4  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và cụ thể như sau:

4.1  Máy sắc ký trao đổi anion hiệu năng cao (HPAEC), gồm có các bộ phận:

- Bơm gradient dùng cho sắc ký lỏng;

- Bộ khử khí;

- Van bơm micro;

- Detector điện hóa xung ampe (điện cực bằng vàng đường kính 1,0 mm và điện cực chuẩn kết hợp bạc-bạc clorua (Ag-AgCI), thân của cuvet bằng titan làm điện cực máy đối) làm việc ở chế độ detector xung ampe (PAD);

- Bộ bơm mẫu tự động;

- Bộ phân tích dữ liệu.

...

...

...

4.3  Máy đo pH

4.4  Lọ nhỏ bằng chất dẻo, dung tích 50 ml, có nắp vặn, bền với nhiệt độ đến 100 °C.

4.5  Nồi cách thủy, có bộ phận lắc, duy trì ở 60 °C ± 2 °C và 80 °C ± 2 °C.

4.6  Bể đá lạnh.

4.7  Xyranh, dung tích 10 ml, tạo áp suất thấp, dùng cho bộ lọc màng cỡ lỗ 25 mm, có màng lọc cỡ lỗ 0,2 μm.

4.8  Pipet, có các dung tích 20 μl, 100 μl, và 1000 μl có đầu tip dùng một lần.

4.9  Pipet pasteur dùng một lần, kích thước 146 mm.

4.10  Máy li tâm phòng thử nghiệm, để giữ các ống nghiệm nhỏ; vận hành ở gia tốc 11 000 x g.

4.11  Máy li tâm, để giữ các ống dung tích 30 ml; vận hành ở gia tốc 1 000 x g.

...

...

...

4.13  Ống nghiệm nhỏ (microtubes), bằng polypropylen, dung tích 1,5 ml, có nắp vặn.

4.14  Ống nghiệm, bằng chất dẻo, dung tích 15 ml, có nắp vặn.

4.15  Máy làm sạch bằng siêu âm, có khả năng khử khí.

4.16  Máy trộn Vortex.

4.17  Bộ lọc màng, cỡ lỗ 0,2 μm.

4.18  Tủ sấy.

5  Lấy mẫu

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Xem tiêu chuẩn cụ thể có liên quan đến sản phẩm. Nếu chưa có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm thì các bên có liên quan nên thỏa thuận với nhau về vấn đề này.

...

...

...

Đồng hóa mẫu phòng thử nghiệm dạng lỏng ngay trước khi phân tích. Cắt nhỏ hoặc nghiền nhỏ mẫu cứng sao cho lọt qua sàng cỡ lỗ 1 mm² (sàng số 18).

7  Cách tiến hành

7.1  Các điều kiện vận hành HPAEC

Các điều kiện vận hành sau đây cho thấy thích hợp:

- Nhiệt độ cột, từ 20 °C đến 30 °C, sai số cho phép ± 0,5 °C, tốt nhất là (20 ± 0,5) °C;

- Tốc độ dòng 1,0 ml/min;

- Thể tích bơm: 20 μl;

- Độ nhạy detector, dải từ 1 μC đến 3 μC.

Xem Bảng 2 đối với gradient rửa giải và Bảng 3 đối với chương trình thời gian của detector. Các thông số có thể thay đổi để tối ưu hóa sắc ký.

...

...

...

Thời gian

min

Pha động

%

A

B

C

0,00

95

...

...

...

0

20,10

95

5

0

35,00

0

100

0

...

...

...

0

100

0

36,10

0

0

100

46,00

0

...

...

...

100

46,10

95

5

0

61,00

95

5

0

...

...

...

Thời gian

S

Điện thế

V

Tích phân

0,00

0,05

0,20

...

...

...

Bắt đầu

0,40

0,05

Kết thúc

0,41

0,75

0,60

0,75

...

...

...

0,61

-0,15

1,00

-0,15

7.2  Chiết

Xem Hình 1 về sơ đồ chiết và thủy phân.

Mẫu thử

...

...

...

