3.6  Nguồn nitơ, độ tinh khiết ≥ 99,7 % để làm bay hơi chất chiết dung môi.

4  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và cụ thể như sau:

4.1  Cột, ví dụ: Waters HSST1), kích thước 2,1 mm x 150 mm, cỡ hạt 1,7 μm hoặc tương đương.

4.2  Máy sắc ký lỏng, ví dụ: Waters Acquity UPLC Binary Solvent Manager¹⁾, có thể hoạt động được ở 130 421 kPa (15 000 psi).

4.3  Detector, ví dụ: Waters Quattro Premier XE/Xevo¹⁾, quang phổ khối mạch bốn cực hoặc tương đương.

4.4  Bộ bơm mẫu.

4.5  Bộ sinh khí nitơ.

4.6  Hệ thống phân tích dữ liệu.

...

...

...

4.8  Máy ly tâm.

4.9  Nồi cách thủy, có thể duy trì nhiệt độ 75°C ± 2°C.

4.10  Máy trộn Vortex.

4.11  Bộ bay bơi.

4.12  Cân, có thể đọc chính xác đến 0,001 g.

4.13  Bộ lọc xyranh, bằng PTFE, cỡ lỗ 0,45 μm.

4.14  Pipet, có thể phân phối các thể tích 100 μl, 250 μl và 1 000 μl, có thể điều chỉnh được lượng cần phân phối.

4.15  Đầu tip pipet.

4.16  Bình định mức, dung tích 50 ml, 100 ml, 200 ml, 500 ml và 1 ℓ.

...

...

...

5  Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này.

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

6  Cách tiến hành

6.1  Chuẩn bị mẫu thử

Cân chính xác lượng mẫu yêu cầu cho vào ống ly tâm 50 ml (4.7) (xem Bảng 2)

Bảng 2 - Khối lượng mẫu gần đúng

Loại mẫu

Khối lượng g

...

...

...

12

Sản phẩm dạng đặc^a

6

Sản phẩm dạng bột^b

12

^a Mẫu dạng bột được hoàn nguyên bằng cách cân 25 g mẫu cho vào 200 g nước phòng thử nghiệm và trộn kỹ để tạo hỗn hợp đồng nhất trước khi lấy mẫu để phân tích.

^b Sản phẩm dạng đặc được pha loãng với nước theo tỷ lệ 1:1 sau đó cân và cho vào ống mẫu.

Thêm 75 μl dung dịch nội chuẩn được ghi nhãn đồng vị ổn định (SIIS) (3.5.4) và trộn trong máy trộn Vortex (4.10) trong 10 s.

6.2  Xà phòng hóa

...

...

...

Thêm 4 ml ± 0,3 ml dung dịch kali hydroxit 45 % (3.2) và trộn ngay trong máy trộn tối thiểu 20 s để trộn kỹ hỗn hợp.

Đặt ống (4.7) trong nồi cách thủy (4.9) đã gia nhiệt trước ở nhiệt độ 75°C ± 2°C trong ít nhất 30 min, cứ 10 min đến 20 min lại trộn 5 s.

Sau 30 min, lấy ống ra khỏi nồi cách thủy và đặt ngay vào bề nước đá ít nhất 30 min để đưa nhanh về nhiệt độ phòng.

6.3  Chiết lỏng-lỏng

Cho 5 ml ± 0,3 ml axetonitril (3.1.3) vào mỗi ống, đậy nắp và trộn ở tốc độ vừa phải ít nhất 5 s.

Thêm 22 ml ± 1 ml dung môi chiết dietyl ete-pentan (3.3.3) và lắc ngang 20 lần. Đảo chiều ống mỗi lần lắc.

Ly tâm trong máy ly tâm (4.8) ở tốc độ vừa phải (khoảng 300 g trong 1,5 min) để hỗn hợp tách lớp hoàn toàn.

Gạn lớp dietyl ete-pentan trong và chuyển lớp trên cùng vào ống ly tâm hình côn 50 ml (4.7), để lại vài mililit hỗn hợp dietyl ete-pentan.

