

...

...

(3)

3

Y. enterocolitica NT/O:8

(8)

8

Y. enterocolitica NT/O:5,27

(4)

4

Y. enterocolitica 1B/O:18

...

...

...

1

Y. enterocolitica NT/O:20

(2)

2

Y. enterocolitica 1B/O:21

(1)

1

Y. enterocolitica 3/O:1,2,3

(1)

...

...

...

Y. enterocolitica 5/O:2,3

(1)

1

Tổng số

102

102

NT là không phân typ.

B.2.2.2.2  Phép thử độ chọn lọc ngoại trừ

Độ chọn lọc ngoại trừ của phân tích PCR được thử nghiệm trên 71 chủng không phải đích, cho kết quả độ chọn lọc ngoại trừ là 100 % (xem Bảng B.8). Các chủng thử nghiệm đã phân lập được từ người (n = 20), động vật (n = 1), thực phẩm (n = 21) và nguồn chưa xác định (n = 29).

...

...

...

Các loài và bio/serotyp
(Số lượng chủng)

Số lượng các chủng thu được trong khuếch đại đoạn gen đích

Y. enterocolitica 1A

(5)

0

Y. enterocolitica NT

(9)

0

Y. frederiksenii

...

...

...

0

Y. kristensenii

(2)

0

Y. intermedia

(2)

0

Y. pseudotuberculosis

(25)

...

...

...

Các loài khác nhau liên quan đến thực phẩm

(21)

0

Tổng số

(71)

0

NT là không phân typ.

B.2.2.3  Độ nhạy phản ứng

Các giới hạn phát hiện là 15 gen đến 20 gen tương đồng (genome equivalent) (85 fg) cho một phản ứng. Tất cả các phép phân tích được thực hiện với sự có mặt 100 bản sao của kiểm soát khuếch đại bên trong (IAC).

...

...

...

Mức phát hiện LOD₉₅ của phương pháp PCR là 23 cfu/10 g thực phẩm. Giới hạn phát hiện của phương pháp được đánh giá bằng cách đo năm nền mẫu thực phẩm khác nhau, ở đây là sữa, xúc xích hun khói lạnh, cá, cà rốt, thịt xay được cấy ở mức nhiễm 1 cfu đến 55 cfu trong 10 g với sáu lần lặp lại cho mỗi mức nhiễm. Sau 18 h đến 20 h tăng sinh thì giới hạn phát hiện trong sữa là 1 cfu trong 10 g, trong xúc xích hun khói lạnh là 5,5 cfu và trong cà rốt, cá và thịt xay là 55 cfu trong 10 g.

B.2.2.5  Các thông số hiệu năng liên quan đến độ chính xác tương đối, độ nhạy tương đối, độ đặc hiệu tương đối

Độ chính xác tương đối của phương pháp real-time PCR (kết quả đạt được/dự kiến) là 99 %, độ nhạy tương đối là 98 % và độ đặc hiệu tương đối là 100 % trong một nghiên cứu của 90 mẫu thịt giăm bông, cà rốt và xay thịt khi sử dụng các mức từ 10 cfu đến 300 cfu Y. enterocolitica trong 25 g mẫu thực phẩm. Trong phạm vi của nghiên cứu này, ADN tách chiết ra được pha loãng 1/10 trước khi chạy phản ứng. Nghiên cứu này cũng cho thấy độ chính xác tương đối là 60 % đối với phương pháp nuôi cấy trong TCVN 8127:2009 (EN/ISO 10273:2003) và độ nhạy tương đối là 40 % và độ đặc hiệu tương đối là 100 %.

CHÚ THÍCH: Các dữ liệu thu được bằng cách phân tích các mẫu nhiễm nhân tạo. Một so sánh giữa kết quả dự kiến và kết quả thu được đã được tính theo quy trình NMKL n° 20, 2007^[1].

B.2.2.6  Độ chắc chắn

Độ chắc chắn của phương pháp PCR đã được thử nghiệm bằng cách thay đổi nhiệt độ ủ ± 2 °C và nồng độ thuốc thử PCR ± 20 % sử dụng 50 bản sao ADN của Y. enterocolitica (SLV-408) với sự có mặt của 100 bản sao kiểm soát khuếch đại bên trong (IAC). Độ lệch Ct là ± 1 Ct từ các điều kiện của phương pháp đã nêu.