Hòa tan chất chiết

Dung dịch đệm phosphat nóng (khoảng 80 °C), 40 ml, pH 6,0 trong 30 min ở 80 °C

Hình 1 - Sơ đồ phương pháp TGOS sử dụng enzym

Cân lọ bằng chất dẻo rỗng, dung tích 50 ml có nắp vặn (M₁), chính xác đến 1 mg. Cân lượng mẫu thử, tương ứng với khoảng 0,1 g đến 0,3 g tổng TGOS và lactose, nhưng không được quá 10 g phần mẫu thử, chính xác đến 1 mg, cho vào lọ này (M₂ chỉ gồm khối lượng tịnh của phần mẫu thử). Thêm khoảng 40 ml dung dịch đệm phosphat nóng (khoảng 80 °C) (3.1), đậy nắp lọ và trộn đều. Giữ lọ ở 80 °C ± 2 °C trong nồi cách thủy (4.5) có khuấy liên tục trong 30 min. Để nguội đến nhiệt độ phòng trong bể đá lạnh (4.6). Đo và chỉnh pH khoảng từ 5,7 đến 6,3 bằng dung dịch natri hydroxit 1 M (3.4) hoặc dung dịch axit clohydric 1 M (3.2), nếu cần. Pha loãng dung dịch thử đến khoảng 50 ml bằng dung dịch đệm phosphat (3.1). Cuối cùng, cân lọ gồm cả nắp và dung dịch (M₃), chính xác đến 1 mg, sau đó xác định khối lượng tịnh của chất chiết thử nghiệm.

7.3  Thủy phân bằng enzym

7.3.1  Dung dịch đã xử lý

Cân lọ bằng chất dẻo rỗng gồm cả nắp vặn (M₄), chính xác đến 1 mg. Chuyển 20 g chất chiết thử nghiệm từ 7.2 vào lọ và xác định khối lượng tịnh của chất chiết thử nghiệm (M₅). Dùng pipet lấy 1 ml dung dịch β-galactosidase (3.5) cho vào lọ này, đậy nắp và trộn đều nhẹ.

7.3.2  Dung dịch thử ban đầu

...

...

...

7.3.3  Ủ ấm cả enzym hoạt tính và enzym bất hoạt chứa các chất chiết trong 30 min ở 60 °C ± 2 °C có khuấy nhẹ liên tục, đo thời gian từ khi làm ấm đến khi hỗn hợp đạt 60 °C. Tránh hình thành bọt hoặc bọt khí trong khi lắc. Dùng bể đá lạnh (4.6) để làm nguội đến nhiệt độ phòng. Thêm 5 ml axetonitril 20 % (3.7) vào dung dịch đã xử lý chứa enzym hoạt tính, trộn đều và cân lọ đã đậy kín (M₆). Thêm 4 ml axetonitril 20 % (3.7) vào dung dịch thử ban đầu chứa enzym bất hoạt, trộn đều và cân lọ đã đậy kín (M₉). Ly tâm tất cả các dung dịch ở 10 000 g trong 10 min và lọc dịch nổi phía trên qua bộ lọc màng cỡ lỗ 0,2 μm (4.17). Dùng dịch lọc để đo nồng độ. Các chất chiết chứa enzym bất hoạt được gọi là A₁ và các chất chiết thủy phân được gọi là A₂.

7.4  Xác định lactose và galactose

7.4.1  Chuẩn bị dung dịch thử để phân tích HPAEC-PAD

Pha loãng dịch lọc đã ly tâm (7.3) bằng axetonitril 3 % (3.5) sao cho hàm lượng galactose và lactose trong phạm vi dải nồng độ dung dịch chuẩn làm việc. Có thể cần sử dụng 3 hệ số pha loãng khác nhau, phụ thuộc vào bản chất của mẫu thử. Các giá trị hướng dẫn và ký hiệu về độ pha loãng được nêu trong Bảng 3.

Bảng 3 - Các giá trị hướng dẫn đối với độ pha loãng dùng cho phép phân tích HPAEC-PAD

Nhóm thực phẩm

M₂ (g)

D₁^a

D₂^b

...

...

...

Sữa chua uống (từ 4 % đến 7 % TGOS)

2,5

25

250

100

Syrô quả (từ 14 % đến 18 % TGOS)

1,5

10

300

...

