4.6  Pha động, đẳng dòng, tốc độ dòng 0,8 ml/min.

4.6.1  Đối với dẫn xuất sau cột aflatoxin có cuvet PHRED hoặc dụng cụ UVE, sử dụng hỗn hợp metanol-axetonitril-nước (25:17:60, phần thể tích).

4.6.2  Đối với dẫn xuất sau cột aflatoxin có cuvet Kobra, sử dụng 1 lít hỗn hợp metanol-axetonitril- nước (25:17:60, phần thể tích), 350 µl dung dịch axit nitric 4 M (nồng độ của axit nitric đặc là 15,9 M) và 120 mg kali bromua, trộn kỹ.

4.7  Natri clorua.

4.8  Dung môi muối đệm phosphat (PBS)

5  Thiết bị, dụng cụ

CẢNH BÁO - Tráng tất cả các dụng cụ thủy tinh bằng dung dịch tẩy trắng đã pha loãng trước khi rửa.

Sử dụng các thiết bị và dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và các thiết bị, dụng cụ sau

5.1  Máy lắc, có khả năng lắc 400 r/min1).

...

...

...

5.3  Máy ly tâm2).

5.4  Giấy lọc, gấp nếp, hạng 597 ½, 185 mm hoặc loại tương đương.

5.5  Giấy lọc sợi bông thủy tinh, Whatman 934-AH, GF/B tròn, 90 mm hoặc loại tương đương.

5.6  Cột ái lực miễn nhiễm (IAC)3), cột IAC chứa kháng thể đơn dòng phản ứng chéo với AFB₁, AFB₂, AFG₁, và AFG₂. Cột phải có khả năng liên kết tối thiểu không nhỏ hơn 100 ng aflatoxin tổng số và có độ thu hồi không nhỏ hơn 80 % đối với AFB₁, AFB₂, AFG₁, và AFG₂, khi một dung dịch chuẩn trong 10 ml hỗn hợp metanol và dung môi PBS (4.8) (tỷ lệ 10:90, phần thể tích) thì có chứa 5 ng aflatoxin riêng rẽ.

Cột có hạn sử dụng 18 tháng khi được bảo quản ở 4 °C hoặc 12 tháng khi được bảo quản ở nhiệt độ phòng.

5.7  Cột phân phối, ví dụ: cột VICAM G1104; bơm tĩnh 12-vị trí, hoặc loại tương đương.

5.8  Hệ thống sắc ký lỏng, có điều kiện vận hành như sau:

- tốc độ dòng: 0,8 ml/min;

- detector: cài đặt ở bước sóng kích thích là 362 nm và bước sóng phát xạ là 440 nm;

...

...

...

5.9  Hệ thống dẫn xuất sau cột đối với aflatoxin

5.9.1  Thiết bị tạo dẫn xuất sau cột, dẫn xuất sau cột quang hóa của aflatoxin trong vòng phản ứng đặc biệt bằng tia UV, thể tích phản ứng chuẩn là 1,0 ml.

5.9.2  Cuvet PHRED (cuvet dẫn xuất quang hóa sau cột).

CẢNH BÁO - Tránh sự phơi nhiễm ánh sáng của tia UV.

5.9.3  Cuvet Kobra, cuvet điện hóa, cuvet dẫn xuất brom hóa sau cột.

CẢNH BÁO - Cài đặt ở 100 µA. Không được bật cuvet cho đến khi vận hành bơm LC để tránh màng cuvet bị quá nhiệt.

5.10  Ống ly tâm, dung tích 50 ml.

5.11  Máy trộn Vortex.

5.12  Ống đong chia độ, dung tích 25 ml.

...

...

...

6  Lấy mẫu

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển và bảo quản.

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 2625 (ISO 5555)^[1].