B.2.2.7  Thiết bị

Tiến hành đánh giá các thiết bị ABI 7300, 75003) và real-time PCR BioRad CFX96TM³⁾. Các thiết bị real-time PCR khác nhau cho thấy không ảnh hưởng đáng kể đến hiệu năng của các phương pháp.

B.2.3  Cách tiến hành

...

...

...

Một đoạn ADN đặc hiệu của đoạn gen (ail) xâm lấn gắn với gen liên quan đến độc lực cố định trên nhiễm sắc thể được khuếch đại và được phát hiện bằng real-time PCR^[13]. Hệ thống real-time PCR dựa trên đầu dò thủy phân được dán nhãn 6-carboxyfluorescein (FAM) là phân tử phát huỳnh quang và tại đầu 3' là hợp chất hóa học đặc biệt gọi là chất liên kết (binder) rãnh phụ, MGB (đầu dò ail) hoặc tetrametyl-6-carboxyrhodamin, TAMRA (đầu dò Ye).

B.2.3.2  Thuốc thử

B.2.3.2.1  Yêu cầu chung

Đối với chất lượng của thuốc thử được sử dụng, xem TCVN 11134 (ISO 22174).

B.2.3.2.2  Thuốc thử dùng cho PCR

Xem TCVN 11133 (ISO 22119) và TCVN 7682 (ISO 20838).

B.2.3.2.2.1  Oligonucleotid, Y. enterocolitica gây bệnh

Bảng B.9 - Trình tự oligonucleotid

Mồi và đầu dò

...

...

...

Kích thước sản phẩm PCR

R-real 9A^a

CCCAGTAATCCATAAAGGCTAACATAT

163 bp

F-real 10A^a

ATGATAACTGGGGAGTAATAGGTTCG

Đầu dò Ye^b

FAM-TCTATG G C AGTA ATAAGTTTGGTC ACGGTGATCT-TAMRA

...

...

...

FAM-TGACCAAACTTATTACTGCCATA-MGB ^TMc

^a Ngược; xuôi

^b Đầu dò Ye và đầu dò ail được sử dụng để thay thế.

^c Chất liên kết (binder) rãnh phụ (MGB^TM) là một ví dụ về sản phẩm thích hợp có bán sẵn của Applied Biosystems. Forster City, CA, USA. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương.

B.2.3.2.2.2  Oligonucleotid, kiểm soát khuếch đại bên trong (IAC)

Bảng B.10 - Trình tự các oligonucleotid

Tên

Trình tự DNA của oligonucleotid

...

...

...

IAC-fw

TGTGAAATACCGCACAGATG

119

IAC-re

AGCTGGCGTAATAGCGAAG

Đầu dò-pUC19

Z₁-TAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCC-Z₂.

Z₁ là thuốc nhuộm phát huỳnh quang khác với thuốc nhuộm được sử dụng cho đầu dò phát hiện đích; Z₂ là thuốc nhuộm dập tắt huỳnh quang thích hợp bất kỳ. Ví dụ: thuốc nhuộm màu Cyanua CY5 là phân tử phát huỳnh quang và tại đầu kết thúc 3' là thuốc nhuộm dập tắt huỳnh quang Blackberry, BBQ.

...

...

...

B.2.3.3  Tách chiết ADN

ADN được tách chiết ra khỏi các chất đồng nhất đã tăng sinh, canh thang nuôi cấy hoặc các huyền phù tế bào sử dụng bộ kit thử tế bào và huyết DNeasy hoặc bộ kit thử tinh sạch ADN hoàn chỉnh MasterPure4). Thực hiện quy trình theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Ngoài ra, có thể sử dụng các bộ kit thử tinh sạch khác có bán sẵn.

B.2.3.4  Cài đặt PCR

Tổng thể tích thuốc thử dùng cho mỗi phản ứng PCR là 25 μl. Các thuốc thử được liệt kê trong Bảng B.11. Nồng độ cuối cùng của các thuốc thử nêu trong bảng đã được chứng minh là phù hợp.

