8.6  Thử nghiệm khuẩn lạc Salmonella không điển hình

Thực hiện các phép thử sinh hóa bổ sung sau đây trên các chủng cấy không cho các phản ứng Salmonella điển hình đối với phép thử số 1 đến 11 trong Bảng 2, và cũng không được phân loại là Salmonella (xem Bảng 3).

a) Canh thang phenol đỏ lactose hoặc canh thang đỏ tía lactose

1) Cấy vào canh thang phenol đỏ lactose (4.20) hoặc canh thang đỏ tía lactose (4.21) một lượng nhỏ vi khuẩn phát triển trên mặt nghiêng của thạch TSI từ 14 h đến 48 h. Ủ 48 h ± 2 h ở 35 °C trong tủ ấm (5.10), kiểm tra sau mỗi 24 h. Dương tính: sinh axit (màu vàng) và sinh khí trong ống Durham. Nếu chỉ sinh axit cũng được coi là phản ứng dương tính. Hầu hết các chủng cấy Salmonella cho kết quả âm tính, được chỉ thị bởi việc không sinh khí trong ống Durham và đổi màu môi trường thành màu đỏ (chất chỉ thị phenol đỏ) hoặc màu đỏ tía (chất chỉ thị bromcresol đỏ tía).

2) Loại bỏ các chủng cấy không phải Salmonella (dương tính với các phép thử lactose), ngoại trừ các chủng cấy sinh axit trên mặt nghiêng của TSI và có phản ứng dương tính trong LIA hoặc các chủng cấy cho các phản ứng dương tính với canh thang malonat. Thực hiện các phép thử tiếp theo trên các chủng cấy để xác định có phải là S. arizonae.

b) Canh thang phenol đỏ sacarose (4.20) hoặc canh thang đỏ tía sacarose (4.21)

Thực hiện quy trình như mô tả ở trên. Loại bỏ các chủng cấy không phải Salmonella (dương tính với sacarose), trừ các chủng sinh axit trên bề mặt nghiêng của TSI và cho phản ứng dương tính trên LIA.

c) Canh thang MR-VP

Cấy vào môi trường MR-VP (4.12) một lượng nhỏ vi sinh vật phát triển trên mặt nghiêng của TSI chưa được xác định, nghi ngờ có Salmonella. Ủ 48 h ± 2 h ở 35 °C trong tủ ấm (5.10).

...

...

...

2) Thực hiện phép thử metyl đỏ như sau: cho 5 ml canh thang 96 h MR-VP, thêm 5 đến 6 giọt chất chỉ thị metyl đỏ (4.31). Đọc kết quả ngay. Hầu hết chủng cấy Salmonella cho kết quả dương tính, cho thấy bởi màu đỏ phai trong môi trường. Phản ứng âm tính có màu vàng đặc trưng. Loại bỏ các chủng cấy không phải Salmonella (có các phản ứng KCN và VP dương tính và phản ứng metyl đỏ âm tính).

Bảng 3 - Các tiêu chí để loại bỏ các chủng cấy không phải Salmonella

Phép thử hoặc cơ chất

Kết quả

1. Urease

dương tính (màu đỏ tía)

2. Phép thử indol và phép thử ngưng kết (H) đa giá hoặc phép thử ngưng kết Spicer-Edwards

dương tính (màu tím trên bề mặt)
âm tính (không ngưng kết)

3. Canh thang lysin decarboxylase KCN

...

...

...

4. Canh thang phenol đỏ lactose

dương tính (màu vàng và/hoặc sinh khí) ^a,b

5. Canh thang phenol đỏ sacarose

dương tính (màu vàng và/hoặc sinh khí)^b

6. Canh thang KCN, phép thử Voges-Proskauer, phép thử metyl đỏ

dương tính (Vi sinh vật phát triển)
dương tính (màu hồng đến đỏ)
âm tính (màu vàng phai)

^a Thử tiếp các chủng cấy dương tính với canh thang malonat để xác định có phải là Salmonella arizonae.

^b Không bỏ các chủng cấy canh thang dương tính nếu các chủng cấy LIA tương ứng cho các phản ứng Salmonella điển hình; thử tiếp để xác định có phải là các loài Salmonella

d) Thạch xitrat Simmons

...

...

...

Dương tính: có vi sinh vật phát triển, thường kèm theo sự thay đổi từ màu xanh lá sang màu xanh lam. Hầu hết chủng cấy Salmonella dương tính xitrat.

Âm tính: không có vi sinh vật phát triển hoặc có rất ít vi sinh vật phát triển nhưng không đổi màu.

