8.5.11. Thực hiện chiết lần hai bằng cách lặp lại các thao tác như mô tả trong 8.5.3 đến hết 8.5.9 nhưng chỉ dùng 15 ml ete dietyl (5.3) và 15 ml dầu nhẹ (5.4); sử dụng ete để tráng phía trong cổ bình chiết.

Nếu cần, nâng cao mặt lớp phân cách đến giữa cổ bình (xem Hình 1) bằng cách nhẹ nhàng cho thêm nước theo thành bình (xem Hình 1) để có thể gạn dung môi càng triệt để càng tốt (xem Hình 2).

8.5.12. Loại bỏ các dung môi (kể cả etanol) càng triệt để càng tốt khỏi bình bằng cách chưng cất hoặc bằng cách làm bay hơi nếu sử dụng cốc có mỏ hoặc đĩa (xem 6.3), tráng thành trong của cổ bình bằng một ít dung môi hỗn hợp (5.5) trước khi bắt đầu chưng cất.

8.5.13. Đun nóng bình thu nhận chất béo (với bình đặt chúng nằm nghiêng để hơi dung môi thoát ra được) trong 1 h để trong tủ sấy (6.4) duy trì ở nhiệt độ 102 °C. Lấy bình thu nhận chất béo ra khỏi tủ sấy đề nguội (không để trong bình hút ẩm nhưng tránh bụi) đến nhiệt độ phòng cân (đối với bình thủy tinh tối thiểu 1 h và đối với đĩa kim loại tối thiểu là 0,5 h) và cân chính xác đến 1 mg, ghi khối lượng đến bốn chữ số thập phân.

Không lau bình thu nhận chất béo ngay trước lúc cân. Dùng kẹp (6.13) để đặt bình lên cân phân tích đặc biệt để tránh thay đổi nhiệt độ.

8.5.14. Lặp lại thao tác như trong 8.5.13 cho đến khi khối lượng của bình thu nhận chất béo giảm dao động trong khoảng 1,0 mg, giữa hai lần cân liên tiếp. Ghi lại khối lượng nhỏ nhất là khối lượng của bình thu nhận chất béo và chất chiết được.

8.5.15. Thêm 25 ml dầu nhẹ vào bình thu nhận chất béo để kiểm tra xác nhận xem chất chiết đã hòa tan hoàn toàn chưa. Làm ấm nhẹ và khuấy dung môi cho đến khi tất cả chất béo đã hòa tan.

Nếu chất chiết hòa tan hoàn toàn trong dầu nhẹ, lấy khối lượng chất béo là chênh lệch giữa khối lượng cuối cùng của bình chứa chất chất chiết (xem 8.5.14) và khối lượng đầu tiên (xem 8.4).

8.5.16. Nếu chất chiết không hòa tan hoàn toàn trong dầu nhẹ hoặc trong trường hợp nghi ngờ và theo mục đích pháp lý hoặc không thống nhất thì chiết hết chất béo từ bình bằng cách rửa nhiều lần với dầu nhẹ ấm.

...

...

...

Cuối cùng, rửa bên ngoài phía trên của bình bằng dung môi hỗn hợp sao cho dung môi không tràn ra phía ngoài của bình. Loại bỏ hơi dầu nhẹ khỏi bình bằng cách gia nhiệt bình trong 1 h trong tủ sấy (6.4), đặt ở 102 °C, để nguội và cân như trong 8.5.13 và 8.5.14.

Khối lượng chất béo là chênh lệch khối lượng được xác định trong 8.5.15 và khối lượng cuối cùng.

9. Tính và biểu thị kết quả

9.1. Hàm lượng chất béo, w_f, biểu thị bằng phần trăm khối lượng, theo công thức (1):

                                   (1)

Trong đó:

m₀

m₁

là khối lượng của phần mẫu thử (8.2), tính.bằng gam (g);

...

...

...

m₂

là khối lượng của bình thu nhận chất béo đã chuẩn bị (8.4), hoặc trong trường hợp chất không hòa tan, là của bình thu nhận chất béo và cặn không hòa tan xác định được trong 8.5.16, tính bằng gam (g);

m₃

là khối lượng của bình thu nhận chất béo sử dụng trong phép thử trắng thuốc thử (8.3) và chất chiết xác định được trong 8.5.14, tính bằng gam (g);

m₄

là khối lượng của bình thu nhận chất béo đã chuẩn bị (xem 8.4) sử dụng trong phép thử trắng thuốc thử (8.3) hoặc trong trường hợp chất không hòa tan, là khối lượng của bình thu nhận chất béo và cặn không tan xác định được trong 8.5.16, tính bằng gam (g).

