3.4.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong nước bằng cách đun nóng có khuấy.

Hấp 15 min trong nồi hấp áp lực ở 121 ^o C. pH cuối cùng phải là 7,2 ± 0,2.

3.5  Môi trường thạch sinh màu Biosynth (BCM) O157:H7(+), có sẵn từ Biosynth International, Inc (1665 W. Quincy Ave, Suite 155, Naperville, IL 60504, Hoa Kỳ)¹⁾

3.5.1  Thành phần

BCM O157: H7(+)

80,0 g

N,N-dimethylformamide (DMF, Sigma, Cat. No. D4254.)¹⁾

5,0 ml

...

...

...

5,0 ml

Kali tellurit (dung dịch 0,1 %, Sigma, Cat. No. P0677.)¹⁾

0,2 ml

Nước

1 lít

3.5.2  Chuẩn bị

Cho DMF vào nước cất, sau đó thêm bột BCM và đun sôi để hòa tan. Chỉnh pH đến 6,8 ± 0,1. Không hấp áp lực. Làm nguội đến nhiệt độ từ 50 ^oC đến 55 ^oC trong nồi cách thủy. Lọc qua xyranh (4.3) để khử trùng novobiocin và kali tellurit riêng rẽ và bổ sung vào môi trường một cách vô trùng.

3.6  Môi trường CHROMagar™ O157, có sẵn từ CHROMagar Microbiology (Paris, Pháp)¹⁾

3.6.1  Thành phần

...

...

...

29,2 g

Nước

1 lít

3.6.2  Chuẩn bị

Hòa bột từ từ vào trong nước bằng cách xoay bình. Đun đến sôi (100 ^oC) trong khi vẫn xoay bình và thỉnh thoảng khuấy. Nếu sử dụng nồi hấp áp lực, thì không dùng áp lực. Không làm nóng quá 100 ^oC. Làm nguội đến khoảng 45 ^oC đến 50 ^oC trong nồi cách thủy.

3.8  Dung dịch natri hydroxit (NaOH), 1 M

4  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và cụ thể các thiết bị, dụng cụ sau:

4.1  Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ từ 36 ^oC đến 38 ^oC và từ 42 ^oC đến 43 ^oC

...

...

...

4.3  Xyranh, được trang bị bộ lọc cỡ lỗ nhỏ hơn hoặc bằng 0,45 μm.

4.4  Ống nghiệm, kích thước 16 mm x 100 mm bằng thủy tinh bo silicat.

4.5  Pipet.

4.6  Micropipet, có thể phân phối chính xác 0,12 ml.

4.7  Túi nhu động.

4.8  Bình định mức, dung tích 1 lít.

4.9  Bình nón, dung tích 500 ml, có nắp vặn.

5  Cách tiến hành

5.1  Chuẩn bị huyền phù mẫu thử

...

...

...

Cắt mẫu rau một cách vô trùng và chuyển 50 g sang túi vô trùng. Thêm 50 ml chất pha loãng BPB (3.3), đóng nắp túi và lắc bằng tay 15 min. Gạn lấy 25 ml cho vào bình nón 500 ml (4.9) có chứa sẵn 225 ml môi trường 8 h (3.1). Nới lỏng nắp bình, lắc nhẹ để trộn và ủ 8 h ở 42 ^oC đến 43 ^oC trong tủ ấm (4.1). Lấy 5 ml môi trường cho vào ống nghiệm (4.4). Đặt ống nghiệm vào nồi cách thủy (4.2) ở 100 ^oC trong 10 min. Làm nguội đến nhiệt độ phòng.

5.1.2  Đối với thịt nguyên liệu và thịt xay

Cân vô trùng khoảng 25,0 g phần mẫu thử cho vào túi nhu động (4.7) có chứa sẵn 225 ml môi trường 8 h (3.1). Bóp bằng tay để trộn đều và ủ 8 h ở nhiệt độ từ 42 ^oC đến 43 ^oC trong tủ ấm (4.1).

Đối với mẫu thử là khối thịt nguyên liệu hoặc khối thịt xay có khối lượng 375 g, cân vô trùng 375 g phần mẫu thử cho vào vật chứa vô trùng có dung tích thích hợp. Thêm 3,375 lít môi trường 8 h (3.1) đã làm ấm đến nhiệt độ 42 ^oC ± 1 ^oC. Bóp bằng tay để trộn đều và ủ 12 h ở nhiệt độ 42 ^oC ± 1 ^oC trong tủ ấm (4.1).