8.7  Phương pháp thay thế xác định Salmonella

Phương pháp thay thế cho cách thử các phản ứng sinh hóa thông thường, dùng một trong năm kit sinh hóa thương mại (API 20E, Enterotube II, Enterobacteriaceae II, MICRO-ID hoặc Vitek GNI) để nhận diện Salmonella giả định. Lựa chọn kit thương mại phù hợp với các tính chất sinh hóa trong phần nhận diện.

Các kit sinh hóa thương mại không được sử dụng để thay thế các phép thử huyết thanh.

Lắp ráp các bộ phận của thiết bị và chuẩn bị thuốc thử cần cho bộ kít. Cấy từng đơn vị theo AOAC 978.24 (API 20E, Enterotube II, Enterobacteriaceae II), AOAC 989.12 (MICRO-ID), AOAC 991.13 (Vitek GNI), ủ trong thời gian và nhiệt độ quy định. Bổ sung thuốc thử, quan sát và ghi kết quả. Đối với việc nhận diện vi sinh vật giả định, phân loại chủng cấy, thực hiện theo AOAC là Salmonella hoặc không phải Salmonella.

Đối với việc khẳng định các chủng cấy giả định được nhận diện là Salmonella, thực hiện phép thử ngưng kết kháng huyết thanh thân (O) Salmonella (8.5.6) và phép thử ngưng kết kháng huyết thanh lông (H) Salmonella (8.5.3) hoặc phép thử ngưng kết (H) Spicer-Edwards (8.5.4) để phân loại chủng cấy theo hướng dẫn sau:

a) Báo cáo các chủng cấy là Salmonella được khẳng định từ Salmonella giả định bằng các kit sinh hóa thương mại nếu chủng cấy dương tính với phép thử ngưng kết kháng huyết thanh (O) Salmonella và phép thử (H) Salmonella.

b) Loại bỏ các chủng cấy giả định không phải là Salmonella bằng các kit sinh hóa thương mại nếu chủng cấy phù hợp với các tiêu chí AOAC về chủng cấy không phải Salmonella.

...

...

...

8.8  Xử lý các chủng cấy âm tính với phép thử ngưng kết kháng huyết thanh lông (H)

Nếu chủng cấy có các tính chất sinh hóa phù hợp với Salmonella nhưng cho kết quả ngưng kết với kháng huyết thanh (H) âm tính (xem 8.5.3) có thể là do các chủng này không di động hoặc các kháng nguyên lông phát triển không trọn vẹn. Tiến hành kiểm tra như sau: Đổ môi trường thử tính di động (4.18) vào đĩa Petri (5.16). Dùng que cấy lấy một lượng nhỏ vi khuẩn phát triển trên mặt nghiêng thạch TSI cấy đâm sâu lên đĩa môi trường, cách cạnh đĩa khoảng 10 mm, sâu từ 2 mm đến 3 mm. Không cấy chạm đến đáy đĩa hoặc ở vị trí khác. Ủ 24 h ở 35 °C trong tủ ấm (5.10).

Nếu thấy vi khuẩn di chuyển 40 mm hoặc lớn hơn thì thử nghiệm lại như sau: Chuyển một vòng cấy vi khuẩn đã di chuyển xa nhất vào canh thang trypticase đậu tương-tryptose (4.11). Lặp lại phép thử ngưng kết (H) đa giá hoặc phép thử huyết thanh Spicer-Edwards. Nếu các chủng cấy không di động sau 24 h đầu thì ủ thêm 24 h ở 35 °C trong tủ ấm (5.10); Nếu vẫn không di động thì ủ tiếp 5 ngày ở 25 °C. Kết luận chủng cấy không di động nếu các phép thử trên vẫn cho kết quả âm tính.

9  Biểu thị kết quả

Theo các kết quả diễn giải (xem 8.6, 8.7 hoặc 8.8), chỉ rõ sự có mặt hay không có mặt của Salmonella trong 25 g phần mẫu thử.

10  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải chỉ rõ:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

...

...

...

d) mọi chi tiết thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này hoặc những điều được coi là tùy chọn cũng như các sự cố bất kỳ có thể ảnh hưởng đến kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được.

Phụ lục A

(Quy định)

Thành phần và chuẩn bị môi trường cấy và thuốc thử

A.1  Canh thang lactose

A.1.1  Thành phần

Chất chiết thịt bò

...

...

...