Báo cáo kết quả chính xác đến 0,01% (khối lượng).

9.2. Hàm lượng chất béo của chất khô, w_d, biểu thị bằng phần trăm khối lượng, theo công thức (2):

...

...

...

Trong đó:

w_f là hàm lượng chất béo của mẫu tính được theo 9.1;

w_w là độ ẩm của mẫu, được xác định theo TCVN 11163 (ISO 5550).

10. Độ chụm

10.1. Phép thử liên phòng thử nghiệm

Các giá trị về độ lặp lại và độ tái lập được biểu thị ở mức 95% và có được từ kết quả phép thử liên phòng được thực hiện theo ISO 5725:19861).

10.2. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm độc lập, riêng rẽ thu được khi sử dụng cùng phương pháp, tiến hành trên vật liệu thử giống hệt nhau, do một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị. trong một khoảng thời gian ngắn, không quá 5% các trường hợp lớn hơn 0,10 %.

10.3. Độ tái lập

...

...

...

11. Chú ý về cách tiến hành

11.1. Phép thử trắng để kiểm tra thuốc thử

Trong phép thử trắng thuốc thử này, bình thu nhận chất béo dùng để kiểm tra khối lượng được sử dụng để đảm bảo các thay đổi trong điều kiện môi trường của phòng cân hoặc ảnh hưởng nhiệt độ của bình thu nhận chất béo không làm ảnh hưởng đến việc xem xét sự có mặt hay không có mặt của chất không bay hơi trong phần chiết của thuốc thử. Bình thu nhận này có thể được sử dụng như là bình đối trọng trong trường hợp cân hai đĩa. Trong trường hợp khác, chênh lệch khối lượng biểu kiến [(m₃ - m₄) trong công thức ở (1)] của bình dùng cho mục đích kiểm chứng phải được xem xét khi kiểm tra khối lượng của bình thu nhận chất béo dùng trong phép thử trắng thuốc thử. Khối lượng biểu kiến của bình thu nhận chất béo, được hiệu chỉnh theo sự thay đổi khối lượng biểu kiến của bình kiểm chứng, không được tăng quá 0,5 mg.

Rất hiếm khi dung môi có chứa chất bay hơi bị giữ lại nhiều trong chất béo. Nếu thấy sự có mặt của các chất như thế, cần tiến hành phép thử trắng thuốc thử đối với tất cả các thuốc thử và từng dung môi thì sử dụng bình thu nhận chất béo với khoảng 1 g butterfat khan mới. Nếu cần, chưng cất lại các dung môi với sự có mặt của 1 g butterfat khan trong 100 ml dung môi. Chỉ sử dụng các dung môi này trong khoảng thời gian ngắn sau khi chưng cất.

11.2. Tiến hành phép thử trắng đồng thời với việc xác định

Giá trị thu được trong phép thử trắng, được tiến hành đồng thời với việc xác định, có thể cho giá trị biểu kiến của các chất chiết được từ phần mẫu thử (m₁ - m₂) để hiệu chỉnh về sự có mặt của chất không bay hơi chiết được từ thuốc thử và cũng như khi có bất kỳ sự thay đổi nào về điều kiện môi trường của phòng cân và chênh lệch nhiệt độ giữa bình thu nhận chất béo và phòng cân của hai lần cân (8.5.14 và 8.4 hoặc 8.5.16).

Trong các điều kiện thích hợp (giá trị thấp trong phép thử trắng đối với thuốc thử, nhiệt độ của phòng cân không đổi, thời gian thích hợp để làm nguội bình thu nhận chất béo) thì giá trị này sẽ luôn luôn nhỏ hơn 0,5 mg và có thể được bỏ qua trong phần tính kết quả trong trường hợp xác định thông thường. Cũng thường gặp các giá trị lớn hơn đến 2,5 mg (dương tính và âm tính). Sau khi hiệu chỉnh các giá trị này, các kết quả sẽ đúng. Khi phải hiệu chính giá trị lớn hơn 2,5 mg thì phải nêu lên trong phần báo cáo thử nghiệm (Điều 12).

Nếu giá trị thu được trong phép thử trắng thường lớn hơn 0,5 mg thì cần kiểm tra lại thuốc thử nếu ngay trước đó chưa kiểm tra. Thuốc thử có lẫn tạp chất hoặc có vết thì cần phải thay mới hoặc tinh sạch lại (xem đoạn hướng dẫn trong Điều 5, cũng như 11.1).