Đối với cả hai trường hợp nêu trên, sau khi ủ, chuyển 5 ml mới trường vào ống nghiệm (4.4). Đặt ống nghiệm vào nồi cách thủy (4.2) ở 100 ^oC trong 10 min. Làm nguội đến nhiệt độ phòng.

5.2  Xác định

Mở túi chứa bộ thử (3.2). Sử dụng một bộ thử cho mỗi phép thử. Dùng pipet (4.6) chuyển 0,12 ml chủng cấy đã xử lý nhiệt từ ống nghiệm đã chuẩn bị trong 5.1, đưa mẫu vào cổng của bộ thử. Ủ 15 min ở nhiệt độ phòng.

5.3  Đọc kết quả

Kiểm tra bộ thử ngay sau khi phát triển được 15 min.

...

...

...

Kết quả âm tính nếu chỉ có một vạch duy nhất trong vùng phía trên (vùng đối chứng) trong ô đọc kết quả.

Kết quả không hợp lệ nếu không có vạch nào trong vùng phía trên (vùng đối chứng) của ô đọc kết quả, cho dù vẫn có một vạch trong vùng phía dưới (vùng thử nghiệm).

5.4  Khẳng định kết quả

Phép thử dương tính giả định (xem 5.3) phải được khẳng định.

a) Đối với mẫu thử là rau, thịt nguyên liệu và thịt xay

Chuẩn bị các dung dịch pha loãng thích hợp từ chủng cấy tăng sinh trong môi trường 8 h và dàn đều vào thạch HC (3.4) và thạch BCM (3.5). Các khuẩn lạc âm tính với thuốc thử sorbitol và MUG được phân lập từ thạch HC cần được khẳng định về mặt huyết thanh học với các kháng huyết thanh O157 và H7.

b) Đối với mẫu thử là khối thịt nguyên liệu hoặc khối thịt xay có khối lượng 375 g

Cấy đĩa các chủng cấy tăng sinh trong môi trường 8 h vào môi trường CHROMagar™ O157 (3.6) và ủ 24 h ± 1 h ở nhiệt độ 37 ^oC ± 1 ^oC trong tủ ấm (4.1). Các khuẩn lạc E. coli O157:H7 sẽ có màu tím hoa cà trong khi các vi khuẩn coliform khác có màu xanh, màu xám hoặc không màu. Tiếp tục thực hiện phép thử khẳng định về mặt huyết thanh học.

Khuẩn lạc nghi ngờ được khẳng định nếu đáp ứng ít nhất một trong các tiêu chí sau:

...

...

...

- dương tính với phép thử gen độc tố Shiga “stx”;

- được xác định về gen là “H7”.

6  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm ít nhất phải bao gồm các thông tin sau đây:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

c) kết quả thử nghiệm;

d) ngày kết thúc thử nghiệm;

e) mọi chi tiết thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này hoặc những điều được coi là tùy chọn có thể ảnh hưởng đến kết quả.

...

...

...

Phụ lục A

(Tham khảo)

Kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm

Bảng A.1 - Kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm đối với E. coli O157:H7 trên rau diếp và sản phẩm thịt bò

Mẫu

Mức

MPN/g

Tổng số mẫu

Kết quả dương tính trên Hệ thống thử 8 h

...

...

...

Độ nhạy^d, %

Tỷ lệ âm tính giả^e, %

Độ đặc hiệu^f, %

Tỷ lệ dương tính giả^g %

Giả định^a

Khẳng định^b

Thử 8 h

Đối chứng

Thử 8 h

...

...

...

Thử 8 h

Đối chứng

Thử 8 h

Đối chứng

Rau diếp

Thấp

0,03

75

48

...

...

...

0,17

61,3

57,3

38,7

42,7

-

-

-

-

...

...

...

1,1

75

59

52

0,54

69,3

76

30,7

24

...

...

...

-

-

-

Đối chứng

75

1

0

0

...

...

...

-

-

-

100

100

0

0

Thịt bò nguyên liệu

Thấp

...

...

...

70

55

48

15,4

68,6

32,9

31,4

67,1

-

...

...

...

-

-

Cao

2,92

70

67

63

21,46

90,0

...

...

...

10,0

50

-

-

-

-

Đối chứng

70

...

...

...

0

0

-

-

-

-

100

100

0

...

...

...

Thịt bò xay nguyên liệu

Thấp

0,07

75

67

56

0,8

74,7

66,7

...

...

...

33,3

-

-

-

-

Cao

0,28

75

74

...

...

...

3,86

96,0

85,3

4,0

14,7

-

-

-

-

...

...

...

75

8

0

0

-

-

-

-

...

...

...