Bảng B.11 - Các thuốc thử bổ sung

Thuốc thử (nồng độ gốc)

Nồng độ cuối cùng

Thể tích/phản ứng
(μl)

Dung dịch đệm 10xTaqMan® A^a,b

...

...

...

2,5

MgCl₂ (25 mmol/l)^a

3,5 mmol/l

3,5

dNTP (50 mmol/l) ^a

200 μmol/l

0,1

AmpliTaqGold® (5 U/μl)^a

0,02 U/μl

...

...

...

R-real 9A (10 μmol/l)

300 nmol/l

0,75

F-real 10A (10 μmol/l)

300 nmol/l

0,75

Đầu dò Ye (20 μmol/l)

200 nmol/l

0,25

...

...

...

~100 bản sao (0,3 pg)

1,0

IAC-fw (20 μmol/l)

500 nmol/l

0,625

lAC-re (20 μmol/l)

500 nmol/l

0,625

Đầu dò pUC19 (20 μmol/l)

...

...

...

0,25

Mẫu thử

5,0

Dùng nước cắt vô trùng chỉnh đến 25 μl

^a  Các thành phần này có thể được thay thế bằng các dung dịch đệm tương tự hoặc mastermix có sẵn để dùng ngay từ các nhà cung cấp khác. Các dung dịch đệm này bao gồm tất cả các thuốc thử trong cùng một dung dịch. Các TaqMan® 2x Universal PCR MasterMix có bán sẵn đã được sử dụng trong phép thử hiệu năng.

^b  Dung dịch đệm 10xTaqMan A, AmpliTaqGold® là một ví dụ về sản phẩm thích hợp của Applied Biosystems. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn còn không ấn định phải sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương.

B.2.3.5  Kiểm chứng PCR

...

...

...

B.2.3.6  Kiểm soát khuếch đại

Một ví dụ của IAC được đưa ra trong Bảng B.10. IAC này được dựa trên ADN pUC19 E. coli plasmid làm phân tử đích. Có thể sử dụng các kiểm soát khuếch đại thương mại có sẵn.

B.2.3.7  Chương trình nhiệt độ-thời gian

Chương trình nhiệt độ-thời gian nêu trong Bảng B.12 đã được sử dụng trong nghiên cứu đánh giá.

CHÚ THÍCH: Việc sử dụng máy chu trình nhiệt real-time PCR khác ở trên (B.2.2.7) có thể yêu cầu điều chỉnh thêm. Thời gian kích hoạt/biến tính ban đầu phụ thuộc vào polymerase được sử dụng.

Bảng B.12 - Chương trình nhiệt độ-thời gian

Kích hoạt/biến tính ban đầu

95 °C 10 min

Biến tính

...

...

...

Khuếch đại

60 °C 1 min

Số chu trình

45

B.2.3.8  Hạn chế của phép phân tích real-time PCR

Một mối tương quan cao đã được xác định giữa sự có mặt của gen ail và gen độc lực của vi khuẩn Yersinia spp^[8]. Trong rất ít trường hợp Yersinia enterocolitica biotyp 1A, thường được coi là không gây bệnh, có thể mang một biến thể của gen ail^[6],[11]. Tuy nhiên, có những dấu hiệu cho thấy một tỷ lệ nhỏ các chủng 1A có thể gây bệnh cho người ^[12].

Phụ lục C

(tham khảo)

...

...

...

C.1  Phát hiện Y. pseudotuberculosis bằng real-time PCR

C.1.1  Yêu cầu chung

Phụ lục này mô tả phương pháp real-time PCR đầu dò để phát hiện Y. pseudotuberculosis.

C.1.2  Đặc tính hiệu năng

C.1.2.1  Yêu cầu chung

Phương pháp đã được công bố này^[14] có thể áp dụng để phát hiện các chủng Y. pseudotuberculosis được coi là có khả năng gây bệnh cho người.