11.3. Phép thử đối với peroxit trong ete dietyI

...

...

...

Có thể sử dụng các phương pháp thử nghiệm thích hợp khác đối với peroxit.

Để đảm bảo ete dietyl (không chứa chất chống oxi hóa) không chứa peroxit, xử lý ete ít nhất là ba ngày trước khi sử dụng.

Cắt lá kẽm thành những dải để ít nhất là chúng chạm được đến nửa chai đựng ete, sử dụng khoảng 80 cm² lá kẽm cho 1 lít ete.

Trước khi sử dụng, nhúng toàn bộ các dải lá kẽm 1 min trong dung dịch chứa 10 g đồng(ll) sulfat ngậm năm phân tử nước (CuSO₄.5H₂O) và 2 ml axit sulfuric đậm đặc [98% (phần khối lượng)] trên một lít. Rửa nhẹ và kỹ các dải kẽm bằng nước, rồi đặt các dải đã mạ đồng còn ướt này vào trong chai đựng ete.

Có thể dùng các phương pháp khác với điều kiện không ảnh hưởng đến kết quả xác định.

11.4. Ete dietyI chứa chất chống oxi hóa

Một số quốc gia dùng ete dietyl chứa khoảng 1 mg chất chống oxi hóa trên kilogam để xác định chất béo. Hàm lượng này không được dùng để làm chuẩn. Ở các quốc gia khác, chỉ sử dụng ete dietyl chứa hàm lượng chất chống oxi hóa cao, ví dụ lớn hơn 7 mg trên kilogam. Chỉ nên sử dụng ete cho phép xác định thông thường với phép thử trắng thuốc thử bắt buộc phải thực hiện đồng thời với phép xác định để hiệu chính sai lỗi hệ thống vì dư lượng chất chống oxi hóa. Đối với mục đích đối chứng, phải chưng cất ete trước khi sử dụng.

12. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải nêu rõ:

...

...

...

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được xem là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được và kết quả cuối cùng thu được, nếu kiểm tra lặp lại.

Phải báo cáo giá trị của phép thử trắng thuốc thử [(m₃ - m₄), xem 9.1] nếu vượt quá 2,5 mg.

PHỤ LỤC A

(tham khảo)

Cách tiến hành khác dùng ống chiết chất béo có xi phông hoặc có nối với chai rửa

...

...

...

Phụ lục này miêu tả phương pháp sử dụng chai chiết chất béo có gắn xi phông hoặc chai rửa (xem Hình A.1).

A.2. Cách tiến hành

A.2.1. Chuẩn bị mẫu thử

Xem 8.1.

A.2.2. Phần mẫu thử

Tiến hành theo 8.2 nhưng dùng các ống chiết chất béo (xem Chú thích trong 6.6) hoặc sử dụng bình cầu hoặc cốc có mỏ 100 ml.

Phần mẫu thử này phải cố gắng chuyển hết vào đáy của ống chiết chất béo, bình cầu hoặc cốc có mỏ.

A.2.3. Phép thử trắng thuốc thử

Xem 8.3 và 11.2.

...

...

...

Xem 8.4.

A.2.5. Phép xác định

A.2.5.1. Thêm 10 ml đến 15 ml axit clohydric (5.1) để rửa phần mẫu thử trên đáy của ống, bình cầu hoặc cốc có mỏ, sau đó trộn.

A.2.5.2. Gia nhiệt bằng cách lắc nhẹ bình trong nồi cách thủy đun sôi hoặc trên ngọn lửa hoặc trên bếp điện cho đến khi tất cả các thành phần hòa tan hết.

CHÚ THÍCH: Các bình chiết chất béo có chân không thích hợp để gia nhiệt trực tiếp trên ngọn lửa hoặc trên bếp điện.

A.2.5.3. Để bình yên 20 min đến 60 min trong nồi cách thủy đun sôi, thỉnh thoảng lắc trong 15 min đầu hoặc giữ bình sôi nhẹ trên ngọn lửa hoặc trên bếp điện 10 min. Làm nguội, ví dụ dưới dòng nước chảy.

Ở giai đoạn sau của quy trình, nếu gặp khó khăn do các pha chất lòng nhớt, lặp lại phép xác định với phần mẫu thử nhỏ hơn và thời gian đun sôi hoặc gia nhiệt dài hơn.

A.2.5.4. Nếu quá trình phân hủy thực hiện trong ống chiết thì thêm 10 ml etanol (5.2) và nhẹ nhàng trộn kỹ hỗn hợp trên đáy của ống chiết chất béo. Thêm 2 giọt dung dịch đỏ Congo (5.6), nếu cần.