Pepton

5 g

Lactose

5 g

Nước cất

1 lít

A.1.2  Chuẩn bị

Phân phối các phần 225 ml vào các bình nón 500 ml. Sau khi hấp áp lực ở 121 °C trong 15 min và ngay trước khi sử dụng, chỉnh vô trùng đến thể tích 225 ml. pH cuối cùng đạt 6,9 ± 0,2.

A.2  Canh thang selenit cystin

...

...

...

A.2.1.1  Thành phần

Tryptone hoặc polypepton

5 g

Lactose

4 g

Natri hydro selenit (NaHSeO₃)

4 g

Natri hydro phosphat (Na₂HPO₄)

10 g

...

...

...

0,01 g

Nước cất

1 lít

A.2.1.2  Chuẩn bị

Đun đến sôi để hòa tan. Phân phối các phần 10 ml vào các ống nghiệm 16 mm x 150 mm vô trùng. Đun 10 min trong hơi nước (flowing steam). Không hấp áp lực. pH cuối cùng đạt 7,0 ± 0,2. Không khử trùng môi trường này. Sử dụng trong ngày chuẩn bị.

A.2.2  Môi trường 2 (North-Bartram điều chỉnh)

A.2.2.1  Thành phần

Polypepton

5 g

...

...

...

4 g

Natri hydro selenit (NaHSeO₃)

4 g

Natri hydro phosphat (Na₂HPO₄)

5,5 g

Kali dihydro phosphat (KH₂PO₄)

4,5 g

L-Cystin

0,01 g

...

...

...

1 lít

A.2.2.2  Chuẩn bị

Gia nhiệt có khuấy để hòa tan. Phân phối các phần 10 ml vào các ống nghiệm 16 mm x 150 mm vô trùng. Gia nhiệt 10 min trong hơi nước. Không khử trùng môi trường này. Sử dụng trong ngày chuẩn bị.

A.3  Canh thang tetrathionat

A.3.1  Thành phần

Polypepton

5 g

Các muối mật

1 g

...

...

...

10 g

Natri thiosulfat ngậm năm phân tử nước

30 g

Nước cất

1 lít

A.3.2  Chuẩn bị

Tạo huyền phù các thành phần trong 1 lít nước cất, trộn và đun sôi (phần kết tủa sẽ không tan hoàn toàn). Không hấp áp lực. Để nguội đến dưới 45 °C. Bảo quản ở nhiệt độ từ 5 °C đến 8 °C. pH cuối cùng đạt 8,4 ± 0,2.

A.4  Môi trường Rappaport-Vassiliadis

A.4.1  Thành phần

...

...

...

Tryptone

5 g

Natri clorua (NaCI)

8 g

Kali dihydro phosphat (KH₂PO₄)

1,6 g

Nước cất

1 lít

b) Dung dịch magie clorua:

...

...

...

400 g

Nước cất

1 lít

c) Dung dịch malachite green oxalat:

Malachite green oxalat

0,4 g

Nước cất

100 ml

A.4.2  Chuẩn bị

...

...

...

Môi trường này phải chuẩn bị từ các thành phần riêng lẻ. Không nên sử dụng môi trường khô bán sẵn. Người sử dụng môi trường này cần nhận thức rõ công thức và nhiệt độ ủ môi trường này khác với hướng dẫn của tiêu chuẩn này.

A.5  Thạch xylose lysin desoxycholat (XLD)

A.5.1  Thành phần

Chất chiết nấm men

3 g

Sắt (III) amoni xitrat

0,8 g

L-lysin

5 g

...

...

...

6,8 g

Xylose

3,75 g

Natri clorua (NaCI)

5 g

Lactose

7,5 g

Thạch

15 g

...

...

...

7,5 g

Phenol đỏ

0,08 g

Natri desoxycholat

2,5 g

Nước cất

1 lít

A.5.2  Chuẩn bị

Gia nhiệt có khuấy ngay đến khi sôi ở mức độ trung bình. Không để quá nhiệt. Rót vào các đĩa khi môi trường nguội đến 50 °C. Để khô trong khoảng 2 h, mở hé nắp. Sau đó đậy nắp. pH cuối cùng 7,4 ± 0,2. Không bảo quản quá 1 ngày.

...

...

...

A.6.1  Thành phần

Pepton

12 g

Natri thiosulfat

5 g

Chất chiết nấm men

3 g

Sắt (III) amoni xitrat

1,5 g

...

...

...

9 g

Bromthymol xanh

0,064 g

Lactose

12 g

Fuchsin axit

0,1 g

Sacarose

12 g

...

...

...