C.1.2.2  Độ chọn lọc

Thực hiện phép thử độ chọn lọc bằng cách sử dụng các mồi F-Yps 1 và R-Yps 2, kết hợp với đầu dò MGB™ hoặc đầu dò Tamra-quenched kết hợp với kiểm soát khuếch đại bên trong sử dụng hệ thống mồi-đầu dò IAC-fw, IAC-re và đầu dò PUC 19.

C.1.2.2.1  Phép thử độ chọn lọc mục tiêu

...

...

...

Bảng C.1 - Phép thử độ chọn lọc mục tiêu sử dụng 44 chủng đích

Các loài và bio/serotyp
(số lượng chủng)

Số lượng chủng thu được trong khuếch đại đoạn gen đích

Y. pseudotuberculosis O:1-O:15

(33)

31

Y. pseudotuberculosis NT

(11)

11

...

...

...

(44)

42

NT là không phân typ.

C.1.2.2.2  Phép thử độ chọn lọc ngoại trừ

Độ chọn lọc ngoại trừ của phép phân tích PCR được thử nghiệm trên 23 chủng không phải đích, cho kết quả độ chọn lọc ngoại trừ là 100 %. Các chủng thử nghiệm đã phân lập được từ người (n = 24), động vật (n = 2), thực phẩm (n = 10), môi trường (n = 4) và nguồn chưa xác định (n = 27).

Bảng C.2 - Phép thử độ chọn lọc ngoại trừ sử dụng 23 chủng không phải đích

Các loài và bio/serotyp
(số lượng chủng)

Số lượng chủng thu được trong khuếch đại đoạn gen đích

Y. enterocolitica gây bệnh

...

...

...

0

Y. enterocolitica không gây bệnh

(2)

0

Các loài khác liên quan đến thực phẩm

(12)

0

Tổng số

(23)

...

...

...

NT là không phân typ.

C.1.2.3  Độ nhạy

C.1.2.3.1  Độ nhạy phản ứng

Giới hạn phát hiện LOD₉₅^[17] là 15 gen tương đồng (75 fg) cho một phản ứng.

C.1.2.3.2  Độ nhạy của phương pháp

Mức phát hiện của phương pháp được đánh giá bằng cách đo ba nền mẫu thực phẩm khác nhau được cấy ở hai mức nhiễm (13 cfu và 200 cfu) trong 25 g, ở đây là sữa không tiệt trùng, thịt bò xay nhỏ và salad rau trộn (cà rốt nghiền và xà lách cuộn). Mỗi loại thực phẩm sử dụng 10 mẫu. Sau 24 h tăng sinh, mức phát hiện, LOD₉₅^[17] cho cả ba nền mẫu thực phẩm là 13 cfu trong 25 g. Xem B.1.2 về giới hạn của dữ liệu phát hiện trên nhiều nền mẫu.

C.1.2.4  Các thông số hiệu năng liên quan đến độ chính xác tương đối, độ nhạy tương đối, độ đặc hiệu tương đối

Độ chính xác tương đối, độ nhạy tương đối và độ đặc hiệu tương đối của phương pháp real-time PCR (dự kiến/kết quả đạt được) là 100 % trong một nghiên cứu 90 mẫu thực phẩm (sữa không tiệt trùng, thịt bò xay nhỏ và salad rau trộn) khi có mức nhiễm Y. pseudotuberculosis thấp, tức là 10 cfu đến 200 cfu trong mỗi 25 g mẫu thực phẩm được sử dụng. Trong nghiên cứu này, ADN tách chiết ra được pha loãng 1/10 trước khi chạy phản ứng.

CHÚ THÍCH: Các dữ liệu này thu được bằng cách phân tích các mẫu nhiễm nhân tạo. Sự so sánh giữa các kết quả dự kiến và kết quả thu được đã được tính theo quy trình NMKL n° 20, 2007^[1].

...

...

...

Việc đánh giá đã được thực hiện bằng cách sử dụng thiết bị ABI 7300, 75005) và real-time PCR BioRad CFX96™⁵⁾.