...

...

Bánh trứng sữa (Custard) (từ 4 % đến 7 % TGOS)

2,0

4

200

100

Nước cam (từ 4 % đến 7 % TGOS)

2,5

3

125

...

...

...

Bánh quy (từ 7 % đến 10 % TGOS)

2,0

6

200

60

Ngũ cốc (từ 4 % đến 7 % TGOS)

1,0

5

200

...

...

...

^a D₁ là hệ số pha loãng của galactose trong phép phân tích A₁.

^b D₂ là hệ số pha loãng của galactose trong phép phân tích A₂.

^c D₃ là hệ số pha loãng của lactose trong phép phân tích A₁.

7.4.2  Xác định

Sử dụng cùng một dạng tích phân đối với dung dịch thử và các dung dịch chuẩn làm việc bằng cách chọn cùng chiều rộng pic, cùng ngưỡng thiết lập và cùng các thông số tích phân khác. Kiểm soát cẩn thận việc lựa chọn đường nền bằng cách kéo dài đường nền đến pic. Dùng diện tích pic để định lượng.

Đầu tiên chạy 4 dung dịch chuẩn hiệu chuẩn của từng loại đường để thiết lập tuyến tính. Sau đó lặp lại với 4 dung dịch chuẩn. Cứ giữa hai bộ dung dịch chuẩn, thì chạy 9 dung dịch thử [ví dụ, WS₁, WS₂, WS₃, WS₄, dung dịch thử ban đầu 1A₁ (hệ số pha loãng D₁), dung dịch thử ban đầu 1A₁ (hệ số pha loãng D₃), dung dịch đã xử lý 1A₂, dung dịch thử ban đầu 2A₁ (hệ số pha loãng D₁), dung dịch thử ban đầu 2A₁ (D₃), dung dịch đã xử lý 2A₂, dung dịch thử ban đầu 3A₁ (D₁), dung dịch thử ban đầu 3A₁ (D₃), dung dịch đã xử lý 3A₂, WS₁, WS₂, WS₃, WS₄, dung dịch thử ban đầu 4A₁ (D₁), dung dịch thử ban đầu 4A₁ (D₃), dung dịch đã xử lý 4A₂, v.v...]. Tiếp tục quy trình này cho đến khi tất cả các dung dịch thử được phân tích. Sử dụng hệ số đáp ứng trung bình từ các dung dịch chuẩn cũng như dung dịch thử để tính nồng độ đường trong từng dung dịch thử.

7.4.3  Khả năng gây nhiễu

Galactose là chỉ tiêu quan trọng nhất để đánh giá hàm lượng TGOS trong sản phẩm. Sự không chính xác trong phép xác định galactose sau khi thủy phân bằng enzym trong mẫu thử có hàm lượng lactose cao như các sản phẩm ngũ cốc và các sản phẩm dạng bột chứa sữa có thể ảnh hưởng đến phép đo galactose được giải phóng từ TGOS. Thủy phấn không chọn lọc các alpha-galactan (ví dụ: bột carob) bằng β-galactosidase cũng có thể xảy ra làm cho kết quả không ổn định. Chỉ sử dụng chế phẩm enzym mới.

8  Tính kết quả

...

...

...

Hàm lượng galactose ban đầu (galactose tự do) trong mẫu thử, G_b, tính bằng gam trên 100 g (g/100 g), được tính bằng Công thức (1):

                                            (1)

Trong đó

D₁  là hệ số pha loãng của galactose trong phép phân tích A₁;

C_Gb  là số miligam galactose trong một kilôgam trong dung dịch thử ban đầu A₁;

M₇ là khối lượng của lọ rỗng và nắp (7.3.2) tính bằng gam (g);

M₈ là khối lượng của dung dịch thử, tính bằng gam (g);

M₉ là khối lượng lọ chứa dung dịch thử ban đầu và nắp sau khi bổ sung axetonitril (7.3.2), tính bằng gam (g);

F là hệ số được tính bằng Công thức (2):

...

...

...

Trong đó

M₁  là khối lượng lọ rỗng cùng với nắp (7.2), tính bằng gam (g);

M₂  là khối lượng tịnh của phần mẫu thử (7.2), tính bằng gam (g);

M₃  là khối lượng tịnh của chất chiết (7.2), tính bằng gam (g).