13,5 g

Salicin

2 g

Nước cất

1 lít

Natri clorua (NaCI)

5 g

A.6.2  Chuẩn bị

Đun đến sôi, khuấy liên tục để hòa tan. Để sôi không quá 1 min. Không để quá nhiệt. Để nguội trong nồi cách thủy. Rót các phần 20 ml vào các đĩa Petri 15 mm x 100 mm vô trùng. Để khô trong khoảng 2h, mở hé nắp. pH cuối cùng 7,6 ± 0,2. Không bảo quản quá 1 ngày.

...

...

...

A.7.1  Thành phần

Polypepton (hoặc pepton)

10 g

Chất chiết thịt bò

5 g

Dextrose

5 g

Natri hydro phosphat (Na₂HPO₄) (dạng khan)

4 g

...

...

...

0,3 g

Bismuth sulfit (chất chỉ thị)

8 g

Brilliant green

0,025 g

Thạch

20 g

Nước cất

1 lít

...

...

...

Trộn kỹ và đun có khuấy. Để sôi khoảng 1 min đến khi thu được huyền phù đồng nhất (nếu kết lắng sẽ không hòa tan). Để nguội đến nhiệt độ từ 45 °C đến 50 °C. Tạo huyền phù phần kết lắng bằng cách khuấy nhẹ và rót các phần 20 ml vào các đĩa Petri 15 mm x 100 mm vô trùng. Để các đĩa khô trong khoảng 2 min, có mở hé nắp, sau đó đậy các đĩa. pH cuối cùng đạt 7,7 ± 0,2. Không hấp áp lực. Chuẩn bị các đĩa một ngày trước khi cấy ria và bảo quản trong tối. Độ chọn lọc giảm trong 48 h. Bảo quản các đĩa nơi tối.

A.8  Thạch sắt ba đường (TSI)

A.8.1  Môi trường

Môi trường 1

Polypepton

20 g

Natri clorua (NaCI)

5 g

...

...

...

10 g

Sacarose

10 g

Glucose

1 g

Fe(NH₄)₂(SO₄)·6H₂O

0,2 g

Na₂S₂O₃

0,2 g

...

...

...

0,025 g

Thạch

13 g

Nước cất

1 lít

Môi trường 2

Chất chiết thịt bò

3 g

...

...

...

3 g

Pepton

15 g

Proteose pepton

5 g

Glucose

1 g

Lactose

10 g

...

...

...

10 g

Sắt (II) sulfat (FeSO₄)

0,2 g

Natri clorua (NaCI)

5 g

Na₂S₂O₃

0,3 g

Phenol đỏ

0,024 g

...

...

...

12 g

Nước cất

1 lít

Hai môi trường này nói chung có thể thay thế nhau.

A.8.2  Chuẩn bị

Tạo huyền phù các thành phần của Môi trường 1 trong nước cất, trộn kỹ và gia nhiệt, thỉnh thoảng có khuấy. Để sôi khoảng 1 min cho hòa tan các thành phần. Cho vào 1/3 các ống 16 mm x 150 mm và đậy nắp hoặc nút lại để duy trì các điều kiện hiếu khí. Hấp áp lực Môi trường 1 trong 15 min ở 118 °C. Chuẩn bị Môi trường 2 như đối với Môi trường 1, nhưng không hấp áp lực 15 min ở 121 °C. Trước khi môi trường đông đặc, nghiêng các ống để có các bề mặt nghiêng từ 4 cm đến 5 cm và độ sâu từ 2 cm đến 3 cm. pH cuối cùng đạt 7,3 ± 0,2 đối với Môi trường 1 và 7,4 ± 0.2 đối với Môi trường 2.

A.9  Thạch sắt lysin (Edwards and Fife)

A.9.1  Thành phần

Gelysate hoặc pepton

...

...

...

Chất chiết nấm men

3 g

Dextrose

1 g

L-Lysin hydroclorua

10 g

Sắt (III) amoni xitrat

0,5 g

Natri thiosulfat (dạng khan)

...

...

...

Bromcresol tía

0,02 g

Thạch

15 g

Nước cất

1 lít

A.9.2  Chuẩn bị

Gia nhiệt để hòa tan các thành phần. Phân phối các phần 4 ml vào các ống nắp xoáy 13 mm x 100 mm. Hấp áp lực 12 min ở 121 °C. Để cho đông đặc ở vị trí nghiêng để tạo thành các đáy 4 cm và bề mặt nghiêng 2,5 cm. pH cuối cùng đạt 6,7 ± 0,2.

A.10  Canh thang trypton (tryptophan), 1 %

...