Nếu quá trình phân hủy thực hiện trong bình không phải ống chiết thì rót lượng chứa trong bình sang ống chiết. Rửa lần lượt với 10 ml etanol (5.2), 25 ml ete dietyl (5.3) và 25 ml dầu nhẹ (5.4), mỗi lần rót dung môi vào ống chiết. Trộn đều sau khi thêm etanol như mô tả ở trên và lắc ống chiết sau khi thêm ete dietyl và dầu nhẹ, như mô tả trong A.2.5.5 và A.2.5.6, tương ứng.

...

...

...

A.2.5.6. Thêm 25 ml dầu nhẹ (5.4), đậy ống bằng nút bần đã bão hòa nước hoặc nắp đã bão hòa nước khác (bằng cách ngâm trong nước) và lắc ống nhẹ 30 s như mô tả trong A.2.5.5.

A.2.5.7. Ly tâm ống đã đậy nắp trong 1 min đến 5 min ở gia tốc hướng tâm 500 r/min đến 600 r/min (xem 6.2). Nếu không có máy ly tâm (6.2) thì đặt ống nghiệm trên giá đỡ (6.7) ít nhất 30 min cho đến khi thấy có lớp nổi lên bề mặt rõ rệt và phân biệt rõ với lớp nước. Nếu cần, làm mát ống nghiệm dưới dòng nước chảy.

A.2.5.8. Cẩn thận tháo bỏ nút hoặc nắp, tráng nút và phía trong cổ ống chiết chất béo bằng một ít dung môi hỗn hợp (5.5) sao cho dịch rửa chảy vào ống nghiệm.

A.2.5.9. Lắp ống xi phông hoặc nối với chai rửa vào ống chiết chất béo và đẩy ống nối bên trong cho đến khoảng 4 mm cao hơn mặt tiếp xúc giữa các lớp. Ống nối phía bên trong phải song song với trục của ống chiết chất béo.

Cẩn thận gạn càng triệt để càng tốt lớp nổi trên bề mặt của ống chiết chất béo vào bình thu nhận chất béo (xem 8.4) có chứa một vài hạt trợ sôi (6.10) trong trường hợp đối với bình (tùy ý với đĩa metan). không để lớp nước lẫn vào. Tráng phía ngoài ống nối bằng một ít dung môi hỗn hợp, thu lấy dịch rửa vào bình thu nhận chất béo.

A.2.5.10. Tháo ống nối ra khỏi cổ của ống chiết chất béo, nâng nhẹ ống nối và tráng phần thấp hơn của ống nối bên trong bằng một ít dung môi hỗn hợp. Hạ thấp và chèn lại ống nối và chuyển dịch rửa vào bình thu nhận chất béo.

Tráng rửa lại ống nối bằng một ít dung môi hỗn hợp, cho dịch rửa vào bình thu nhận chất béo.

Tốt nhất là loại bỏ dung môi hoặc một phần dung môi ra khỏi bình thu nhận chất béo bằng cách chưng cất hoặc làm bay hơi như trong 8.5.12.

A.2.5.11. Thực hiện chiết lần hai bằng cách lặp lại các thao tác như trong A.2.5.5 đến hết A.2.5.9. nhưng chỉ sử dụng 15 ml ete dietyl (5.3) và 15 ml dầu nhẹ (5.4). Dùng ete để tráng thành trong của ống nối, trong suốt quá trình tháo ống nối ra khỏi ống chiết chất béo sau lần chiết lần trước.

...

...

...

Kích thước tính bằng milimét

CHÚ DẪN

^a Dung dịch khi tháo ống nối (105 ml ± 5 ml).

^b Độ dày của thành 1,5 mm ± 0,5 mm.

Hình A.1 - Các ví dụ về ống chiết chất béo

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] TCVN 6400 (ISO 707), Sữa và sản phẩm sữa - Hướng dẫn lấy mẫu2)

...

...

...

[3] TCVN 6910-2:2001 (ISO 5725-2:1994), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 2: Phương pháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp đo tiêu chuẩn

1) ISO 5725:1986 Precision of test methods - Determinaion of repeatability and reproducibility for a Standard test method by inter-laboratory tests được sử dụng để tính dữ liệu về độ chụm.

2) Tương ứng với IDF 50.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11157:2015 (ISO 5543:2004) về Casein và caseinat - Xác định hàm lượng chất béo - Phương pháp khối lượng (Phương pháp chuẩn)