7  Chuẩn bị mẫu thử

Cân 5,0 g phần mẫu thử cho vào ống ly tâm 50 ml (5.10). Thêm 1,0 g NaCI (4.7) và 25 ml dung môi chiết (4.3). Đồng hóa hỗn hợp trong máy trộn Vortex (5.11) cho đến khi đồng nhất. Lắc trong máy lắc (5.1) ở tốc độ 400 r/min trong 10 min. Ly tâm ở 7000 r/min (g = 5323 mm/s²) trong 10 min. Hút và loại bỏ lớp dầu phía trên. Cho lớp metanol lỏng phía dưới qua giấy lọc gấp nếp (5.4). Dùng ống chia độ 25 ml (5.12) lấy 15 ml dịch lọc và đưa vào ống ly tâm 50 ml (5.10). Thêm 30 ml nước (4.1), trộn và lọc qua giấy lọc sợi bông thủy tinh (5.5). Thu lấy 30 ml dịch lọc (tương đương với 2 g mẫu thử) cho vào ống ly tâm 50 ml (5.2) và tiến hành chạy ngay sắc ký IAC.

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng lọ đã silan hóa để bảo quản các dung dịch chuẩn gốc aflatoxin. Tất cả các dụng cụ thủy tinh khác sử dụng không được silan hóa.

8  Cách tiến hành

8.1  Làm sạch bằng cột miễn nhiễm

Sau khi lấy ra từ nhiệt độ bảo quản 4 °C, cột miễn nhiễm được cân bằng đến nhiệt độ phòng ít nhất 15 min trước khi sử dụng. Bỏ nắp đậy cột và nối với bể thu nhận của cột phân phối (5.7). Tháo nắp dưới cột và để chất lỏng trong cột chảy qua cho đến khi chất lỏng đạt mức 2 mm trên bề mặt cột. Thêm 30 ml dịch lọc vào bầu thu nhận. Để dịch lọc tự chảy qua cột miễn nhiễm cho đến khi chất lỏng đạt mức 2 mm trên bề mặt cột. Thêm 10 ml dung dịch rửa vào bầu thu nhận. Để cột chảy đến khô và sau đó dùng xyranh thổi 10 ml không khí qua cột. Đặt bình định mức 2 ml (5.13) dưới cột. Rửa giải tiếp bằng 0,6 ml metanol (4.2) và thu lấy aflatoxin vào bình định mức 2 ml (5.13), để chảy nhỏ giọt, chảy đến khô. Rửa giải bằng 0,6 ml metanol và thu lấy dịch rửa giải vào cùng bình định mức. Để cột chảy đến khô và thổi 10 ml không khí qua cột. Pha loãng dịch rửa giải bằng nước đến vạch và tiến hành phân tích sắc ký lỏng.

...

...

...

Bơm 50 µl thuốc thử trắng (hiệu chỉnh 1), chuẩn làm việc aflatoxin (4.5.3) hoặc mẫu thử lên cột sắc ký lỏng. Nhận diện pic aflatoxin trong mẫu thử bằng cách so sánh thời gian lưu của mẫu với thời gian lưu của chuẩn. Rửa giải aflatoxin theo trình tự G₂, G₁, B₂, và B₁. Sau khi cho qua thiết bị dẫn xuất sau cột (5.9.1) , cuvet PHRED (5.9.2) hoặc cuvet Kobra (5.9.3), aflatoxin G₁ và aflatoxin B₁ được dẫn xuất thành G₂a (dẫn xuất của G₁) và B₂a (dẫn xuất của B₁). Thời gian lưu của aflatoxin G₂, G₂a, B₂, và B₂a trong khoảng từ 11 min đến 21 min, sử dụng cuvet PHRED (5.9.2) (Xem Hình A.1).

CHÚ THÍCH: Nếu sử dụng cuvet Kobra thì thời gian lưu sẽ ngắn hơn.

8.3  Dựng đường chuẩn

Các pic phải được nhận biết rõ trên đường nền. Dựng đường chuẩn của từng aflatoxin.

Dựng đồ thị diện tích pic (độ đáp ứng, trục Y) của từng aflatoxin chuẩn so với nồng độ (ng/ml, trục X) và xác định độ dốc (S) và điểm giao với trục Y (hệ số chặn a).