Cho bay hơi đến khô lớp dietyl ete-pentan trong nồi cách thủy (4.9) ở nhiệt độ 40°C ± 4°C, thổi dòng khí nitơ từ bộ sinh khí nitơ (4.5) lên phía trên mẫu.

...

...

...

Hoàn nguyên ngay bằng 1,9 ml metanol (3.1.5) và trộn trong 10 s hoặc cho đến khi chất rắn hòa tan.

Thêm 100 μl nước và trộn trên máy trộn Vortex (4.10) thêm 5 s.

Lọc mẫu đã hoàn nguyên vào lọ lấy mẫu tự động của máy HPLC, sử dụng bộ lọc xyranh PTFE (4.13). Bơm hỗn hợp lên hệ thống sắc ký đã cân bằng.

6.4  Các điều kiện vận hành thiết bị

Các điều kiện vận hành thiết bị dưới đây được coi là thích hợp.

6.4.1  Các điều kiện sắc ký

Xem Bảng 3 về các điều kiện sắc ký của máy Waters Acquity UPLC (4.2).

Bảng 3 - Các điều kiện sắc ký của máy Waters Acquity UPLC

Thông số thiết bị

...

...

...

Pha động A

Dung dịch amoni format 2 mM trong nước (3.3.1)

Pha động B

Dung dịch amoni format 2 mM trong metanol (3.3.2)

Tốc độ dòng

500 μl/min

Tốc độ dòng trong MS

500 μl/min

Cột

...

...

...

Nhiệt độ cột

60°C

Thể tích buồng bơm mẫu

20μl

Loại bơm

Đầy vòng bơm

Giới hạn không khí của mẫu côn

Tự động

Giới hạn không khí của mẫu cuối cùng

...

...

...

Nhiệt độ của mẫu

Môi trường

Thông số rửa bộ bơm mẫu:

Dung môi rửa yếu

Nước

Thể tích rửa yếu

1000 μl

Dung môi rửa mạnh

...

...

...

Thể tích rửa mạnh

600 μl

Chương trình gradient

Thời gian, min

Chi tiết gradient

% A

% B

Đường chuẩn

...

...

...

10

90

1

3,0

10

90

6

6,0

0

...

...

...

7

8,0

0

100

6

8,5

10

90

6

...

...

...

10

90

6

6.4.2  Điều kiện của máy đo phổ khối lượng

Xem Bảng 4 và Bảng 5 về các điều kiện vận hành của máy Waters Quattro Premier XE/Xevo (4.3).

Bảng 4 - Các điều kiện vận hành của máy Waters Quattro Premier XE/Xevo

Thông số thiết bị

Cài đặt

Kiểu ion hóa

...

...

...

Điện hóa

5,0 μA

Điện thế côn

20

Nhiệt độ nguồn

130°C

Nhiệt độ khử solvat hóa

500°C

Dòng khí khử solvat hóa

...

...

...

Dòng khí côn

50 l/h

Áp suất cột của máy phân tích

~ 2,0 e^-5

Áp suất cột xung đột

~ 2,0 e^-3

Nguồn khối lượng thấp 1

10,0

Nguồn khối lượng thấp 2

...

...

...

Năng lượng ion 1

0,5

Nối mạng đầu vào

- 5

Năng lượng va chạm

15

Nối mạng đầu ra

1

Nguồn khối lượng cao 1

...

...

...

Nguồn khối lượng cao 2

10

Năng lượng ion 2

1,0

Hệ số nhân

710

Bảng 5 - Các thông số phân tích khối lượng của máy Waters Quattro Premier XE/Xevo

Chất phân tích

Thời gian lưu điển hình, min

...

...

...

lon tạo thành

Thời gian trễ, s

Điện thế côn

Năng lượng va chạm

Vitamin D₃

5,3

385,5

259,2

0,080

...

...

...

15

²H₃-vitamin D₃

5,3

388,5

259,2

0,080

20

15

Vitamin D₂

...

...

...