C.1.3  Cách tiến hành

C.1.3.1  Nguyên tắc

Một đoạn ADN đặc hiệu của locus (ail) xâm lấn gắn với gen liên quan đến độc lực cố định trên nhiễm sắc thể được khuếch đại và được phát hiện bằng real-time PCR đầu dò để phát hiện Y. pseudotuberculosis^[14].

C.1.3.2  Thuốc thử

C.1.3.2.1  Yêu cầu chung

Đối với chất lượng của thuốc thử được sử dụng, xem TCVN 11134 (ISO 22174).

C.1.3.2.2  Thuốc thử dùng cho PCR

C.1.3.2.2.1  Yêu cầu chung

...

...

...

C.1.3.2.2.2  Oligonucleotid, Y. pseudotuberculosis

Bảng C.3 - Trình tự các oligonucleotid

Mồi và đầu dò

Trình tự DNA của các oligonucleotid (5' - 3')

Kích thước của sản phẩm PCR

F-Yps 1^a

CGTCTGTTAATGTGTATGCCGAAG

157 bp

R-Yps 2^a

...

...

...

Đầu dò Yps^b,c

VIC-CGTGTCAAGGACGATGGGTACAAGTTGG-TAMRA

Đầu dò Yps_2^b,c

NED-ATGCTCAAAGTCGTGTCAA-MGB™^d

^a  Xuôi; ngược.

^b  TAMRA™; VIC® MGB™, chất liên kết rãnh phụ; NED™.

^c  Đầu dò Yps và đầu dò Yps_2 được dùng thay thế.

...

...

...

C.1.3.3  Tách chiết ADN

Xem B.2.3.3.

C.1.3.4  Cài đặt PCR

Tổng thể tích thuốc thử dùng cho mỗi phản ứng PCR là 25 μl. Các thuốc thử được nêu trong Bảng C.4. Nồng độ cuối cùng của các thuốc thử nêu trong bảng này đã được chứng minh là phù hợp.

Bảng C.4 - Thuốc thử dùng cho phản ứng PCR

Thuốc thử (nồng độ gốc)

Nồng độ cuối cùng

Thể tích/mẫu (μl)

TaqMan®2x Universal PCR^a

...

...

...

12,5

F-Yps 1 (10 μmol/l)

300 nmol/l

0,75

R-Yps 2 (10 μmol/l)

300 nmol/l

0,75

Đầu dò Yps (20 μmol/l]

200 nmol/l

...

...

...

IAC PUC19 DNA

xấp xỉ 100 bản sao (0,3 pg)

1,0

IAC-fw (20 μmol/l)

500 nmol/l

0,625

lAC-re (20 μmol/l)

500 nmol/l

0,625

...

...

...

200 nmol/l

0,25

Mẫu thử

5,0

Dùng nước cất vô trùng chỉnh đến 25 μl

^a  TaqMan®2x Universal PCR là ví dụ về các sản phẩm thích hợp có bán sẵn của Applied Biosystems. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương.

C.1.3.5  Kiểm chứng PCR

...

...

...

C.1.3.6  Kiểm soát khuếch đại

Một ví dụ của IAC được đưa ra trong Bảng B.10. IAC này dựa trên ADN pUC19 plasmid E. coli làm phân tử đích. Ngoài ra, có thể sử dụng các kiểm soát khuếch đại thương mại sẵn có.

C.1.3.7  Chương trình nhiệt độ-thời gian

Xem B.2.3.7.

C.1.4  Hạn chế của phép phân tích real-time PCR

Tất cả các chủng Y. pseudotuberculosis được coi là có khả năng gây bệnh cho người^[9]. Phép thử real- time PCR nêu trong tiêu chuẩn này không làm khuếch đại các gen đích của các serotyp O:11 và O:12, chưa rõ khả năng gây bệnh. Bộ mồi/đầu dò này sẽ phát hiện được Y. pestis, nhưng thường không liên quan đến thực phẩm.

C.2  Phân lập Y. pseudotuberculosis

C.2.1  Sơ đồ phân lập (và phát hiện bằng PCR) Y. pseudotuberculosis

...

...

...