8.4  Định lượng aflatoxin

Xác định nồng độ của từng aflatoxin trong dung dịch thử từ đường chuẩn, sử dụng dung dịch hiệu chuẩn làm việc chứa bốn aflatoxin (4.5.3). Các dung dịch này nằm trong dải từ 0,4 ng/ml đến 10,0 na/ml đối với aflatoxin B₁; 0,1 ng/ml đến 2,5 ng/ml đối với aflatoxin B₂, 0,2 ng/ml đến 5,0 ng/ml đối với aflatoxin G₁ và 0,1 ng/ml đến 2,5 ng/ml đối với aflatoxin G₂.

Dựng đường chuẩn trước khi phân tích theo Bảng 1 và kiểm tra độ tuyến tính. Nếu diện tích phần thử phản ứng nằm ngoài (cao hơn) dải hiệu chuẩn thì mẫu chiết đã tinh sạch phải được pha loãng bằng hỗn hợp metanol và nước (4.4) (50:50, phần thể tích) và bơm lại lên cột sắc ký lỏng.

Tiến hành định lượng các aflatoxin bằng cách đo các diện tích pic ở thời gian lưu của từng aflatoxin và so sánh chúng với đường chuẩn tương ứng.

...

...

...

9.1  Tính hàm lượng các aflatoxin B₁, B₂, G₁, và G₂

Tính hàm lượng của từng aflatoxin trong mẫu thử, X_i, bằng microgam trên kilogam (µg/kg), theo Công thức:

Trong đó:

R là diện tích pic của dung dịch thử;

a là điểm giao của đồ thị với trục Y;

S là độ dốc của đồ thị;

V là thể tích cuối cùng của dung dịch thử được bơm, tính bằng mililit (ml);

F là hệ số pha loãng (F = 1 khi V = 2 ml);

...

...

...

9.2  Tính hàm lượng aflatoxin tổng số

Hàm lượng aflatoxin tổng số là tổng của các aflatoxin B₁, B₂, G₁ và G₂.

10  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm các thông tin sau:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được xem là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm;

e) kết quả thử thu được;

...

...

...

Phụ lục A

(Tham khảo)

Sắc ký đồ

Hình A.1 - Sắc đồ điển hình của dung dịch chuẩn aflatoxin

(aflatoxin = 4,0 ng/ml, thời gian lưu từ 11 min đến 21 min, dẫn xuất sau cột bằng cuvet PHRED)

Phụ lục B

...

...

...

Kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm

Kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm được cung cấp từ các phòng thử nghiệm chấp nhận phương pháp. Phép thử tiến hành trên mẫu dầu ôliu, dầu lạc và dầu vừng.

Bảng B.1 - Kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm đối với aflatoxin trong mẫu dầu ôliu

Aflatoxin^a (AF)

Mức bổ sung, µg/kg

Giá trị trung bình, µg/kg

Độ thu hồi trung bình, %

Độ lệch chuẩn lặp lại, s_r, µg/kg

Độ lệch chuẩn tái lập, s_R, µg/kg

...

...

...

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập RSD_r %

Chỉ số HorRat

Độ lệch chuẩn dự đoán, SD, 0,22c

Chỉ số HorRat^b

Số phòng thử nghiệm

Số phòng thử nghiệm ngoại lệ

B₁

1

0,86

...

...

...

0,07

0,10

8,09

11,18

0,24

0,19

0,51

14

1

...

...

...

0,25

0,23

93

0,01

0,02

5,40

7,52

0,13

0,05

...

...

...

13

2

G₁

0,5

0,45

90

0,05

0,06

11,75

...

...

...

0,26

0,10

0,60

14

1

G₂

0,25

0,21

82

...

...

...

0,02

5,08

7,57

0,13

0,05

0,34

13

2

AF

...

...

...

1,73

87

0,12

0,16

6,89

9,47

0,23

0,38

0,43

...

