4.2  Cột sắc ký lỏng

Kích thước 250 mm x 4,6 mm đường kính trong và cột bảo vệ kích thước 20 mm x 4,6 mm đường kính trong, cả hai cột octadecyldimethylsilyl (đã khử hoạt tính) pha đảo, đường kính lỗ 10 nm, cỡ hạt: 5 µm, và bộ lọc tiền cột phân tán thấp 0,5 μm với đường kính 3 mm.

4.3  Bộ cô quay, cài đặt ở nhiệt độ 32 °C ± 2 °C.

4.4  Máy trộn vortex.

4.5  Ống nghiệm polypropylen, dung tích 50 ml.

4.6  Pipet, dung tích 1 ml, 10 ml và 100 μl.

4.7  Giấy lọc gấp nếp, đường kính 12,5 cm, giữ được cỡ hạt thô với tốc độ chảy nhanh.

4.8  Bộ lọc với màng lọc nylon, cỡ lỗ 0,4 μm (N66), ví dụ: bộ lọc Supelco, Inc., PA là thích hợp.

4.9  Bình quả lê, dung tích 100 ml, bằng thủy tinh có cổ hình côn chuẩn 24/40, có nắp.

...

...

...

4.11  Phễu, đường kính 75 mm.

4.12  Pipet Pasteur.

4.13  Phễu chiết, dung tích 125 ml, có nắp đậy bằng thủy tinh mài.

5  Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này, nên lấy mẫu theo TCVN 6400 (ISO 707)^[1]

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

Mẫu sữa được bảo quản lạnh ở nhiệt độ dưới 10 °C. Nếu mẫu chưa được phân tích ngay thì bảo quản đông lạnh ở - 40 °C trong các ống nghiệm polypropylen (4.5) với các lượng khoảng 50 ml. Trộn nhẹ mẫu sữa trước khi lấy mẫu để phân tích.

6  Cách tiến hành

6.1  Chiết

...

...

...

Dùng pipet 10 ml (4.6) lấy 10 ml phần mẫu thử cho vào phễu chiết 125 ml (4.13) và thêm 50 ml cloroform (3.3.3), lắc mạnh hỗn hợp 1 min. Cẩn thận mở hé nắp. Lắc 1 min, mở hé nắp và để tách pha trong 1 min. Lắc 1 min, mở hé nắp, lắc 1 min. Mở hé nắp và để yên cho tách pha trên 5 min. Tháo lớp cloroform, lọc vào bình quả lê (4.9). Tráng bộ lọc 2 lần, mỗi lần dùng 5 ml cloroform, thu lấy nước tráng rửa vào bình quả lê (4.9).

Cho bay hơi dung dịch cloroform trong bình quả lê vừa đến khô trên bộ cô quay (4.3) ở 32 °C ± 2 °C. Thêm 5 ml hexan (3.3.2) vào bình, đậy nắp và hòa tan phần dư lượng bằng cách khuấy trộn mạnh trên máy vortex (4.4) khoảng 1 min. Bổ sung ngay 1,0 ml dung dịch kali dihydro phosphat (3.2) vào bình, lắc mạnh trên máy vortex (4.4) 3 hoặc 4 lần với các khoảng thời gian 1 min trong ít nhất 15 min. Dùng pipet Pasteur (4.12) để lấy lớp nước ra, chuyển vào ống thủy tinh hoặc lọ bơm tự động để bơm.

6.2  Định lượng

Dùng dung dịch rửa (3.4.2) để tráng bộ bơm mẫu tự động và để làm sạch hệ thống và cột LC. Cho chạy sắc ký ít nhất ở 3 mức dung dịch chuẩn (50, 100 và 200 ng/ml) và sử dụng phân tích hồi quy tuyến tính đường chuẩn để tính các nồng độ. Định lượng các mức của chất phân tích bằng cách đo chiều cao pic, P. Đường chuẩn cần có hệ số tương quan bằng hoặc lớn hơn 0,98 (nếu nhỏ hơn, lặp lại việc bơm các dung dịch chuẩn). Tính nồng độ chất theo hệ số làm giàu 10 lần (10 ml sữa được chiết vào 1 ml dung dịch kali dihydro phosphat cuối cùng) khi tính nồng độ sulfamethazine trong mẫu ban đầu nghĩa là dịch chiết cuối cùng hoặc của chất chuẩn với nồng độ 100 ng/ml tương ứng với nồng độ sulfamethazine 10 ng/ml trong mẫu sữa.

Thời gian lưu của sulfamethazine thay đổi theo thiết bị, cột, nhiệt độ cột và mẻ pha động, nhưng phải nằm trong khoảng 4,5 min đến 6 min. Tuy nhiên, với các biến đổi ổn định thì thời gian lưu vẫn rất ổn định và thay đổi không quá 15 s trong ngày. Các phần mẫu thử với các chất chuẩn dùng để dựng đường chuẩn đồng thời để kiểm tra độ ổn định của thiết bị.

CHÚ THÍCH: Đôi khi trong một số phần mẫu thử sữa, xuất hiện pic rộng được rửa giải sau trong lần chạy tiếp theo. Sử dụng bộ lấy mẫu tự động với 1 min cân bằng, thì pic này sẽ không đồng rửa giải với pic sulfamethazine. Để tránh đồng rửa giải các pic nếu thực hiện các lần bơm thủ công cách nhau ngẫu nhiên thì tăng thời gian chạy vài phút sao cho pic rộng rửa giải trong dung môi trước lần chạy tiếp theo. Pic này không được nhận biết.

6.3  Tính kết quả

Tính hàm lượng sulfamethazine có trong mẫu thử, X, bằng nanogam trên mililit theo công thức sau:

...

...

...

P là chiều cao pic;

b và m là điểm cắt và độ dốc tương ứng, từ phương trình hồi quy tuyến tính.

7  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy chọn và các chi tiết bất thường khác có ảnh hưởng tới kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được.

...

...

...

PHỤ LỤC A

(Tham khảo)

Phép thử liên phòng thử nghiệm

Bảng A.1 đưa ra các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm về chấp nhận phương pháp.

Bảng A.1 - Các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm

Nồng độ mẫu thêm chuẩn

Độ lệch chuẩn lặp lại

Độ lệch chuẩn tái lập

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại

...

...

...

ng/ml

sr

s_R

RSD_r, %

RSD_R, %

10

0,59

1,92

7,16

...

...

...

20

1,18

3,84

6,76

22,05

14,8

0,83

2,74

5,62

...

...

...

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] TCVN 6400 (ISO 707), Sữa và sản phẩm sữa - Hướng dẫn lấy mẫu

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11220:2015 về Sữa bò tươi nguyên liệu - Xác định dư lượng sulfamethazine - Phương pháp sắc kí lỏng