C.2.2  Đặc tính hiệu năng của việc phân lập các khuẩn lạc Y. pseudotuberculosis bằng canh thang PMB

Độ chính xác tương đối, độ nhạy tương đối và độ đặc hiệu tương đối của phương pháp nuôi cấy này (kết quả dự kiến/kết quả đạt được) là 100 % trong một nghiên cứu 42 nền mẫu thực phẩm (sữa không tiệt trùng, thịt đã nấu chín và salad) ở ba mức nhiễm (30 cfu/25 g, 170 cfu/25 g và 850 cfu/25 g) Y. pseudotuberculosis và mỗi loại thực phẩm nghiên cứu 4 mẫu.

Mức độ phát hiện (LOD₅₀)^[17] chung đối với các nền mẫu này là 7 cfu/25 g mẫu. Trong một nghiên cứu riêng 30 mẫu cả rốt nghiền, LOD₉₅^[17] là 53 cfu/25 g mẫu.

CHÚ THÍCH: Các dữ liệu thu được khi phân tích các mẫu gây nhiễm nhân tạo. Việc so sánh giữa kết quả dự kiến và kết quả thu được tính theo quy trình của Ủy ban Bắc Âu về phân tích thực phẩm [Nordic Committee on food Analysis (NMKL)] n° 20, 2007.^[1]

Phụ lục D

(tham khảo)

Phát hiện đồng thời Y. enterocolitica gây bệnh và Y. pseudotuberculosis bằng multiplex real-time PCR

D.1  Yêu cầu chung

...

...

...

D.2  Đặc tính hiệu năng

D.2.1  Yêu cầu chung

Xem B.2.2.1 và C.1.2.1.

Phương pháp này đã được công bố^[14].

D.2.2  Độ chọn lọc

D.2.2.1  Yêu cầu chung

Xem B.2.2.2 và C.1.2.2

D.2.2.2  Phép thử độ chọn lọc mục tiêu và độ chọn lọc ngoại trừ

Xem B.2.2.2.1 đến B.2.2.2.2 và C.1.2.2.1 đến C.1.2.2.1.2.

...

...

...

D.2.3.1  Độ nhạy phản ứng

Chưa được đánh giá.

D.2.3.2  Độ nhạy của phương pháp

Mức phát hiện, LOD₉₅^[17] đối với Y. pseudotuberculosis sau khi nuôi cấy kết hợp với Y. enterocolitica đã tính được là 525 cfu/10 g. Mức phát hiện được tính sau khi tăng sinh đồng thời hai loại vi khuẩn trong 24 h, mỗi loại với 2,8 cfu, 28 cfu và 2,8 x 10² cfu trong 10 g của hai nền mẫu thực phẩm khác nhau, đó là cà rốt và thịt bò xay nhỏ.

D.2.4  Thiết bị

Việc đánh giá đã được thực hiện bằng cách sử dụng thiết bị ABI 75006) và real-time PCR BioRad CFX96™⁶⁾.

D.3  Cách tiến hành

D.3.1  Nguyên tắc

Các đoạn ADN khác nhau của đoạn gen (ail) xâm lấn gắn với gen liên quan đến độc lực cố định trên nhiễm sắc thể có trong các chủng Y. enterocolitica gây bệnh và Y. pseudotuberculosis được khuếch đại và được phát hiện bằng real-time PCR đầu dò multiplex.

...

...

...

D.3.2.1  Yêu cầu chung

Đối với chất lượng của thuốc thử được sử dụng, xem TCVN 11134 (ISO 22174).

D.3.2.2  Thuốc thử dùng cho PCR

Xem TCVN 11133 (ISO 22119) và TCVN 7682 (ISO 20838).

D.3.2.3  Oligonucleotid

Trình tự của các oligonucleotid để phát hiện Y. enterocolitica và Y. pseudotuberculosis gây bệnh được liệt kê trong Bảng B.9 và Bảng C.3 tương ứng.

D.3.3  Tách chiết ADN

ADN được tách chiết ra khỏi các các chất đồng nhất đã tăng sinh, canh thang nuôi cấy hoặc các huyền phù tế bào sử dụng bộ kit thử tế bào và huyết Dneasy (Qiagen Gmbh, Hilden, Đức). Thực hiện quy trình theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Ngoài ra, có thể sử dụng các bộ kit thử tinh sạch khác có bán sẵn.