...

...

Tryptone hoặc trypticase

10 g

Nước cất

1 lít

A.10.2  Chuẩn bị

Phân phối các phần 5 ml vào các ống nghiệm 16 mm x 125 mm hoặc 16 mm x 150 mm. Hấp áp lực 15 min ở 121 °C. pH cuối cùng đạt 6,9 ± 0,2.

A.11  Canh thang trypticase đậu tương-tryptose

A.11.1  Thành phần

Canh thang trypticase đậu tương (loại khô, bán sẵn)

...

...

...

Canh thang tryptose (loại khô, bán sẵn)

13,5 g

Chất chiết nấm men

3 g

Nước cất

1 lít

A.11.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong 1 lít nước. Đun nhẹ để hòa tan. Phân phối các phần 5 ml vào các ống nghiệm 16 mm x 150 mm. Hấp áp lực 15 min ở 121 °C. pH cuối cùng đạt 7,2 ± 0,2.

A.12  Canh thang MR-VP

...

...

...

A.12.1.1  Thành phần

Bột nước đệm pepton

7 g

Glucose

5 g

Kali hydro phosphat (K₂HPO₄)

5 g

Nước cất

1 lít

...

...

...

Hòa tan các thành phần trong 800 ml nước có đun nhẹ. Lọc và để nguội đến 20 °C và pha loãng đến 1 lít. Hấp áp lực từ 12 min đến 15 min ở 121 °C. pH cuối cùng đạt 6,9 ± 0,2.

A.12.2  Môi trường 2

A.12.2.1  Thành phần

Pepton casein

3,5 g

Pepton thịt

3,5 g

Dextrose

5 g

...

...

...

5 g

Nước cất

1 lít

A.12.2.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong nước có đun nhẹ nếu cần. Phân phối 10 ml vào các ống nghiệm 16 mm x 150 mm và hấp áp lực 15 min ở nhiệt độ từ 118 °C đến 121 °C. pH cuối cùng đạt 6,9 ± 0,2.

A.12.3  Môi trường 3

A.12.3.1  Thành phần

Pepton

5 g

...

...

...

5 g

Đệm phosphat

5 g

Nước cất

1 lít

A.12.3.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong nước. Phân phối 10 ml vào các ống nghiệm 16 mm x 150 mm và hấp áp lực 12 min đến 15 min ở 121 °C. pH cuối cùng đạt 7,5 ± 0,2.

A.13  Thạch xitrat Simmons

A.13.1  Thành phần

...

...

...

2g

Natri clorua (NaCI)

5 g

Kali hydro phosphat (K₂HPO₄)

1 g

Amoni dihydro phosphat (NH₄H₂PO₄)

1 g

Magie sulfat (MgSO₄)

0,2 g

...

...

...

0,08 g

Thạch

15 g

Nước cất

1 lít

A.13.2  Chuẩn bị

Đun nhẹ, thỉnh thoảng khuấy. Để sôi từ 1 min đến 2 min đến khi thạch hòa tan. Cho vào các ống nắp xoáy 13 mm x 100 mm hoặc 16 mm x 150 mm đến 1/3 ống. Hấp áp lực 15 min ở 121 °C. Trước khi môi trường đông đặc, nghiêng các ống để có các bề mặt nghiêng từ 4 cm đến 5 cm và độ sâu từ 2 cm đến 3 cm. pH cuối cùng đạt 6,8 ± 0,2.

A.14  Canh thang ure

A.14.1  Thành phần

...

...

...

20 g

Chất chiết nấm men

0,1 g

Kali hydro phosphat (K₂HPO₄)

9,1 g

Natri hydro phosphat (Na₂HPO₄)

9,5 g

Phenol đỏ

0,01 g

...

...

...

1 lít

A.14.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong nước cất. Không gia nhiệt. Khử trùng bằng cách lọc qua màng 0,45 µm. Phân phối vô trùng các phần từ 1,5 ml đến 3,0 ml vào các ống nghiệm 13 mm x 100 mm vô trùng. pH cuối cùng đạt 6,8 ± 0,2.

A.15  Canh thang ure (chuẩn bị nhanh)

A.15.1  Thành phần

Ure

20 g

Chất chiết nấm men

0,1 g

...

...

...

0,091 g

Natri hydro phosphat (Na₂HPO₄)

0,095 g

Phenol đỏ

0,01 g

Nước cất

1 lít

A.15.2  Chuẩn bị

Chuẩn bị như Canh thang ure (A.14).

...

...

...