...

...

1

B₁

2

1,77

89

0,07

0,27

3,98

15,35

...

...

...

0,39

0,70

15

0

B₂

0,5

0,46

92

0,02

...

...

...

4,18

13,62

0,27

0,10

0,62

14

1

G₁

1

...

...

...

88

0,07

0,16

8,12

18,12

0,39

0,19

0,82

15

...

...

...

G₂

0,5

0,40

80

0,03

0,07

7,43

17,56

0,34

...

...

...

0,80

14

1

AF

4

3,56

89

0,12

0,52

...

...

...

14,52

0,39

0,78

0,66

13

2

B₁

10

8,61

...

...

...

0,57

1,00

6,67

11,62

0,35

1,89

0,53

14

1

...

...

...

2,5

2,23

89

0,14

0,25

6,20

11,15

0,28

0,49

...

...

...

14

1

G₁

5

4,25

85

0,28

0,63

6,60

...

...

...

0,40

0,93

0,67

14

1

G₂

2,5

1,90

76

...

...

...

0,22

6,68

11,45

0,28

0,42

0,52

13

2

AF

...

...

...

16,89

84

0,96

1,79

5,70

10,59

0,36

3,72

0,48

...

...

...

1

^a AF là tổng của aflatoxin B₁, B₂, G₁ và G₂.

^b Phép tính sử dụng độ lệch chuẩn dự đoán là 0,22 c.

CHÚ THÍCH: Mẫu trắng được phát hiện chứa hàm lượng aflatoxin < 0,1 µg/kg.

Bảng B.2 - Kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm đối với aflatoxin trong mẫu dầu lạc

Aflatoxin^a (AF)

Mức bổ sung, µg/kg

Giá trị trung bình, µg/kg

Độ thu hồi trung bình, %

...

...

...

Độ lệch chuẩn tái lập, s_R µg/kg

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSD_r %

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập RSD_R %

Chỉ số HorRat

Độ lệch chuẩn dự đoán, SD, 0,22c

Chỉ số HorRat^b

Số phòng thử nghiệm

Số phòng thử nghiệm ngoại lệ

B₁

...

...

...

0,86

86

0,07

0,08

8,39

8,72

0,19

0,19

0,40

...

...

...

2

B₂

0,25

0,24

94

0,02

0,02

7,94

10,51

...

...

...

0,05

0,48

15

0

G₁

0,5

0,47

94

0,05

...

...

...

11,4

11,65

0,23

0,10

0,53

15

0

G₂

0,25

...

...

...

85

001

0,03

6,08

12,22

0,21

0,05

0,56

14

...

...

...

AF

2

1,80

90

0,17

0,19

9,27

10,36

0,25

...

...

...

0,47

15

0

B₁

2

1,77

89

0,19

0,22

...

...

...

12,34

0,30

0,39

0,56

15

0

B₂

0,5

0,47

...

...

...

0,04

0,05

8,30

10,50

0,21

0,10

0,48

15

0

...

...

...

1

0,93

93

0,09

0,12

9,72

13,22

0,29

0,20

...

...

...

15

0

G₂

0,5

0,42

84

0,03

0,05

7,64

...

...

...

0,21

0,09

0,50

14

1

AF

4

3,56

89

...

...

...

0,35

8,91

9,94

0,27

0,78

0,45

15

0

B₁

...

...

...

8,70

87

0,30

0,65

3,50

7,45

0,23

1,91

0,34

...

...

...

0

B₂

2,5

2,28

91

0,07

0,17

3,24

7,36

...

...

...

0,50

0,33

15

0

G₁

5

4,40

88

0,29

...

...

...

6,51

10,80

0,30

0,97

0,49

15

1

G₂

2,5

...

...

...

80

0,10

0,19

4,82

9,61

0,27

0,44

0,44

14

...

...

...

AF

20

17,29

87

0,65

1,09

3,76

6,30

0,21

...

...

...