D.3.4  Cài đặt PCR

...

...

...

Bảng D.1 - Thuốc thử, nồng độ cuối cùng và thể tích mẫu

Thuốc thử (nồng độ gốc)

Nồng độ cuối cùng

Thể tích/mẫu (μl)

TaqMan®2x Universal PCR^a

1x

12,5

R-real 9A (10 μmol/l)

300 nmol/l

...

...

...

F-real 10A(10 μmol/l)

300 nmol/l

0,75

Mồi Ye (20 μmol/l)

200 nmol/l

0,25

F-Yps 1 (10 μmol/l)

300 nmol/l

0,75

...

...

...

300 nmol/l

0,75

Mồi Yps (20 μmol/l)

200 nmol/l

0,25

ADN IAC pUC19

Khoảng 100 bản sao (0,3 pg)

1,0

IAC-fw (20 μmol/l)

...

...

...

0,625

lAC-re (20 μmol/l)

500 nmol/l

0,625

Mồi pUC19 (20 μmol/l)

200 nmol/l

0,25

Mẫu thử

...

...

...

Dùng nước cất vô trùng chỉnh đến 25 μl

^a  TaqMan®2x Universal PCR là ví dụ về sản phẩm thích hợp có bán sẵn của Applied Biosystems. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

D.3.5  Kiểm chứng PCR

Thực hiện kiểm chứng PCR phù hợp với TCVN 11134 (ISO 22174).

D.3.6  Kiểm soát khuếch đại

Một ví dụ của IAC được nêu trong Bảng B.10. IAC này dựa trên ADN pUC19 plasmid E. coli làm phân tử đích. Ngoài ra, có thể sử dụng kiểm soát khuếch đại thương mại có sẵn.

D.3.7  Chương trình nhiệt độ-thời gian

Xem B.2.3.7.

...

...

...

Xem B.2.4 và C.1.4 tương ứng.

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] NMKL procedure N° 20, 2007. Evaluation of results from qualitative methods (www.nmkl.org)

[2] AUSUBEL F.M., BRENT R., KINGSTON R.E., MOORE D.D., SEIDMAN J.G., SMITH J.A. Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, New York, 1987

[3] BOTTONE E.J. Yersinia enterocolitica: overview and epidemiologic correlates. Microbes Infect. 1999, 1 pp. 323-333

[4] FUKUSHIMA H., MATSUDA Y., SEKI R., TSUBOKURA M., TAKEDA N., SHUBIN F.N. Geographical heterogeneity between Far Eastern and Western countries in prevalence of the virulence plasmid, the superantigen Y. pseudotubercuhsis-derived mitogen, and the high-pathogenicity island among Y. pseudotuberculosis strains. J. Clin. Microbiol. 2001, 39 pp. 3541-3547

[5] FUKUSHIMA H., SAITO K,, TSUBOKURA M., OTSUKI K. YERSINIA SPP. IN SURFACE WATER IN MATSUE, JAPAN. ZENTRALBI. BAKTERIOL. ABT 1 ORIG. B. HYG. KRANHENHAUSHYG. BETREIBSHYG. PRAEV. MED. 1984, 179 PP. 235-247

[6] KRAUSHAAR B., DIECKMANN R., WITTWER M., KNABNER D., KONIETZNY A., MADE D. CHARACTERIZATION OF A YERSINIA ENTEROCOLITICA BIOTYPE 1A STRAIN HARBORING AN AIL GENE. J. APPL. MICROBIOL. 2011, 111 pp. 997-1005

...

...

...