A.16.1  Thành phần

Chất chiết nấm men

1 g

Amoni sulfat [(NH₄)₂SO₄]

2 g

Kali hydro phosphat (K₂HPO₄)

0,6 g

Kali dihydro phosphat (KH₂PO₄)

0,4 g

...

...

...

2 g

Natri malonat

3 g

Dextrose

0,25 g

Bromthymol xanh

0,025 g

Nước cất

1 lít

...

...

...

Đun để hòa tan, nếu cần. Phân phối các phần 3 ml vào các ống nghiệm 13 mm x 100 mm. Hấp áp lực 15 min ở 121 °C. pH cuối cùng đạt 6,7 ± 0,2.

A.17  Canh thang lysin decarboxylase (Falkow)

A.17.1  Thành phần

Gelysate hoặc pepton

5 g

Chất chiết nấm men

3 g

Glucose

1 g

...

...

...

5 g

Bromcresol tía

0,02 g

Nước cất

1 lít

A.17.2  Chuẩn bị

Đun đến khi hòa tan. Phân phối các phần 5 ml và các ống nắp vặn 16 mm x 125 mm. Hấp áp lực các ống đã vặn lỏng nắp trong 15 min ở 121 °C. Vặn nắp kín khi bảo quản và sau mỗi lần cấy. pH cuối cùng đạt 6,8 ± 0,2.

A.18  Môi trường thử nghiệm tính di động (bán đặc)

A.18.1  Thành phần

...

...

...

3 g

Pepton hoặc gelysate

10 g

Natri clorua (NaCI)

5 g

Thạch

4 g

Nước cất

1 lít

...

...

...

Gia nhiệt đồng thời khuấy và đun sôi 1-2 min để hòa tan thạch. Phân phối các phần 20 ml vào các ống nắp xoáy 20 mm x 150 mm, thay bằng nắp lỏng. Hấp áp lực 15 min ở 121 °C. Để nguội đến 45 °C sau khi hấp áp lực. Vặn chặt nắp và bảo quản lạnh ở nhiệt độ từ 5 °C đến 8°C. Để sử dụng, làm tan chảy trong nước sôi hoặc dòng hơi nước rồi để nguội đến 45 °C. Phân phối vô trùng các phần 20 ml vào các đĩa Petri 15 mm x 100 mm vô trùng. Đậy các đĩa và để cho đông đặc. Sử dụng trong ngày chuẩn bị. pH cuối cùng đạt 7,4 ± 0,2.

A.19  Canh thang kali xyanua (KCN)

A.19.1  Thành phần

Kali xyanua

0,075 g

Proteose pepton No. 3 hoặc polypepton

3 g

Natri clorua (NaCI)

5 g

...

...

...

0,225 g

Natri hydro phosphat (Na₂HPO₄)

5,64 g

Nước cất

1 lít

A.19.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên, ngoại trừ kali xyanua và hấp áp lực 15 min ở 121 °C. Để nguội rồi làm lạnh đến nhiệt độ từ 5 °C đến 8 °C. pH cuối cùng đạt 7,6 ± 0,2. Chuẩn bị dung dịch gốc kali xyanua bằng cách hòa tan 0,5 g kali xyanua trong 100 ml nước cất vô trùng đã làm lạnh đến nhiệt độ từ 5 °C đến 8 °C. Dùng pipet bầu, thêm 15 ml dung dịch gốc kali xyanua vào 1 lít base lạnh vô trùng. Không hút pipet bằng miệng. Sử dụng găng tay.

Trộn và phân phối vô trùng các phần từ 1,0 ml đến 1,5 ml vào các ống 13 mm x 100 mm vô trùng. Dùng kỹ thuật vô trùng, nút các ống bằng nút bần No. 2 có tẩm parafin. Chuẩn bị nút bần bằng cách đun sôi trong parafin khoảng 5 min. Nút các ống bằng nút bần sao cho parafin không chảy vào canh thang mà tạo thành lớp xi giữa miệng ống và nút bần. Bảo quản ống ở nhiệt độ từ 5 °C đến 8 °C không quá 2 tuần trước khi sử dụng.

A.20  Canh thang cacbohydrat phenol đỏ

...

...

...

Trypticase hoặc proteose pepton No. 3

10 g

Natri clorua (NaCI)

5 g

Chất chiết thịt bò (tùy chọn)

1 g

Phenol đỏ (7,2 ml dung dịch phenol đỏ 0,25 %)

0,018 g

Nước cất

...

...

...