397,5

69,1

0,080

20

15

²H₃-vitamin D₂

5,1

400,5

69,1

...

...

...

20

15

6.5  Phân tích UPLC

Sau khi đánh giá, xác nhận sự cân bằng của hệ thống UPLC, bơm dung dịch chuẩn làm việc (WS1 đến WS5) (xem 3.3.5) sau đó bơm thuốc thử trắng, mẫu kiểm soát và dịch chiết mẫu (6.3).

Bơm dung dịch chuẩn làm việc định kỳ 5 h sau khi phân tích dịch chiết mẫu (ví dụ: 25 mẫu có chu trình thời gian phân tích là 12 min), bơm sau khi phân tích dịch chiết mẫu cuối cùng.

CHÚ THÍCH   Đường chuẩn phải có hệ số tương quan r² > 0,990. Các phần dư của đường chuẩn phải nhỏ hơn 15 % đối với WS1 và nhỏ hơn 10 % đối với WS2 đến WS5.

7  Tính và biểu thị kết quả

7.1  Tính nồng độ của dung dịch chuẩn làm việc

Tính nồng độ vitamin D, X₀, trong dung dịch chuẩn làm việc (3.5.5), biểu thị bằng miligam trên mililit (mg/ml) theo Công thức (1):

...

...

...

Trong đó:

V₀ là thể tích dung dịch chuẩn gốc vitamin D sử dụng để chuẩn bị dung dịch chuẩn trung gian hỗn hợp vitamin D₂/D₃ (ISTD) (3.5.3), tính bằng mililit (ml) (Ở đây V₀ = 0,560 ml);

V₁ là dung tích bình định mức, tính bằng mililit (ml) (Ở đây V₁ = 500 ml);

V₂ là dung tích bình định mức, tính bằng mililit (ml) (Ở đây V₂ = 50 ml);

V₃ là thể tích cuối cùng của dung dịch chuẩn làm việc được chuẩn bị (V₃ = 2 ml);

W là khối lượng vitamin D đã dùng để tạo dung dịch chuẩn gốc, tính bằng miligam (mg);

V_ISTD là thể tích dung dịch chuẩn trung gian hỗn hợp vitamin D₂/D₃ (ISTD) (3.5.3) đã dùng (xem Bảng 1), tính bằng mililit (ml).

1 000 là các hệ số chuyển đổi miligam sang microgam hoặc microgam sang nanogam.

7.2  Tính đường chuẩn và lượng vitamin D trong mẫu thử

...

...

...

Tính sự hồi quy bằng cách dựng tỷ lệ đáp ứng chiều cao pic đối với từng dung dịch chuẩn làm việc so với nồng độ vitamin D.

Tỷ lệ đáp ứng được xác định là tỷ lệ chiều cao pic vitamin D chia cho chiều cao pic vitamin D đã trideuteri hóa.

7.3  Tính hàm lượng vitamin D trong mẫu thử

Tính hàm lượng vitamin D, X, trong mẫu thử, biểu thị bằng microgam trên kilogam (μg/kg), theo Công thức 2:

                 (2)

Trong đó:

C là nồng độ vitamin D xác định được từ đường chuẩn, tính bằng nanogam trên mililit (ng/ml);

V là thể tích của metanol đã dùng để hoàn nguyên dịch chiết, tính bằng mililit (ml);

S là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam (g).

...

...

...

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm các thông tin sau:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được xem là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm;

e) kết quả thử thu được.

1) Waters HSST, Waters Acquity UPLC Binary Solvent Manager và Waters Quattro Premier XE/Xevo là ví dụ về các sản phẩm thích hợp có bán sẵn. Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng các sản phẩm này. Các sản phẩm tương tự có thể được sử dụng nếu cho các kết quả tương đương.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11671:2016 về Thức ăn công thức dành cho trẻ sơ sinh và sản phẩm dinh dưỡng dành cho người lớn - Xác định vitamin D2 và vitamin D3 - Phương pháp sắc ký lỏng - Phổ khối lượng hai lần (LC-MS/MS)