8.2  Hàm lượng lactose

Hàm lượng lactose trong mẫu thử, L_b, tính bằng gam trên 100 g, được tính bằng Công thức (3):

                                            (3)

Trong đó

C_Lb  là số miligam lactose trong một kilôgam dung dịch thử ban đầu trong phép phân tích A₁;

...

...

...

Xem thêm các giải thích trong 8.1.

8.3  Hàm lượng galactose tổng số

Hàm lượng galactose tổng số của dung dịch thủy phân A₂, G_t, tính bằng gam trên 100 g (g/100 g), được tính bằng Công thức (4):

                                             (4)

Trong đó

C_Gt  là số miligam galactose trong một kilôgam dung dịch đã được xử lý trong phép phân tích A₂;

F  là hệ số được tính bằng Công thức (2);

D₂  là hệ số pha loãng của galactose trong phép phân tích A2;

M₄  là khối lượng của lọ rỗng và nắp (7.3.1) tính bằng gam (g);

...

...

...

M₆ là khối lượng lọ chứa dung dịch xử lý và nắp (7.3.3), tính bằng gam (g).

8.4  Hàm lượng galactose được giải phóng

Hàm lượng galactose trong mẫu thử được giải phóng ra khỏi TGOS, G_g, tính bằng gam trên 100 g, được tính bằng Công thức (5):

                                                         (5)

Trong đó

G_t  là hàm lượng galactose tổng số trong mẫu thử tính được từ Công thức 4, tính bằng gam trên 100 g (g/100 g);

G_b  là hàm lượng galactose (tự do) ban đầu, tính được từ Công thức 1, tính bằng gam trên 100 g (g/100 g);

G₁  là hàm lượng galactose được giải phóng ra khỏi lactose, tính được từ Công thức (6), tính bằng gam trên 100 g (g/100 g).

                                                                       (6)

...

...

...

8.5  Hàm lượng TGOS

Hàm lượng TGOS trong mẫu thử tính bằng gam trên 100 g, được tính bằng Công thức (7):

  (7)

Trong đó

G_g  là hàm lượng galactose tính được từ Công thức (5):

n  là số nhóm chức galactose trung bình trong phân tử TGOS.

9  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin sau đây:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử;

...

...

...

c) phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc những điều được coi là tự chọn, và bất kỳ chi tiết nào có ảnh hưởng tới kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Kết quả nghiên cứu

Bảng A.1 - Các kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm

Chất nền

...

...

...

Giá trị trung bình,

g/100g

Độ lệch chuẩn lặp lại (S_r)

Độ lệch chuẩn tái lập (S_R)

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại (RSD_r)

%

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập (RSD_R)

%

Giới hạn lặp lại (r)

...

...

...

Độ thu hồi,

%

Nước cam

9 (0)

3,6

0,29

0,29

8,1

8,1

...

...

...

0,82

90

Bánh trứng (custard)

9 (0)

4,8

0,30

0,40

6,3

8,5

...

...

...

1,13

96

Ngũ cốc

9 (0)

4,9

0,19

0,54

3,9

10,9

...

...

...

1,50

98

Sữa chua uống

9 (0)

5,6

0,41

0,47

7,5

8,5

...

...

...

1,31

93

Bánh quy

9 (0)

7,9

0,92

0,92

11,6

11,6

...

...

...

2,58

88

Syrô chanh

8 (1)

13,8

0,40

0,63

2,9

4,6

...

...

...

1,76

92

^a) số lượng các phòng thử nghiệm được giữ lại sau khi trừ ngoại lệ;

^b) số lượng các phòng thử nghiệm ngoại lệ.

1) Đơn vị này (thường là đơn vị quốc tế hoặc đơn vị chuẩn) được định nghĩa là lượng enzym xúc tác chuyển đổi 1 μmol cơ chất trong 1 min ở các điều kiện chuẩn.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11493:2016 về Thực phẩm - Xác định hàm lượng trans-galactooligosacarid (TGOS) - Phương pháp sắc ký trao đổi ion