Cacbohydrat, sử dụng một trong ba loại đường sau:

Dulcitol

5 g

Lactose

10 g

Sacarose

10 g

A.20.2  Chuẩn bị

Hòa tan cacbohydrat vào canh thang cơ bản này. Phân phối các phần 2,5 ml vào các ống nghiệm 13 mm x 100 mm chứa các ống Durham. Hấp áp lực 10 min ở 118 °C. pH cuối cùng đạt 7,4 ± 0,2. Cách khác, hòa tan các thành phần, ngoại trừ cacbohydrat, trong 800 ml nước cất có đun và thỉnh thoảng khuấy. Phân phối các phần 2,0 ml vào các ống nghiệm 13 mm x 100 mm chứa các ống lên men đã úp ngược. Hấp áp lực 15 min ở 118 °C và để nguội. Hòa tan cacbohydrat trong 200 ml nước cất và khử trùng bằng cách cho dung dịch qua bộ lọc vi khuẩn. Thêm vô trùng 0,5 ml dịch lọc vào mỗi ống canh thang đã khử trùng sau khi làm nguội đến 45 °C. Lắc nhẹ để trộn. pH cuối cùng đạt 7,4 ± 0,2.

...

...

...

A.21.1  Thành phần

Proteose pepton No. 3

10 g

Chất chiết thịt bò (tùy chọn)

1 g

Natri clorua (NaCI)

5 g

Bromcresol tía

0,02 g

...

...

...

1 lít

A.21.2  Chuẩn bị

Chuẩn bị như đối với canh thang phenol đỏ cacbohydrat (A.20). pH cuối cùng đạt 6,8 ± 0,2.

A.22  Thạch MacConkey

A.22.1  Thành phần

Proteose pepton hoặc polypepton

3 g

Pepton hoặc gelysate

17 g

...

...

...

10 g

Các muối mật No. 3 (hoặc hỗn hợp các muối mật):

1,5 g

Natri clorua (NaCI)

5 g

Đỏ trung tính

0,03 g

Tím tinh thể

0,001 g

...

...

...

13,5 g

Nước cất

1 lít

A.22.2  Chuẩn bị

Tạo huyền phù các thành phần và đun có khuấy để hòa tan. Để sôi trong từ 1 min đến 2 min. Hấp áp lực 15 min ở 121 °C, để nguội đến nhiệt độ từ 45°C đến 50 °C, và rót các phần 20 ml vào các đĩa Petri 15 mm x 100 mm vô trùng. Để khô ở nhiệt độ phòng, có đậy nắp. Không dùng các đĩa ẩm. pH cuối cùng đạt 7,1 ± 0,2.

A.23  Canh thang và thạch dịch tim não (BHI)

A.23.1  Môi trường 1

A.23.1.1  Thành phần

Dịch não bê

...

...

...

Dịch tim bò

250 g

Proteose pepton hoặc gelysate

10 g

Natri clorua (NaCI)

5 g

Na₂HPO₄·12H₂O

2,5 g

Dextrose

...

...

...

Nước cất

1 lít

A.23.1.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong nước cất, có đun nhẹ. Phân phối canh thang vào các chai hoặc các ống nghiệm để bảo. Hấp áp lực 15 min ở 121 °C. pH cuối cùng đạt 7,4 ± 0,2.

A.23.2  Môi trường 2

A.23.2.1  Thành phần

Bột tim não

6 g

Pepton thịt

...

...

...

Natri clorua (NaCI)

5 g

Dextrose

3 g

Pepton gelatin

14,5 g

Natri hydro phosphat (Na₂HPO₄)

2,5 g

Nước cất

...

...

...

A.23.2.2  Chuẩn bị

Tạo huyền phù các thành phần Môi trường 2 trong nước cất và đun trong 1 min để hòa tan hoàn toàn.

Đối với cả Môi trường 1 và Môi trường 2, phân phối canh thang vào cả hai và ống nghiệm để bảo quản. Hấp áp lực 15 min ở 121 °C. pH cuối cùng đạt 7,4 ± 0,2. Có thể dùng BHI có bán sẵn.

Để chuẩn bị thạch tim não, thêm 15 g thạch vào 1 lít canh thang BHI. Đun để hòa tan thạch trước khi phân phối vào các chai hoặc các bình nón. Hấp áp lực 15 min ở 121 °C.

A.24  Thạch máu tryptose cơ bản

A.24.1  Thành phần

Tryptose

10 g

Chất chiết thịt bò

...

...

...