0,29

15

0

B₁

NC

10,70

NA

1,17

1,57

...

...

...

14,66

0,46

2,35

0,67

15

0

B₂

NC

1,73

...

...

...

0,16

0,25

9,51

14,59

0,35

0,38

0,66

15

0

...

...

...

NC

0,62

NA

0,07

0,09

10,73

14,35

0,30

0,14

...

...

...

14

1

G₂

NC

0,11

NA

0,01

0,02

14,17

...

...

...

0,38

0,02

1,08

14

1

AF

NC

13,17

NA

...

...

...

1,89

10,15

14,34

0,47

2,90

0,65

15

0

^a AF là tổng của aflatoxin B₁, B₂, G₁ và G₂.

...

...

...

CHÚ THÍCH: Mẫu trắng được phát hiện chứa hàm lượng aflatoxin < 0,1 µg/kg.

NA: Không áp dụng.

NC: Mẫu bị nhiễm tự nhiên.

Bảng B.3 - Kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm đối với aflatoxin trong mẫu dầu vừng

Aflatoxin^a (AF)

Mức bổ sung, µg/kg

Giá trị trung bình, µg/kg

Độ thu hồi trung bình, %

Độ lệch chuẩn lặp lại, s_r µg/kg

...

...

...

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSD_r %

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập RSD_R %

Chỉ số HorRat

Độ lệch chuẩn dự đoán, SD, 0,22c

Chỉ số HorRat^b

Số phòng thử nghiệm

Số phòng thử nghiệm ngoại lệ

B₁

1

...

...

...

91

0,04

0,07

4

8,05

0,18

0,20

0,37

13

...

...

...

B₂

0,25

0,24

94

0,01

0,02

3,91

7,13

0,13

...

...

...

0,32

13

2

G₁

0,5

0,49

97

0,07

0,08

...

...

...

15,92

0,32

0,11

0,72

15

0

G₂

0,25

0,2

...

...

...

0,01

0,04

7,63

18,12

0,31

0,04

0,82

14

1

...

...

...

2

1,82

91

0,06

0,11

3,23

6,08

0,15

0,40

...

...

...

13

2

B₁

2

1,85

93

0,13

0,2

7,03

...

...

...

0,26

0,41

0,49

14

1

B₂

0,5

0,48

95

...

...

...

0,04

6,16

8,32

0,20

0,10

0,38

14

1

G₁

...

...

...

0,96

97

0,14

0,15

14,89

15,09

0,33

0,21

0,69

...

...

...

0

G₂

0,5

0,39

78

0,03

0,07

6,77

17,03

...

...

...

0,09

0,77

15

0

AF

4

3,69

92

0,25

...

...

...

6,64

8,19

0,22

0,81

0,37

14

1

^a AF là tổng của aflatoxin B₁, B₂, G₁ và G₂.

^b Phép tính sử dụng độ lệch chuẩn dự đoán là 0,22 c.

...

...

...

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] TCVN 2625 (ISO 5555) Dầu mỡ động vật và thực vật - Lấy mẫu.

1) VWR DS 500 E (VWR International, Bridgeport, NJ, Hoa Kỳ) là sản phẩm thích hợp có bán sẵn. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn, có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương.

2) Allegra X-22R là sản phẩm của Beckman Coulter, Inc., Brea, CA. Hoa Kỳ. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn, có thể sử dụng các sản phảm tương tự nếu cho kết quả tương đương.

3) Cột AflaTest WB (G1024; VICAM, Watertown, MA, Hoa Kỳ) là sản phẩm thích hợp có bán sẵn. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn, có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương.

4) YMC AQ12S03-1546WT, YMC ODS-AQ S-3 là sản phẩm thích hợp có bán sẵn. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn, có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11516:2016 về Dầu thực vật- Xác định hàm lượng aflatoxin tổng số và các aflatoxin B1, B2, G1, G2 - Phương pháp sắc ký lỏng có làm sạch bằng cột ái lực miễn nhiễm