6.4.1  Tính hệ số tín hiệu

Tính cho chất cần phân tích theo công thức:

Trong đó:

RF: hệ số tín hiệu;

Sp: tổng diện tích pic của các ion thứ cấp của chất cần phân tích;

Sp_IS: diện tích pic của ion thứ cấp của nội chuẩn.

6.4.2  Xây dựng đường chuẩn

...

...

...

RF

là hệ số tín hiệu, tính theo điều 6.4.1;

X

là nồng độ chất chuẩn, tính theo đơn vị μg/I;

b

là điểm cắt của đường chuẩn với trục tung;

a

là hệ số góc của đường chuẩn.

7  Cách tiến hành

...

...

...

Thêm vào mẫu thử (6.1) 15 ml axetonitril (3.6), 10 ml n-hexan bão hòa axetonitril (3.10), 5 g Na₂SO₄(3.1).

Đồng hóa mẫu ở tốc độ chậm bằng máy đồng nhất mẫu (4.7);

Ly tâm mẫu ở 4000 r/min trong 5 min (4.3);

Hút hết lớp dưới vào bình quả lê (4.15);

Thêm vào mẫu 10 ml axetonitril (3.6) tiếp tục chiết lần 2;

Cho vào bể chiết siêu âm (4.8) trong 5 min;

Ly tâm mẫu ở 4000 r/min trong 5 min (4.3);

Hút dung dịch lớp dưới vào bình quả lê (4.15) đã hút lần 1;

Cho vào dịch chiết thu được 5 ml n-propanol (3.2);

...

...

...

Hòa tan cặn bằng 2 ml dung dịch axetonitril: nước tỷ lệ 3:7 ( 3.11);

Lọc bằng màng lọc nylon (4.19), đưa dịch chiết vào lọ đựng mẫu 1,5 ml (4.16);

Tiến hành phân tích trên hệ thống LC-MS/MS (4.1).

7.2  Tiến hành thử nghiệm trên LC-MS/MS

7.2.1  Yêu cầu chung

Chuẩn hóa các điều kiện của sắc ký lỏng như tốc độ dòng, thành phần pha động, nhiệt độ cột và các điều kiện của đầu dò MS/MS như điện thế mao quản, điện thế đầu cone, năng lượng va chạm, tốc độ khí va chạm...để mỗi chất phân tích thu được tỉ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N) lớn hơn 3 cho các phân mảnh ion và luôn tồn tại 4 điểm nhận dạng (IP) bao gồm 1 ion mẹ, 2 ion con; không có píc nhiễu tại vị trí của píc phân tích.

7.2.2  Điều kiện trên LC

Nhiệt độ cột:

(40 ± 5) °C

...

...

...

0,2 ml/min

Thể tích bơm mẫu:

5 μl

Thời gian phân tích:

25 min

Pha động:

Chạy theo chương trình gradient thể hiện theo Bảng 2

Bảng 2 - Điều kiện gradient cho hệ thống LC

Thời gian (min)

...

...

...

Nước + 0,01 % axít formic

Kênh A

Axetonitril + 0,01 % axít formic

0.0

97

3

1

97

3

...

...

...

3

97

21

3

97

22

97

3

25

...

...

...

3

7.2.3  Điều kiện trên MS:

Kiểu ion hóa:

ESI (+)

Nhiệt độ nguồn ion hóa:

150 °C

Nhiệt độ hóa hơi dung môi:

400 °C

Tốc độ dòng khí làm bay hơi dung môi:

...

...

...

Tốc độ dòng khí qua khối nón:

20 l/h

Áp suất khí va chạm:

Argon, p = 2,93x10^-3 mbar

Điện thế mao quản:

2,0 kV

Bảng 3 - Điều kiện phân mảnh MS/MS

STT

Kháng sinh

...

...

...

lon mẹ (m/z)

lon con (m/z)

Năng lượng va chạm CE (eV)

Năng lượng (Sample Cone) (V)

1

Sulfadiazine

6,8

250,9

91,9

...

...

...

22

155,9*

18

2

Sulfamethazine

8,2

278,8

91,8*

30

...

...

...

155,8

20

3

Sulfaquinoxaline

10,8

300,8

91,8

32

28

...

...

...

16

4

Sulfamerazine

7,6

264,8

91,8

24

26

155,8*

...

...

...

5

Sulfadimethoxine

10,9

310,8

91,8

30

30

155,8*

20

...

...

...

Sulfachloropyridazine

9,4

284,7

155,8*

16

22

91,8

28

7

...

...

...

10,8

276,8

155,8*

14

18

91,8

28

8

Sulfatroxazole

...

...

...

267,8

155,8*

16

24

91,9

28

9

Sulfamethoxazole

9,9

...

...

...

155,8*

16

22

91,9

30

10

Sulfamonomethoxine

8,3

280,8

...

...

...

18

26

91,8

26

11

Sulfathiazole

7,1

255,8

155,8*

...

...

...

22

91,8

26

12

Sulfapyridine

7,3

249,8

155,8*

16

...

...

...

91,8

28

13

Sulfadoxine

10,5

310,7

155,8*

18

30

...

...

...

28

14

Sulfadiazine d₄

6,8

254,8

159,8

14

26

15

...

...

...

8,1

282,9

185,9

18

30

Ghi chú: ion ký hiệu ( * ) dùng để định lượng.

7.3  Trình tự bơm mẫu

- Bơm dung môi kiểm tra máy: axetonitril (3.5);

- Bơm các dung dịch lập đường chuẩn;

...

...

...

- Bơm mẫu kiểm soát;

- Bơm mẫu thử;

8  Tính toán và biểu thị kết quả

8.1  Tính kết quả

Dư lượng chất phân tích trong mẫu thử được tính theo phương pháp đường chuẩn. Hàm lượng chất phân tích trong mẫu được tính theo công thức sau:

Trong đó:

C   là hàm lượng chất phân tích có trong mẫu, tính bằng microgam trên kilogam (μg/kg);

C_x là nồng độ chất phân tích được suy ra từ đường chuẩn, tính bằng microgam trên lit (μg/l);

...

...

...

F  là hệ số pha loãng mẫu khi đo (nếu không pha loãng, F = 1);

m  là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam (g).

8.2  Biểu thị kết quả

Kết quả được biểu thị bằng đơn vị μg/kg (ppb) đến hai số sau dấu phẩy.

9  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

- Thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử;

- Phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu có;

- Phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

...

...

...

- Kết quả thử nghiệm thu được.

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] Qui trình nội bộ VS1/QT/153/TD “Thịt - Xác định dư lượng Sulfonamid bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ”

[2] KCC/MT/138 (6) “ General Study Method for Veterinary Drugs I - 1 (Livestock and Fishery Products).

[3] Optimized extraction and clean up protocols for LC-MS/MS Multi-residue determination of veterinary drugs in edible muscle tissues - Hãng waters.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11838:2017 về Thịt - Phương pháp xác định dư lượng sulfonamid bằng sắc ký lỏng khối phổ hai lần