Natri clorua (NaCI)

5 g

Thạch

15 g

Nước cất

1 lít

A.24.2  Chuẩn bị

Tạo huyền phù các thành phần trong nước cất, trộn kỹ và gia nhiệt, thỉnh thoảng khuấy. Để sôi khoảng 1 min. Cho vào các ống 16 mm x 150 mm đến 1/3 ống và đậy nắp hoặc vặn nút để duy trì các điều kiện hiếu khí. Hấp áp lực 15 min ở 121 °C. Trước khi môi trường đông đặc, nghiêng các ống để có các bề mặt nghiêng từ 4 cm đến 5 cm và độ sâu từ 2 cm đến 3 cm.

A.25  Dung dịch papain, 5 % (khối lượng/thể tích)

...

...

...

Papain

50 g

Nước cất

1 lít

A.25.2  Chuẩn bị

Thêm papain vào nước cất vô trùng và xoay bình để hòa tan hoàn toàn. Phân phối các phần 100 ml vào các chai.

A.26  Thuốc thử Kovacs

A.26.1  Thành phần

p-Dimethylaminobenzaldehyde

...

...

...

2-Metylbutan-2-ol (amyl alcohol)

75 ml

Axit clohydric (HCI) đặc

25 ml

A.26.2  Chuẩn bị

Hòa tan p-dimethylaminobenzaldehyde trong amyl alcohol. Thêm từ từ axit clohydric (HCI) đặc. Bảo quản ở 4 °C. Để thử indol, thêm từ 0,2 ml đến 0,3 ml thuốc thử đã chuẩn bị vào 5 ml chủng cấy vi khuẩn trong canh thang trypton 24 h. Phản ứng dương tính indol nếu có màu đỏ sẫm trên lớp bề mặt.

A.27  Các thuốc thử Voges-Proskauer (VP)

A.27.1  Thành phần

Dung dịch 1:

...

...

...

alpha-Naphthol

5 g

Etanol (tuyệt đối)

100 ml

Dung dịch 2:

Kali hydroxit

40 g

Nước cất đến

...

...

...

A.27.2  Chuẩn bị

Phép thử Voges-Proskauer (VP). Ở nhiệt độ phòng, chuyển 1 ml chủng cấy 48 h vào ống nghiệm và thêm 0,6 ml dung dịch 1 và 0,2 ml dung dịch 2. Lắc sau khi thêm mỗi dung dịch. Để tăng cường độ và tốc độ phản ứng, thêm vài tinh thể creatin vào hỗn hợp. Đọc kết quả 4 h sau khi thêm các thuốc thử. Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu hồng eosin.

A.28  Dung dịch kali hydroxit, 40 % (khối lượng/thể tích)

Kali hydroxit (KOH)

40 g

Nước cất vừa đủ

100 ml

A.29  Nước muối vô trùng, 0,85 %

A.29.1  Thành phần

...

...

...

8,5 g

Nước cất

1 lít

A.29.2  Chuẩn bị

Hòa tan 8,5 g natri clorua trong nước. Hấp áp lực 15 min ở 121 °C. Để nguội đến nhiệt độ phòng.

A.30  Nước muối formalin

A.30.1  Thành phần

Dung dịch formaldehyde (từ 36 % đến 38 %)

6 ml

...

...

...

8,5 g

Nước cất

1 lít

A.30.2  Chuẩn bị

Hòa tan 8,5 g natri clorua trong 1 lít nước cất. Hấp áp lực 15 min ở 121 °C. Để nguội đến nhiệt độ phòng. Thêm 6 ml dung dịch formaldehyde. Không hấp áp lực sau khi thêm formaldehyde.

A.31  Chất chỉ thị metyl đỏ

A.31.1  Thành phần

Metyl đỏ

0,1 g

...

...

...

300 ml

Nước cất

500 ml

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] TCVN 4829:2005 (ISO 6579:2002, Cor 1:2004) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp phát hiện Salmonella trên đĩa thạch

[2] TCVN 6404:2008 (ISO 7218:2007) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Yêu cầu chung và hướng dẫn kiểm tra vi sinh vật.

[3] TCVN 8128-1:2009 (ISO/TS 11133-1:2009) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Hướng dẫn chuẩn bị và sản xuất môi trường nuôi cấy - Phần 1: Hướng dẫn chung về đảm bảo chất lượng đối với việc chuẩn bị môi trường nuôi cấy trong phòng thử nghiệm.

[4] FDA, Bacteriological Analytical Manual, Chapter 5, Salmonella

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11039-5:2015 về Phụ gia thực phẩm - Phương pháp phân tích vi sinh vật - Phần 5: Phát hiện Salmonella