100

0

0

CHÚ DẪN:

MPN: Số đơn vị hình thành khuẩn lạc có xác suất lớn nhất, tính theo CFU/g (giới hạn tin cậy 95 %).

^a) Bộ thử cho kết quả dương tính với canh thang tăng sinh 8 h.

^b) Các chủng cấy tăng sinh của mẫu dương tính giả định được khẳng định theo 5.4a

c) Khi bình phương đối với hai mẫu độc lập: X² = N x

Trong đó:

...

...

...

b: là số mẫu dương tính trong phép thử khẳng định (5.4),

c: là số mẫu âm tính trong phép thử 8 h,

d: là số mẫu dương tính trong phép thử khẳng định (5.4),

N: là tổng số mẫu đã thử với cả hai phương pháp.

Giá trị X² > 3,84 cho thấy sự khác biệt đáng kể ở mức xác suất 5 %.

^d) Độ nhạy là tỉ lệ phần trăm của tổng số phần mẫu thử dương tính với phép thử khẳng định (5.4) so với tổng số mẫu cấy.

^e) Tỷ lệ âm tính giả bằng (100 - độ nhạy). Số phép thử dương tính khẳng định là thấp sẽ cho tỷ lệ âm tính giả cao.

^f) Độ đặc hiệu là tỉ lệ phần trăm của tổng số phần mẫu thử âm tính với phép thử khẳng định (5.4) so với tổng số mẫu chưa cấy. Có thể tính trên số mẫu đối chứng chưa cấy.

^g) Tỷ lệ âm dương giả bằng (100 - độ đặc hiệu).

...

...

...

Mẫu

Chủng

MPN/g^a

MPN/ phần mẫu thử (375 g)^a

Tổng số mẫu

Kết quả trên Hệ thống thử 8 h

X ^{2 d}

Thử 8 h

Giả định^b

...

...

...

Độ nhạy^e, %

Tỷ lệ âm tính giả^f, %

Độ đặc hiệu^g, %

Tỷ lệ dương tính giả^h, %

Thịt bò xay nguyên liệu

ATCC 35150

0,015
(0,0037÷0,042)

5,6

(1,4-16)

...

...

...

19

19

3,06

100

0

-

-

<0,003
(0 ÷ 0,0095)

<1,1

...

...

...

5

0

0

-

-

-

100

0

Thịt bò nguyên liệu

...

...

...

<0,003
(0 ÷ 0,0095)

<1,1
(0-3,6)

20

18

18

3,49

100

0

-

...

...

...

<0,003
(0 ÷ 0,0095)

<1,1
(0-3,6)

5

0

0

-

-

-

100

...

...

...

CHÚ DẪN:

^a) MPN: Số đơn vị hình thành khuẩn lạc có xác suất lớn nhất, tính theo CFU/g hoặc CFU/375 g (giới hạn tin cậy 95 %).

^b) Bộ thử cho kết quả dương tính không được khẳng định tiếp theo.

^c) Bộ thử cho kết quả dương tính được khẳng định tiếp theo.

^d) Khi bình phương đối với hai mẫu độc lập: X² = (N - 1) x ,

Trong đó:

a: là số mẫu dương tính trong phép thử 8 h,

b: là số mẫu âm tính trong phép thử 8 h,

c: là số mẫu dương tính trong phép thử khẳng định (5.4),

...

...

...

N: là tổng số mẫu đã thử với cả hai phương pháp.

Giá trị X² > 3,84 cho thấy sự khác biệt đáng kể ở mức xác suất 5 %.

^e) Độ nhạy là tỉ lệ phần trăm của tổng số phần mẫu thử dương tính với phép thử khẳng định (5.4) so với tổng số mẫu cấy.

^f) Tỷ lệ âm tính giả bằng (100 - độ nhạy).

^g) Độ đặc hiệu là tỉ lệ phần trăm của tổng số phần mẫu thử âm tính với phép thử 8 h so với tổng số mẫu âm tính. Có thể tính trên số mẫu đối chứng chưa khẳng định.

^h) Tỷ lệ âm dương giả bằng (100 - độ đặc hiệu).

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] United States Food and Drug Administration - Center for Food Safety & Applied Nutrition, Bacteriological Analytical Manual, Chapter 4 : Escherichia coli and the Coliform Bacteria, 2001

...

...

...

1) Ví dụ về sản phẩm thích hợp có bán sẵn. Thông tin này được đưa ra nhằm tạo thuận lợi cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng các sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11397:2016 về Vi sinh vật trong thực phẩm – Phát hiện E.coli O157:H7 – Phương pháp 8h