[8] MILLER V.L., FARMER J.J., HILL W.E., FALKOW S. THE AIL LOCUS IS FOUND UNIQUELY IN YERSINIA ENTEROCOLITICA SEROTYPES COMMONLY ASSOCIATED WITH DISEASE. INFECT, IMMUN. 1989, 57 PP. 121-131

[9] NAGANO T., KIYOHARA T., SUZUKI K., TSUBOKURA M., OTSUKI K. IDENTIFICATION OF PATHOGENIC STRAINS WITHIN SEROGROUPS OF YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS AND THE PRESENCE OF NON- PATHOGENIC STRAINS ISOLATED FROM ANIMALS AND THE ENVIRONMENT. J. VET. MED. SCI. 1997, 59 PP. 153-158

[10] SCHIEMANN D.A. Yersinia enterocolitica: Observations on some growth characteristics and response to selective agents. Can. J. Microbiol. 1980, 26 pp. 1232-1240

 [11] SIHVONEN L.M., HALLANVUO S.,HAUKKA K., SKURNIK M., SIITONEN A. The ail gene is present in some YERSINIA enterocolitica Biotype 1A strains. Foodborne Pathog. Dis. 2011, 8 [3] pp. 455-457

[12] TENNANT S.H., GRANT T.H., ROBINS-BROWNE R.M. PATHOGENICITY OF YERSINIA ENTEROCOLITICA BIOTYPE 1A. FEMS IMMUNOL. MED. MICROBIOL. 2003, 38 PP. 127-137

[13] THISTED LAMBERTZ S., NILSSON C, HALLANVUO S., LINDBLAD M. REAL-TIME PCR METHOD FOR DETECTION OF PATHOGENIC YERSINIA ENTEROCOLTICA IN FOOD. APPL. ENVIRON. MICROBIOL. 2008, 74 PP. 6060-6067

[14] THISTED LAMBERTZ S., NILSSON C, HALLANVUO S. A TAQMAN-BASED REAL-TIME PCR METHOD FOR DETECTION OF YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS IN FOOD. APPL. ENVIRON. MICROBIOL. 2008, 74 PP. 6465-6469

[15] WEAGANT S.D. Medium for the presumptive identification of Yersinia enterocolitica. FDA Laboratory. Appl Environ Microbiol. 1983 45 (2) pp:472-473

[16] US FOOD AND DRUG ADMINISTRATION EBAM, CHAPTER 8. HTTP://WWW.FDA.GOV/FNNH/ FQ0DSCIENCERESEARCH/LABORATORYMETHODS/NRM072633.HTM

...

...

...

[18] TCVN 8128 (ISO 11133), Vi sinh vật trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và nước - Chuẩn bị, sản xuất, bảo quản và thử hiệu năng môi trường nuôi cấy

[19] TCVN 6404 (ISO 7218), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Yêu cầu chung và hướng dẫn kiểm tra vi sinh vật.

1) Thiết bị Roche LightCycler® 480 và real-time PCR ABI 7900HT là các ví dụ về sản phẩm phù hợp có bán sẵn tương ứng của Roche Diagnostics và Lite Technologies. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng các sản phẩm này. Các sản phẩm tương tự có thể được sử dụng nếu cho các kết quả tương đương.

2) Minor groove binder (MGB^TM) là ví dụ về sản phẩm phù hợp có bán sẵn của Applied Biosystems. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

3) Các thiết bị ABI 7300, 7500 và real-time PCR BioRad CFX96TM ví dụ về các sản phẩm phù hợp có bán sẵn tương ứng của Applied Biosystems và BioRad. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng các sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

4) Bộ kit thử tế bào và huyết DNeasy hoặc bộ kit thử tinh sạch AND hoàn chỉnh MasterPure là ví dụ về các sản phẩm phù hợp có bán sẵn tương ứng của Qiagen (Gmbh), (Hilden, Đức) và Trung tâm Công nghệ sinh học (Madision, Wl, Mỹ). Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng các sản phẩm này. Có thể sử dụng sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương.

5) ABI 7300, 7500 và real-time PCR BioRad CFX96™ là ví dụ về các sản phẩm phù hợp có bán sẵn tương ứng của Life Technologies và Bio-Rad. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

6) ABI 7500 và real-time PCR BioRad CFX96™ là ví dụ về các sản phẩm phù hợp có bán sẵn tương ứng của Applied Biosystems và Bio-Rad. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng các sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11924:2017 (ISO/TS 18867:2015) về Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm - Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để phát hiện vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm - Phát hiện Yersinia enterocolitica gây bệnh và Yersinia pseudotuberculosis